需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

9.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52784

⸱

2015年5月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。

摘要

泛素-蛋白酶体系统最近被发现与多种病理过程相关，包括神经退行性疾病和癌症。鉴于这一情况，研究该系统调控机制的技术对于阐明上述疾病的细胞和分子过程至关重要。本文所述使用来源于血凝素的泛素探针，为研究该系统提供了一种有价值的工具。本文详细介绍了一种方法，使研究者能够开展实验，直接可视化去泛素化酶的活性。去泛素化酶调控蛋白酶体降解过程，其活性位点具有功能同源性，这使得研究者可在一次实验中同时检测多种酶的活性。通过温和的机械方法裂解细胞获得裂解液，并与靶向活性位点的探针共同孵育。具有功能活性的酶会被探针标记，而无活性的酶则保持未结合状态。通过该实验，研究者可快速、简便地获得多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平的信息。目前的方法相较于针对人类细胞中预计存在的约一百种去泛素化酶逐一使用特异性抗体的方法，效率显著提高。

引言

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是哺乳动物细胞中主要的降解通路之一。靶向蛋白酶体进行降解的底物会被共价连接上泛素（Ub）多聚链标记1。在靶向底物进入蛋白酶体降解之前，必须去除多泛素标签。一类被称为去泛素化酶（DUBs）的酶负责泛素分子的切除与回收2。根据人类基因组预测，细胞中存在近一百种DUBs3。由于数量众多的DUBs调控着泛素介导的细胞过程，对这些酶的研究具有挑战性，因为mRNA技术无法提供活性信息，而蛋白质印迹（western blotting）仅能提供表达水平的信息。

使用带有流感病毒血凝素（HA）标签的泛素（Ub）衍生活性位点定向探针，可实现对功能性去泛素化酶（DUBs）的共价修饰，从而在蛋白质印迹实验中直接可视化这些酶的活性4。该探针具有一个C端硫醇反应基团，可作为活性位点半胱氨酸残基的自杀性底物5。利用这些探针，可以在细胞的病理和生理状态下，研究多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平。

DUB 活性的改变与多种病理状态相关，例如帕金森病、阿尔茨海默病、贫血以及多种癌症6-10。该技术为疾病研究提供了强有力的工具。在本文中，我们展示了该技术在使用玻璃珠裂解的 HeLa 和 M17 细胞中的应用。此外，我们还概述了如何在小鼠脊髓组织样本中使用该方法。通过该技术获得的信息可作为识别治疗靶点以及建立不同疾病状态研究模型的起点。该技术的真正优势在于其能够在单次检测中提供多种 DUB 的信息。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 裂解缓冲液的配制

  1. 将蔗糖溶解于去离子水（DI水）中，配制成2 M的储备液。使用真空驱动的0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜过滤2 M蔗糖溶液。
  2. 将二硫苏糖醇（DTT）溶解于去离子水中，配制成500 mM的储备液，并在厌氧条件下保存。将氯化镁（MgCl2）溶解于去离子水中，配制成100 mM的储备液。将三磷酸腺苷（ATP）二钠水合物溶解于去离子水中，配制成50 mM的储备液。
  3. 将Trizma盐酸盐溶解于去离子水中，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4，配制pH为7.4的Tris溶液。
  4. 将上述储备液按一定比例加入去离子水中，配制成裂解缓冲液，其中含250 mM蔗糖、1 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和50 mM Tris。例如，取535.3 µl Tris溶液、500 µl MgCl2溶液、1.25 ml蔗糖溶液、20 µl DTT溶液、200 µl ATP溶液以及7.4947 ml去离子水，混合后定容至10 ml，即可得到10 ml裂解缓冲液。该缓冲液可用于约20次实验。

2. 实验用细胞的培养

  1. 将 DMEM 加 10% 胎牛血清（FBS）分装至 50 ml 锥形管中，每管 30 ml，制备培养基。
  2. 将冻存的 M17 或 HeLa 细胞从液氮中取出，放入盛有温水的小烧杯中进行解冻。
  3. 将细胞转移至 50 ml 锥形管中。首先向细胞冻存管中加入少量培养基，然后在解冻后 5 秒内将重悬的细胞转移至锥形管。
  4. 将细胞悬液在 450 × g 下离心 5 分钟，以获得细胞沉淀。同时，向 T75 培养瓶中加入 20 ml 培养基。
  5. 用吸液法去除细胞沉淀中的上清液，向沉淀中加入 5 ml 新鲜培养基并重悬细胞。
  6. 将 5 ml 细胞悬液转移至含有 20 ml 培养基的 T75 培养瓶中，于 37 °C 培养。每 3 天更换一次培养基。

