方法文章

测量去泛素酶的活性细胞系和组织样品的方法

DOI：

10.3791/52784

⸱

2015年5月10日

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

本文内容

摘要

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目前的协议细节，用于测量功能性同源去泛素酶的活性的方法。专门探针共价修饰的酶，并允许进行检测。这种方法保存，以确定新的治疗靶点的潜力。

摘要

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泛素 - 蛋白酶体系统最近已经牵连在各种病症，包括神经变性疾病和癌症。鉴于此，技术研究本系统的调控机制是必不可少的阐明上述疾病的细胞和分子过程。使用本文中概述血凝素衍生的泛素探针作为本系统的研究的宝贵工具。本文详述的方法，使用户能够执行检测，让去泛素酶活性的直接可视化。去泛素化酶控制蛋白酶体降解，并在它们的活性位点，其允许用户进行调查多种酶的活性在一个测定共享功能同源性。裂解液是通过温和的化学细胞破碎，并获得与培养活性部位定向探头。功能酶标记探针，同时不活跃的酶保持绑定。通过运行宁该测定中，用户获得上的活性和多个去泛素酶在一个快速和容易的方式潜在表达信息。当前的方法是显著比使用单个抗体对于预测百在人类细胞去泛素酶更有效。

引言

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泛素 - 蛋白酶体系统（UPS），作为在哺乳动物细胞的主要降解途径之一。基板在蛋白酶体结合的降解共价标记的泛素（泛素）1的聚合物。前的目标衬底进入蛋白酶体进行降解，聚遍在蛋白标记必须被去除。一类称为酶去泛素（泛素化酶）的酶负责泛素分子2的去除和回收。据预测，从人类基因组中，有近百名在泛素化酶小区3工作。有了这样一个大量的泛素化酶泛素控制介导的细胞过程，研究这些酶是一种挑战，因为基因技术不给上的活动和免疫印迹信息，仅给出了表达水平的信息。

使用流感血凝素（HA）的标记，泛素衍生的活性部位定向探头允许的共价国防部官能泛素化酶并且因此ification给出了这些酶的活性对Western印迹4直接可视化。探针具有用作活性位点半胱氨酸残基5一自杀底物的C-末端硫醇反应性基团。用这些探针，能够研究细胞的两个病理和生理状态下许多泛素化酶的活性和潜在的表达。

变化DUB活性已牵涉多种病理状况，如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，贫血和多种癌症6-10。这种技术提供了一个强大的工具，疾病的研究。在本文中，我们将展示这项技术在HeLa和M17细胞已使用玻璃珠裂解的应用。此外，我们概述了如何使用此方法在小鼠脊髓组织样本。从这种技术获得的信息可以被用来作为一个起点，用于识别治疗目标以及用于不同疾病状况的研究建立的模型。这种....

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方案

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1.裂解液的制备

  1. 溶解蔗糖在去离子（DI）水，使2M的储备溶液。过滤蔗糖的使用真空从动0.22μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）过滤2M的溶液。
  2. 溶解二硫苏糖醇（DTT）在去离子水，使厌氧条件下的500mM储备溶液并储存。溶解氯化镁（MgCl 2的）在去离子水，使100mM的储备液。溶解三磷酸腺苷（ATP）的二钠水合物的去离子水，使50mM的储备溶液。
  3. 弥补在pH7.4 Tris溶液由在去离子水中溶解的Trizma盐酸盐和调节使用氢氧化钠（NaOH）的pH值。
  4. 结合的储备溶液的部分在去离子水，使裂解缓冲液为250毫米，1毫米，使MgCl 2浓度为5mM，1mM的的ATP浓度和为50mM的Tris浓度的DTT浓度的蔗糖浓度。例如，混合535.3微升三，500微升的MgCl 2，1.25毫升蔗糖，20微升的DTT，200微升ATP和7.4947毫升去离子水，使加入10ml裂解缓冲液。这可以用来大约20实验。

对于实验2培养细胞

  1. 通过等分30毫升DMEM + 10％胎牛血清（FBS）的到50毫升锥形管中作介质。
  2. 从液氮储存冷冻转让或M17 HeLa细胞的小烧杯中，用温水。
  3. 转移细胞到50ml锥形管中。首先，一些媒体加入到细胞小瓶。随后的5秒内解冻转移悬浮细胞。
  4. 离心....

