彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

摘要

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。

摘要

高等真核生物的生存离不开氧气；然而，矛盾的是，氧气对它们也可能具有危害性。氧分子在化学上相对惰性，因为其两个未成对电子位于不同的π*反键轨道中。这两个电子具有平行自旋，即它们围绕自身轴以相同方向旋转。这正是氧分子反应性较低的原因。氧的活化可通过两种不同机制发生：一是通过逐个电子的还原（单价还原），二是通过吸收足够能量使其中一个未成对电子的自旋方向发生逆转。这些过程会导致活性氧物种（ROS）的产生。人体在生理状态下有多种方式可清除活性氧。当活性氧的产生超过机体的修复能力时，就会引发氧化应激，进而损伤多种分子。目前有多种方法可用于检测氧化应激。本文重点介绍其中一种名为细胞凝胶电泳的方法，也称为“彗星试验”，该方法可用于测量DNA断裂。如果除氧化应激外所有已知导致DNA损伤的因素均保持恒定，则彗星试验所测得的DNA损伤程度是评估氧化应激水平的良好参数。该方法的原理十分简单，基于DNA分子带负电荷这一事实。完整的DNA分子体积较大，在电泳过程中不会发生迁移。然而，一旦存在DNA断裂，就会形成较小的片段，这些片段可在电场作用下向阳极移动，且片段越小迁移速度越快。由于片段大小不一，电泳最终结果并非一条清晰的条带，而是呈现为类似彗星形状的连续分布。该系统可对所产生的“彗星”图像进行定量分析，从而实现对细胞内DNA断裂程度的量化。

引言

彗星试验最初由瑞典科学家Ostling和Johanson建立¹。DNA是一种带负电荷的分子。在电泳过程中，较小的、受损的DNA片段会更快地向带正电的阳极迁移²。DNA片段越小，向阳极迁移的速度越快，从而形成典型的“彗星”图像，其中“头部”由完整且未受损的DNA组成，而“尾巴”则由受损的DNA片段构成³。体内存在多种机制可修复受损的DNA⁴，这些机制使DNA断裂的产生保持相对平衡⁵。然而，如果这种平衡倾向于DNA断裂，则断裂可能不断积累，最终导致疾病的发生。

在特定时间点，我们的DNA大约有0.000165%受到损伤⁶。单链DNA断裂是指DNA双螺旋结构中其中一条链出现缺陷，而双链DNA断裂则是指DNA双螺旋的两条链均受到损伤。多种因素可能在特定时间点增加DNA断裂的数量，例如细胞年龄、香烟烟雾、多种药物或氧化应激^7-9。如果导致DNA断裂增加的所有因素均保持恒定，则通过彗星实验对DNA断裂进行定量是一种评估氧化应激的良好间接指标。

彗星试验方法如今在医学领域（包括眼科学）中的应用日益广泛。其中一个原因是，氧化应激作为多种疾病的致病机制正受到越来越多的关注^8-11，而彗星试验正是可间接定量检测氧化应激的方法之一。

方案

在巴塞尔大学眼科系进行的彗星试验研究已获得巴塞尔当地伦理委员会的批准

1. 试剂的准备

1. 通过将 PBS（1 L 袋装）和 990 ml dH₂O 加入培养基中配制杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）（无 Ca++、Mg++）溶液。调节 pH 至 7.4。室温保存。
2. 配制裂解液：在 dH₂O 中加入 2.5 M NaCl（146.1 g）、100 mM EDTA（37.2 g）和 10 mM Trizma 碱（1.2 g），定容至 1,000 ml。
3. 配制电泳缓冲液（300 mM NaOH/1 mM EDTA）：加入 30 ml 10 M NaOH 和 7.5 ml 0.2 M EDTA，用 dH₂O 定容至 1,500 ml 并充分混匀。总体积取决于电泳槽容量。使用前测量缓冲液 pH，确保 pH >13。
4. 配制中和缓冲液：将 0.4 M Tris（约 800 ml dH₂O 中加入 48.5 g，调节 pH 至 7.5）用浓盐酸（>10 M HCl）调节后，用 dH₂O 定容至 1,000 ml。室温保存该溶液。
5. 配制染色液：将 10 mg 溴化乙锭（EtBr）溶于 50 ml dH₂O 中，配成 10x 储存液（20 µg/ml），室温保存。使用时取 1 ml 与 9 ml dH₂O 混合，配成 1x 工作液。注意！溴化乙锭为已知致癌物，操作时应采取充分防护措施。

