完整玻璃体切除用于玻璃体动力学分析

摘要

本实验方案的目的是展示一种有效的技术，用于从死后摘除的猪眼分离完整、完整的玻璃体核心和皮层。

摘要

作者提出了一种有效的方法，用于从死后摘除的猪眼中分离出完整、完整的玻璃体核心和皮质。尽管先前的研究已展示了此类解剖的结果，但并未详细描述具体步骤，导致领域外的研究人员难以复制其方法。其他研究通常通过抽吸方式获取玻璃体，这种方法无法保持玻璃体的结构解剖特征，或通过部分解剖仅分离玻璃体核心。所提出的方法能够在维持玻璃体解剖结构和完整性的前提下，完整分离整个玻璃体，包括玻璃体核心和皮质。该方法首先在摘除的猪眼上制作一个全层巩膜瓣，通过该瓣可将脉络膜组织与巩膜分离；随后扩大巩膜瓣，并将脉络膜完全从巩膜上剥离；最后将脉络膜-视网膜组织从玻璃体上剥离，从而获得一个完整且独立的玻璃体。该玻璃体解剖技术可用于研究玻璃体的物理特性，尤其在涉及药物递送、玻璃体-视网膜氧传输以及眼内对流的实验研究中具有重要意义。

引言

本方法的目的是详细描述一种从尸体眼球中分离出完整玻璃体（包括玻璃体核心和皮质）的技术，以用于玻璃体动力学分析。随着玻璃体生理学领域的发展，流体力学等多学科研究人员正在研究玻璃体的物理和生物力学特性¹。为此，详细阐述一种能够分离完整玻璃体的技术，对于支持多学科研究至关重要。

Sebag 等² 及其他研究者³ 对人尸体眼球进行了精细的完整玻璃体解剖，并展示了结果示意图。然而，该技术并未被详细描述，非专业人员无法独立重复该方法。其他研究采用较简单的方法（如抽吸或部分解剖）从尸体眼球中获取玻璃体，但这些方法均无法获得完整、无损的玻璃体结构。Gisladottis 等⁴ 和 Xu 等⁵ 研究了从尸体眼球中获取的玻璃体液的通透性。然而，由于未描述玻璃体提取方法，推测其采用注射器抽吸玻璃体液。Watts 等⁶ 更进一步，描述了一种通过手术技术分离兔玻璃体液的方法。但该方法仅能分离出玻璃体核心部分，无法获得玻璃体皮质。随后，Skeie 等⁷ 将玻璃体划分为四个独特区域，并精细地描述了一种可分别解剖各部分用于分析的方法。然而，该技术同样无法获得整体完整的玻璃体结构。

本技术旨在促进目前仅能在尸体眼上进行的生物物理实验。如上所述，以往的方法存在局限性，原因在于：1）没有一种方法能够完全分离出完整的玻璃体；2）所获取的玻璃体核心与皮质组织被均质化处理；3）玻璃体的解剖结构无法保持完整；或 4）解剖技术描述不够详尽，难以供其他领域的研究人员重复操作。此外，由于巩膜和脉络膜不透明，完整眼球中玻璃体的可视化程度受限，这限制了在完整眼球内部进行测量的精确性和可行性。同时，玻璃体周围解剖结构的存在也可能干扰对玻璃体生化及物理特性的研究。

近年来，玻璃体科学的研究取得了巨大进展，有理由相信整个玻璃体具有与其各个部分不同的特性。目前对玻璃体的物理、生物力学和化学性质的研究兴趣日益增长，这些研究属于玻璃体动力学（vitreodynamics）领域，其在临床医学中具有诸多应用，例如药物递送、玻璃体内氧合⁸以及玻璃体切除术。药理学玻璃体动力学利用药物制剂调控玻璃体，可用于改善玻璃体切除术的手术效果⁹。玻璃体的生物力学特性可用于建立玻璃体液流模型，从而改进玻璃体内药物递送技术^10–12。玻璃体不同区域的物理特性对于理解玻璃体-视网膜间的氧气传输至关重要¹³。本文提出的玻璃体解剖技术可用于研究完整玻璃体的多种特性，使在实验台上对完整、未受损的玻璃体进行操作成为可能，并实现更佳的可视化效果。

总之，目前研究玻璃体的方法要么描述不够充分，要么导致玻璃体核心与皮质的分离不完全。因此，有必要在保持尸体眼球中玻璃体解剖结构的前提下，在透明的眼球模型中进行实验。

