暴露于有毒化学物质后内皮细胞迁移能力的评估

摘要

研究早期内皮细胞（EEC）迁移对于理解某些疾病的病理生理机制以及潜在发现新的治疗干预策略具有重要意义。以下方案描述了已针对EEC研究进行优化的细胞迁移评估技术。

摘要

接触化学物质（包括烷基化化学战剂，如硫芥和氮芥）会导致多种临床症状，包括伤口愈合障碍。伤口愈合的生理过程极为复杂。在此过程中，肉芽组织的形成是关键步骤，可实现初步伤口闭合，并提供由新生毛细血管组成的新血管网络——这一过程通过血管发生（新血管形成）或血管生成（现有血管出芽）实现。血管发生和血管生成均依赖于内皮细胞的功能性定向迁移。因此，研究早期内皮细胞（EEC）的迁移对于理解化学物质诱发的伤口愈合障碍的病理生理机制，并可能发现新的治疗干预策略具有重要意义。

我们评估了烷化剂暴露后伤口愈合受损的情况，并测试了潜在候选化合物的治疗效果。本研究采用了一套在此方案中概述的技术。文中描述了一种改良的Boyden小室法，用于定量研究子宫内膜上皮细胞（EEC）的趋化运动。此外，还展示了将伤口愈合实验与轨迹分析相结合，用于定性评估细胞迁移的方法。最后，我们演示了使用荧光染料TMRM检测线粒体膜电位，以揭示细胞迁移障碍的潜在机制。以下方案描述了为研究EEC而改进的一系列基本技术。

引言

细胞迁移在多种生理和病理生理过程中具有重要作用，包括发育、多种疾病以及皮肤损伤后的伤口愈合。

皮肤损伤后，炎症反应可清除受损或坏死的组织，而肉芽组织形成则促进伤口的初步闭合，并通过血管发生（新血管形成）或血管生成（已有血管出芽）形成新的毛细血管网络^1-3。血管发生和血管生成均依赖于内皮细胞的迁移。不断生长的血管网络对于向增殖的角质形成细胞输送氧气和营养物质至关重要，这些角质形成细胞最终经历角化，形成新的上皮层，实现伤口闭合。

内皮细胞迁移功能受损是伤口愈合障碍的根本原因之一^4,5。因此，有必要建立评估早期内皮细胞迁移的方法，以探究细胞迁移障碍的病理生理机制，并寻找新的治疗干预策略。

皮肤接触烷化剂（例如，硫芥和氮芥）可导致伤口愈合障碍⁶。这类化合物曾在20世纪的多次冲突中被用作化学战剂，且由于在政治不稳定的地区仍存有大量库存，加之其合成相对简单，至今仍令人高度担忧。尽管硫芥最早于1822年被合成，但硫芥暴露的分子机制和临床病理尚未被充分阐明，目前也尚未发现针对硫芥暴露的有效解毒剂。

已有若干研究致力于理解并建立芥子气（SM）暴露后伤口愈合受损的模型，并筛选可能逆转该效应的候选化合物。Schmidt et al.....

方案

以下方案描述了早期内皮细胞迁移研究的技术。血管内皮细胞的正确培养需要预先用明胶包被细胞培养瓶，以确保细胞正常增殖并维持内皮表型。

1. 细胞培养瓶的预包被

1. 将明胶溶于0.1 M PBS中，终浓度为0.1%。
2. 使用液体灭菌参数对溶液进行高压灭菌（具体参数详见所用高压灭菌器的操作说明）。
3. 加入足量的已灭菌明胶溶液至无菌细胞培养瓶中例如， 至少5 ml用于T25细胞培养瓶。
4. 将培养瓶转移至培养箱中（37°C，5% CO₂）₂ 不需要，但即使存在也不会产生干扰）至少 30 分钟。
5. 移除剩余的明胶溶液。随后使用预先包被的培养瓶（参见细胞培养）或在无菌条件下保存至使用。