3. 细胞收获

  1. 用吸液法去除培养基，注意不要触碰细胞。
  2. 用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后用吸液法去除 PBS。
  3. 向 T75 培养瓶中加入 3 ml 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育 3 分钟。
  4. 向培养瓶中加入 6 ml 新鲜培养基，重悬细胞。
  5. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形离心管中，在 290 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 弃去上清液，加入 5 ml PBS。轻轻敲击管底以充分分散细胞沉淀，然后在 290 × g 条件下离心 5 分钟。
  7. 重复步骤 3.6 三次。
  8. 去除 PBS，将细胞重悬于 1 ml 新鲜 PBS 中，转移至 Eppendorf 管（1.5 ml），在 290 × g 条件下离心 5 分钟。

4. 细胞裂解

  1. 使用移液器测量沉淀物的近似体积，并按质量与体积比1:1称取玻璃珠。加入相当于沉淀物体积两倍的裂解缓冲液。
    注意：先加入缓冲液，再加入玻璃珠。
  2. 在4 °C下，将Eppendorf管中的细胞置于冷室中，以最大振荡速度涡旋振荡30分钟，进行细胞裂解。
  3. 在200 × g下短暂离心30秒，使玻璃珠沉降。收集上清液。
  4. 向上述上清液中加入与之前等体积的玻璃珠。
  5. 再次在4 °C下以最大振荡速度涡旋振荡30分钟。
  6. 在200 × g下短暂离心30秒，使玻璃珠沉降。收集上清液。
  7. 在5,030 × g下离心5分钟，以去除细胞核、膜成分及未破碎的细胞。收集上清液，即为细胞裂解物。

5. 组织匀浆化

  1. 按质量：体积比1:9将小鼠脊髓组织加入裂解缓冲液中配制成溶液。
    注意：该方法适用于多种不同的组织样本。
  2. 使用匀浆器在2级转速下匀浆30秒，确保无组织块残留。
  3. 在5,030 × g离心3分钟，以去除细胞核、膜成分和未破碎的细胞。
  4. 收集上清液，即为裂解物。

6. 样品衍生化

  1. 使用 Pierce BCA 蛋白检测试剂盒说明书指定的比色 96 孔板读板仪，通过二辛可宁酸（BCA）法在 96 孔板中分析测定组织裂解液的蛋白浓度。
  2. 用去离子水（DI 水）将相当于 20 µg 总蛋白的等分试样调整至 50 µl。
  3. 向溶液中加入 2 µl 浓度为 1.35 µM 的 HA-Ub-乙烯基砜（VS），在 37 °C 下孵育 1 小时。最终反应体系中，20 µg 裂解液对应的探针浓度为 50 nM。该浓度具有显著的摩尔过量，以确保功能性去泛素化酶（DUBs）被充分标记。
  4. 将样品在 Laemmli 上样缓冲液中于 95 °C 孵育 5 分钟。对于 52 µl 的反应体积，使用 26 µl 的 2x 上样缓冲液、13 µl 的 4x 上样缓冲液或 8.87 µl 的 6x 上样缓冲液。
  5. 上样前将样品置于冰上冷却。

7. 蛋白质印迹

  1. 将40 µl制备好的样品加入12孔4-20% Tris-甘氨酸凝胶中
  2. 以95 V电压电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部
  3. 将凝胶中的蛋白在4°C下过夜转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上
  4. 将膜置于氨基黑染色液中孵育，并对膜进行扫描，以获得显示每条泳道蛋白量的图像
  5. 脱色后，将膜在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中于室温孵育1小时，进行封闭
  6. 将膜与一抗HA抗体在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中孵育，抗体稀释比例为1:10,000，可选择在4°C孵育过夜或室温孵育4小时
  7. 用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟
  8. 将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（鼠源）在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中孵育，稀释比例为1:10,000，孵育时间至少2小时
  9. 用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟
  10. 用PBS缓冲液洗涤膜1次，持续5分钟
  11. 将膜与化学发光检测试剂孵育10分钟，并使用化学发光检测仪进行信号检测，检测时采用仪器的自动曝光模式