方案

所有去核的眼球均取自屠宰场，所有实验均按照机构生物安全法规进行。

1. 将去核的眼球固定在表面上。通过将组织针穿过眼球周围的多余组织，并将其固定在泡沫板上来实现。
2. 解剖并分离角膜缘周围的结膜与眼球。
   1. 使用精细镊子（0.3 镊子）和显微剪刀（Westcott 剪刀）在角膜缘处切开结膜，并钝性分离结膜与巩膜。随着钝性分离的进行，沿角膜缘剪开结膜，以利于进一步分离操作。
   2. 完整剥离眼球周围360度的结膜，以暴露尽可能多的巩膜。
      注意：在后续操作中，保留少量结膜有助于使用手术针或镊子固定眼球。
3. 沿眼球一侧制作全层巩膜瓣（使用69号手术刀片）。
   1. 在距角膜缘后方3 mm处，与角膜缘平行，用手术刀（刀片11号）轻轻切开巩膜，形成约5 mm的巩膜切口，直至可见深色素的脉络膜。注意避免切破脉络膜本身。
   2. 沿巩膜与脉络膜之间的平面仔细解剖，可使用剪刀（采用钝性分离）或手术刀，直至能够通过轻柔地向内推动脉络膜来扩大这两层组织之间的潜在间隙。
   3. 用锐利的显微剪刀在第一条巩膜切口的垂直方向再做一个巩膜切口，形成T形切口。
   4. 然后继续以钝性方式环形解剖，将巩膜组织从其下方的脉络膜上剥离，并如上所述轻轻将脉络膜从巩膜上推开。
   5. 根据需要扩大巩膜瓣。
      1. 在整个过程中，轻柔地钝性分离脉络膜与巩膜。
      2. 扩大皮瓣，直至垂直于角膜缘的切口到达视神经，且平行于角膜缘的切口至少达到眼球周长的三分之一（45°）。
      3. 利用巩膜瓣作为钝性分离过程中操控眼球的杠杆支点。对巩膜瓣施加反向牵引有助于更顺利地进行钝性分离。
   6. 在另一侧巩膜瓣上重复上一步骤。
4. 剪除巩膜瓣以暴露大范围的脉络膜。
5. 继续沿眼球的周长（360度）延伸第3步中所做的切口。
6. 移除剩余的脉络膜-视网膜组织。
   1. 在暴露区域，使用棉签轻轻刷去残留的脉络膜-视网膜组织。或者，用镊子轻轻夹住组织，将其从下方的玻璃体上剥离。
   2. 如有必要，从视神经开始在脉络膜上做切口，然后轻轻剥离脉络膜以暴露视网膜和玻璃体皮层。
7. 继续钝性分离脉络膜与巩膜，然后剥离脉络膜，以获取完整无损的玻璃体。
8. 利用附着在角膜上的巩膜缘将整个玻璃体定位至所需位置。此时，玻璃体仍附着于前部巩膜和晶状体。
9. 钝性解剖分离玻璃体与巩膜内壁，环绕晶状体，彻底去除所有巩膜组织。
10. 如有必要，使用钝器将晶状体从玻璃体中分离。将样品用于各种玻璃体动力学实验。
    1. 将样品置于已知暴露表面积的玻璃烧杯中。将氧敏感探头放置在样品边缘处。使用显微操作器将探头移动至样品内部已知距离（r）处。
    2. 利用菲克扩散定律推导理论扩散方程。根据步骤10.1中收集的数据，计算实验扩散系数/反应项 等等。

结果

按照该方案操作可成功分离出保持完整核心和皮质的玻璃体（图3）。这一点可通过附着在玻璃体皮质上的残留视网膜碎片得到证实。完整的全玻璃体可用于多种特定的玻璃体动力学实验。在本研究中，我们测定了完整玻璃体中氧气的扩散速率及其相应的时间常数（图2）。采用本方法分离得到的玻璃体（包含核心和皮质）被置于已知暴露表面积的玻璃烧杯中，并与先前已发表方法所获取的仅含玻璃体核心的样本进行比较⁶。实验组与对照组之间的其他所有因素均保持一致。玻璃体表面暴露于空气中，空气中的氧张力已知（约160 mmHg），而玻璃体内部的氧张力较低（<10 mmHg）。根据Shui 等¹⁴测定的凝胶状态下玻璃体的耗氧速率，可应用一维氧气传输方程（稳态或非稳态形式）。通过测量距玻璃体表面已知距离处的氧张力，可实验验证其扩散系数。氧张力使用Oxford等类型的氧探针进行记录，误差率为±10%。每30秒采集一次数据。玻璃体皮质的存在会影响氧气向玻璃体中部扩散的速率。当存在玻璃体皮质时，氧气扩散所需的时间更长。

讨论

在玻璃体解剖过程中，有两个关键步骤必须谨慎操作。第3步，即制作全层巩膜瓣，对整个解剖过程至关重要。制作全层巩膜瓣时应小心，避免切穿脉络膜。另一个关键步骤是将巩膜从脉络膜上仔细剥离。此步骤必须谨慎进行，以防止在脉络膜上产生多个孔洞，导致玻璃体溢出。有一种方法可以对方案进行修改，同时仍能完整地解剖出整个玻璃体。可将第6步延迟至第8步进行，即在玻璃体组织被放置到目标位置后，再移除脉络膜。

该方法的局限性在于，在解剖过程中，仅能依靠视觉线索来判断完整玻璃体解剖是否成功和准确。由于玻璃体核心与皮质均为透明结构，肉眼无法区分，因此操作具有挑战性。通过观察视网膜是否粘附于玻璃体，可判断玻璃体皮质是否已成功分离。否则，可使用药物物质（如曲安奈德）以增强玻璃体的可视化¹⁵，但这些物质仍难以明确区分玻璃体皮质与玻璃体核心。该技术的另一局限性在于，其最适用于凝胶状玻璃体的解剖。人眼玻璃体凝胶是一种不可再生组织，会随年龄增长发生液化。这种液化现象使我们无法将完整的、未破损的玻璃体从眼球中完全解剖出来。因此，本技术仅适用于玻璃体仍处于凝胶状态的动物（如牛、猪或兔）或年轻个体的眼球，这些...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 镊子	Storz Opthalmics	E1793
Westcott 肌腱剪，弯头，右侧	Storz Opthalmics	E3320 R
3 号手术刀柄	VWR	25607-947
手术刀片，#11，适用于 #3 刀柄	VWR	470174-844