2. 白细胞的分离

1. 使用静脉穿刺法采集含抗凝剂（如肝素）的人类血液样本（20 ml）。
2. 使用密度梯度细胞分离液（如Histopaque）分离淋巴细胞。
   1. 简要而言，将血液以1:1比例用PBS或RPMI（不含FBS）稀释，然后铺在600 µl细胞分离液上层。
   2. 在4 °C下以1,800 × g离心20分钟。吸取“白膜层”至3–5 ml PBS/RPMI中，并在300 × g下离心10分钟以沉淀淋巴细胞。
   3. 使用移液器从PBS（RPMI）与细胞分离液交界面上方收集淋巴细胞。从每根试管中血浆与细胞分离液层之间的界面处移除白细胞条带，并收集至一个50 ml离心管中。
3. 用冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）将总体积调至50 ml。将细胞悬液在300 × g下用DMEM洗涤三次，每次10分钟。
4. 使用血细胞计数板计数总细胞数。将细胞重悬于PBS中，并按10⁷个细胞/管分装至微量离心管中。
5. 将0.4 ml细胞悬液移入5 ml塑料一次性试管中。加入1.2 ml 40 °C的1%低凝胶温度琼脂糖，混匀后迅速将1.2 ml细胞悬液移至已预包被的载玻片的琼脂糖覆盖表面。避免产生气泡。
6. 让琼脂糖凝固约2分钟。保持凝固的时间和温度一致，并确保琼脂糖完全凝固后再浸入裂解液中。完全凝固后，将其浸入约4 ºC的裂解液中。

3. 裂解与电泳

注意：所述操作步骤适用于 pH >13 的碱性条件下进行电泳。

1. 在约 4 ºC 条件下放置至少 2 小时后，轻轻将载玻片从裂解液中取出。将载玻片并排置于水平凝胶电泳槽的一端附近，尽可能紧密地滑动放置。
2. 用新配制的 pH >13 电泳缓冲液填充缓冲液槽，直至液面完全覆盖载玻片（避免在琼脂糖上产生气泡）。
3. 让载玻片在碱性缓冲液中静置 20 分钟，以使 DNA 解链并暴露碱性不稳定损伤位点。
4. 打开电源，设置电压为 25 伏（约 0.75 V/cm），通过调节缓冲液液面高度将电流调整至 300 毫安。电泳运行 30 分钟。
5. 关闭电源。轻轻将载玻片从缓冲液中取出，放置于沥水托盘上。逐滴加入中和缓冲液，均匀覆盖载玻片表面。让载玻片静置至少 5 分钟。沥干后重复此步骤两次。
6. 用 80 µl 1x 溴化乙锭（EtBr）染色液对载玻片进行染色，染色 5 分钟后，将其浸入冷蒸馏水中以去除多余染料。随后在载玻片上加盖盖玻片，并立即保存。在室温干燥条件下可保存一个月。
   注意：也可使用其他 DNA 染料（例如，SYBR Green）。注意！大多数染料具有致突变性，操作时需佩戴防护手套。

4. DNA断裂的定量分析

1. 为了观察DNA损伤，在40倍物镜的荧光显微镜下观察经溴化乙锭（EtBr）染色的DNA载玻片。
2. 通过测量DNA迁移长度和迁移DNA所占百分比来定量评估细胞中的DNA损伤（图1A）。通过尾矩（Tail-Moment）和Olive尾矩（Olive-moment）来量化DNA损伤程度（图1B）。尾矩和Olive尾矩的定义此前已有描述^8-10。
   注意：根据我们的经验，使用其中一个参数即可。通过设置自动成像工具对显微镜载玻片进行扫描并拍摄细胞图像。DNA断裂的定量可通过图像分析软件完成。目前有多种专为此目的设计的软件包，可用于捕获细胞图像并量化DNA损伤。我们建议在整个实验过程中使用同一款软件。实验技术人员在计算机上识别出完整的细胞或彗星状细胞（comet），并用鼠标点击该细胞，软件将自动完成评分。

结果

尽管彗星实验方法能够获得可重复的结果，但其结果可能受到多种因素的影响。其中一个因素是，在裂解和凝胶电泳之前，白细胞是否经过冷冻保存，或者该步骤是否直接使用新鲜制备的白细胞进行。图2显示，在第2组中，白细胞在裂解和凝胶电泳前经过冷冻保存，其单链DNA断裂显著高于第1组，后者使用新鲜制备的细胞进行裂解和凝胶电泳。

该检测还可用于间接评估全身性氧化应激。表1显示了吸烟者与健康受试者在尾矩（Tail-moment）和橄榄矩（Olive-moment）中的描述性统计结果。数据表明，每日吸烟半包可使循环白细胞中的单链DNA断裂增加一倍以上⁹。