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用本方案中所述方法（3. 细胞收获）收集培养的 M17 和 HeLa 细胞，并获取小鼠脊髓组织。将细胞沉淀或脊髓组织置于含有试剂制备部分所述裂解缓冲液的离心管中。使用玻璃珠对细胞沉淀进行裂解（图 1A），使用匀浆器对小鼠脊髓组织样本进行匀浆处理（图 1B）。裂解或匀浆后，将样品在 5,030 ×g 条件下离心，以去除玻璃珠和/或未破裂的膜结构及细胞器（图 2）。这两种方法均为机械裂解方式，旨在保持酶活性。随后采用 BCA 法测定细胞中的蛋白质浓度。取 20 µg 总蛋白与 2 µl 浓度为 1.35 µM 的探针在 37 °C 下孵育 1 小时（图 3）。然后将样品置于 4× Laemmli 样品缓冲液中，在 95 °C 下孵育以终止反应。将制备好的样品上样至 4–20% 的 Tris-甘氨酸凝胶，在 95 V 条件下电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部。随后将蛋白质在 PVDF 膜上过夜转膜。使用氨基黑染色检测蛋白上样量（图 4）。该对照步骤可确保观察到的活性差异源于真...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

由于泛素化是一种基本的细胞活动，理解其调控机制可能是揭示疾病和病理过程的关键。本文报道的使用HA标签的泛素衍生活性位点定向探针，为研究泛素介导的蛋白质降解提供了一种简便且高度适用的方法。该方法比单独研究每一种去泛素化酶（DUB）更快且成本更低。

该方法通过机械方式——使用玻璃珠来实现细胞裂解。这种温和的裂解方法能够保持细胞内代谢状态的真实情况。然而，该裂解方法的主要缺点是裂解效率较低，约为60-70%。这意味着需要大量细胞才能确保裂解液浓度足以满足实验需求。应使用细胞融合度为80-90%的T75培养瓶来制备高浓度的裂解液。此外，实验中的胰酶消化步骤至关重要，因为必须使绝大多数贴壁细胞悬浮于溶液中。在将细胞转移至50 ml离心管前，需在显微镜下检查培养瓶，确保培养物中有大量细胞处于悬浮状态。若贴壁细胞未充分消化，将导致细胞沉淀量减少，进而使裂解液产量降低且浓度不足。不立即使用的裂解液应保存在-80 °C，使用前24小时转移至-20 °C，并在使用当天置于冰上解冻。这样可使裂解液均匀缓慢解冻，避免因快速解冻对酶活性造成损伤。

将该...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢明尼苏达大学的Lee实验室提供了所使用的小鼠脊髓组织样本。本研究由美国国防部卵巢癌研究项目（OCRP）OC093424（资助MB）、Randy Shaver癌症研究与社区基金（资助MB）以及明尼苏达卵巢癌联盟（MOCA）（资助MB）提供支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PowerGen 125（匀浆器）Fischer Scientific14-261-02P
真空驱动滤器，0.22 µmBPV2210
酸洗玻璃珠，≤106 µm（约140目美国标准筛）Sigma-aldrichG4649-10G
蔗糖Fischer ScientificS6-212
DL-二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
氯化镁Sigma-AldrichM8266
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichA26209
Trizma盐酸盐Sigma-AldrichT3253
杜尔贝科改良伊格尔培养基Life Technologies11965-092
磷酸盐缓冲液Life Technologies10010-023
组织培养瓶，75 cm2，带250 ml滤杯，每箱120个CellstarT-3001-2
0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×）Life Technologies25300-054
热灭活胎牛血清Life Technologies16140-071
小鼠来源的单克隆抗HA抗体Sigma-AldrichH9658
泛素乙烯砜（HA标签）Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli SDS样品缓冲液（4×，还原型）Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA蛋白定量试剂盒Thermo Scientific23225

参考文献

  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

去泛素化酶活性HA衍生探针蛋白质印迹分析细胞裂解液制备机械细胞裂解蛋白质浓度测定化学发光检测活性位点标记酶活性谱型分析PVDF膜转印
细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。