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结果

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使用获得的协议（3细胞收集）的详细方法和小鼠脊髓组织培养的M17和HeLa细胞收获。将细胞沉淀/脊髓组织置于与在试剂制备部分所述裂解缓冲液的管中。细胞沉淀物用玻璃珠（ 图1A）和小鼠脊髓组织样品使用均化器（ 图1B）进行匀浆裂解。裂解或均化后，将样品然后在5030×g离心离心除去玻璃珠和/或完整的膜和细胞器（ 图2）。这两种方法是裂解的机械装置以保持酶活性。然后使用BCA法测定细胞的蛋白质浓度。 20总蛋白的微克孵育2微升1.35微米探针1小时，在37℃（ 图3）。然后将样品在4倍的Laemmli的孵育在95℃下样品缓冲液以终止反应。将制备的样品装载在4-20％tris-甘氨酸凝胶，并在95 v运行，直到离子前沿到达底部。该蛋白质过夜转移至PVDF膜上。使用氨基黑染色（ 图4）的蛋白加载量检查。该控制步骤可确保在活动的差异是由于实际细胞过程而不是不等蛋白质上样。相等蛋白量的在第一个实验中（ 图4A）中。在第二个实验中，不相等的蛋白量的由.......

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讨论

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由于泛素化是一个基本的细胞活性，了解监管机制可能是关键发掘疾病和病理过程。使用医管局标记这里报告泛素衍生的活性部位定向探头提供了一种简单，但非常适用的方法成为研究泛素介导的蛋白质降解。这种方法更快，更便宜不是单独研究泛素化酶中的每一个。

在该方法中，细胞的裂解是通过机械装置来实现 - 利用玻璃珠。这种温和的裂解方法保留代谢细胞内的画面。然而，该裂解方法的一个主要缺点是约60-70％的低效率。这意味着需要大量的细胞，以确保裂解物浓缩足够用于实验。 T75烧瓶用80 - 90％汇合的细胞层应该用于产生浓缩的溶胞产物。此外，该实验的胰蛋白酶处理步骤是关键因为大部分附着的细胞必须在溶液中悬浮。检查在显微镜下将烧瓶以确保细胞在培养一显著部转移到50ml管中之前浮动。如果未能正确地trypsinize粘附细胞将导致更小的颗粒和通过扩展少在较低浓度的溶胞产物。裂解物即在不使用应储存在-80℃，转移到使用前-20℃24小时，使用的当天在冰上解冻。这允许裂解物解冻均匀，并降低损坏从快速解冻的酶。

在应用此方法到组织中任一个杜恩斯或Polyt.......

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

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我们要感谢明尼苏达大学的李实验室提供了所用的小鼠脊髓组织样本。这项工作是由国防部卵巢癌研究计划（OCRP）OC093424以MB部的支持下，由兰迪剃须刀癌症研究和社区基金，以MB和明尼苏达卵巢癌联盟（MoCA），以MB。该资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿没有作用。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PowerGen 125（均质机）Fischer Scientific14-261-02P
真空驱动过滤器 0.22 µmBPV2210
玻璃珠，酸洗 ≤106 和微;m（~140 美筛）Sigma-aldrichG4649-10G
蔗糖Fischer ScientificS6-212
DL-二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
氯化镁Sigma-AldrichM8266
腺苷 5'-三磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichA26209
Trizma 盐酸盐Sigma-AldrichT3253
Dulbecco's 改良 Eagle MediumLife Technologies11965-092
磷酸盐缓冲盐水Life Technologies10010-023
组织培养瓶 75 cm2 w/ 过滤杯 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1x）Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
小鼠中产生的单克隆抗 HA 抗体Sigma-AldrichH9658
泛素乙烯基砜（HA 标签）Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli 的 SDS 样品缓冲液（4x，还原）Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA 蛋白ThermoScientific23225
检测试剂盒

参考文献

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  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D.

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HA PVDF

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