图1. （A）显示彗星实验分析过程中所用的显微镜。（B）Δ 示意一个典型的“彗星”结构，具有明亮的头部和尾部（尾部为受损的小片段DNA）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 与裂解和凝胶电泳前使用新鲜制备的白细胞相比，白细胞经冷冻保存（第2组）后单链DNA断裂显著增多。

表 1. 与年龄和性别匹配的健康非吸烟者相比，吸烟者的单链DNA断裂数量超过两倍。

讨论

瑞典科学家Ostling和Johanson是首次在其领域中使用彗星实验（comet assay）来定量检测细胞中DNA损伤的研究者¹。然而，这两位科学家所使用的中性条件仅能检测双链DNA断裂。随后，Singh 等 将该实验改良为在碱性条件下进行，从而获得了一种更灵敏的版本，可同时评估双链和单链DNA断裂，并能检测碱不稳定位点¹²。自最初建立以来，该实验已在多个步骤上经过改进，以适用于不同类型细胞中各种DNA损伤的评估^13-15.

与所有技术一样，严格关注技术细节对于获得准确结果至关重要¹⁶。根据我们的经验，若每一个方法学步骤——从溶液配制到彗星图像的定量分析——均由经验丰富的实验室技术人员操作，则可获得最佳结果。使用新鲜且正确配制的培养基、规范的移液技术、精确的时间控制，以及（如结果部分先前所述）使用 freshly prepared 白细胞，对于裂解和凝胶电泳获得准确结果至关重要¹⁷。

本实验中的每个单独步骤对于获得可靠结果都同样重要。¹⁶ 通常，从溶液配制到彗星图像定量的每一步操作均由经验丰富的实验技术人员完成时，可获得最佳结果。关键因素包括使用新鲜且正确配制的培养基、规范的移液技术、精确的时间控制，以及如结果部分所述，使用 freshly prepared 白细胞进行裂解和凝胶电泳，以确保实验结果的可靠性。¹⁷

与其他方法一样，彗星试验技术也有其优点和局限性。作为一种敏感的方法，该试验易受某些因素（例如，紫外线）影响，这些因素可能增加DNA断裂，从而影响结果。除正在研究的因素外，任何可能增强氧化应激的因素都应避免。应激源不仅可在白细胞中增加氧化应激水平，也可在所有其他血液成分和淋巴细胞中产生类似效应。如前所述，目前存在多种更直接的氧化应激检测方法^18,19。彗星试验是众多方法中的一种，具有一些特定优势，包括相对成本较低、所需细胞数量少（<10,000个细胞），因而每位患者所需血液样本量小、定量细胞DNA损伤所需时间相对较短（约3天）、灵敏度高，以及可广泛适用于不同类型细胞的DNA损伤评估。过去我们选择使用白细胞，是因为我们对该类细胞有操作经验，且其适用于计划开展的特定研究。彗星试验的另一优势在于，它可用于检测不同类型和程度的DNA损伤，因此除氧化应激研究外，还可应用于其他多种研究领域，如DNA修复研究、补充剂干预试验或遗传毒性研究。

目前公认氧化应激在多种疾病的发病机制中起着关键作用。彗星试验法是测量氧化应激的多种方法之一^18,19，该方法相对简单、通用且成本低廉。一旦掌握，该方法可用于所有氧化应激参与的医学研究领域^8-10,20,21。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基亚砜 (DMSO)	Qualigens	(CPW59)
乙二胺四乙酸二钠 (Disodium EDTA)	HiMedia	(RM1370)
溴化乙锭 (Ethidium Bromide)	Sigma	(E-8751)
Histopaque	Sigma	(1077-1)
磷酸盐缓冲液 (PBS) (无 Ca++, Mg++)	HiMedia	(TS1006)
氯化钠 (NaCl)	Ranbaxy Rankem	(S0160)
氢氧化钠 (NaOH)	BDH-Merck	(89021)
Triton X-100	HiMedia	(RM 845)
Trizma Base	Spectrochem
凝胶电泳所需材料
普通熔点琼脂糖 (NMA)	HiMedia	(RM273)
低熔点琼脂糖 (LMPA)	Sigma	(A9414)
甲醇 - Qualigens
盖玻片 (No. 1, 24 x 60 mm)	Blue Star
微量离心管	Tarsons	(500010)
移液器及吸头	Tarsons
显微镜载玻片，常规 / 微型凝胶电泳 (MGE) 载玻片