2. 早期内皮细胞的细胞培养

注意：如先前所述^10,11，通过磁激活细胞分选法从分化的小鼠拟胚体中分离出胚胎干细胞来源的早期内皮细胞（EEC），即PECAM-1阳性细胞组分。

1. 将 EEC 在明胶包被的细胞培养皿中培养于添加了 15% 胎牛血清（FCS）、50 U/ml 青霉素、50 U/ml 链霉素、200 µM L-谷氨酰胺、100 µM ß-巯基乙醇和 1% 非必需氨基酸的 DMEM 培养基中。操作过程需在....

结果

皮肤接触烷化剂会引起红斑、水疱形成以及皮肤溃疡，这些症状与伤口愈合障碍相关。伤口愈合需要血管生成和血管形成过程，而这些过程依赖于内皮细胞的迁移。可通过Boyden小室实验对细胞迁移能力进行定量评估。如图1C所示，内皮细胞（EEC）暴露于烷化剂苯丁酸氮芥后，其细胞迁移能力显著下降⁹。在接触苯丁酸氮芥后立即加入活性氧清除剂α-亚麻酸（ALA）处理24小时，可显著恢复该表型，几乎达到对照组水平。

Boyden小室实验是评估迁移细胞数量的合适工具。然而，该实验无法提供有关细胞迁移行为的信息。图2表明，未暴露于药物的EEC在划痕愈合实验中能够在24小时内闭合伤口间隙⁹。相比之下，暴露于烷化剂苯丁酸氮芥的EEC则无法在划痕愈合实验中闭合伤口间隙⁹。此外，对单个EEC的轨迹追踪显示，在苯丁酸氮芥作用下未观察到定向移动⁹。使用活性氧清除剂处理EEC后，可恢复其定向迁移能力⁹。

讨论

皮肤接触有毒化学物质常导致严重的伤口愈合障碍，其潜在机制在很大程度上尚不清楚。伤口愈合是一个复杂的过程，包含多个阶段（止血、炎症、增殖和重塑）。细胞迁移参与了各个阶段，但在肉芽组织形成过程中尤为重要。在此过程中，新血管通过血管发生或血管新生形成。

这两个过程均需要前体细胞和早期内皮细胞的正常迁移。评估细胞迁移能力并阐明细胞迁移受阻的潜在机制，对于开发针对毒性物质诱导的伤口愈合障碍的新治疗策略具有重要意义。

细胞迁移能力可通过多种方法进行评估。一种常用的技术是Boyden小室实验，该方法最初用于分析抗体-抗原介导的白细胞趋化作用¹³。该实验是一种定量终点检测方法，用于反映细胞在趋化因子刺激下从Transwell小室上层隔室迁移至下层隔室的侵袭能力。在本研究所描述的技术中，下层小室未添加任何趋化因子。因此，本实验旨在研究在对照条件下或氯苯丁酸处理下子宫内膜癌细胞（EEC）的趋化运动（即无特定趋化因子诱导的随机迁移）。

插入物包含一个多孔膜，可允许细胞通过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
博伊登小室
Corning FluoroBlok 组织培养（TC）处理的嵌插培养板，24 孔 - 3 µm	康宁公司	#351151
Corning FluoroBlok 组织培养（TC）处理的24孔插入式培养小室，孔径8 μm µm	生命科学	#351152
（与Falcon Insert 24孔配套培养板（353504）配合使用）
伤口  划痕愈合实验
玻璃底培养皿	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
线粒体膜电位评估
TMRM（四甲基罗丹明甲酯）	Life Technologies	#T669
细胞培养
Accutase	PAA，奥地利帕兴	# L11-007
α-亚麻酸	Fluka (Sigma)，德国施泰因海姆	L2376
苯丁酸氮芥	Fluka (Sigma)，德国施泰因海姆	# 23125
明胶	Sigma-Aldrich，德国施泰因海姆	# G2500-100G