本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。
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本文内容
摘要
摘要
泛素-蛋白酶体系统最近被发现与多种病理过程相关，包括神经退行性疾病和癌症。鉴于这一情况，研究该系统调控机制的技术对于阐明上述疾病的细胞和分子过程至关重要。本文所述使用来源于血凝素的泛素探针，为研究该系统提供了一种有价值的工具。本文详细介绍了一种方法，使研究者能够开展实验，直接可视化去泛素化酶的活性。去泛素化酶调控蛋白酶体降解过程，其活性位点具有功能同源性，这使得研究者可在一次实验中同时检测多种酶的活性。通过温和的机械方法裂解细胞获得裂解液，并与靶向活性位点的探针共同孵育。具有功能活性的酶会被探针标记，而无活性的酶则保持未结合状态。通过该实验，研究者可快速、简便地获得多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平的信息。目前的方法相较于针对人类细胞中预计存在的约一百种去泛素化酶逐一使用特异性抗体的方法，效率显著提高。
引言
泛素-蛋白酶体系统（UPS）是哺乳动物细胞中主要的降解通路之一。靶向蛋白酶体进行降解的底物会被共价连接上泛素（Ub）多聚链标记1。在靶向底物进入蛋白酶体降解之前，必须去除多泛素标签。一类被称为去泛素化酶（DUBs）的酶负责泛素分子的切除与回收2。根据人类基因组预测，细胞中存在近一百种DUBs3。由于数量众多的DUBs调控着泛素介导的细胞过程，对这些酶的研究具有挑战性，因为mRNA技术无法提供活性信息，而蛋白质印迹（western blotting）仅能提供表达水平的信息。
使用带有流感病毒血凝素（HA）标签的泛素（Ub）衍生活性位点定向探针，可实现对功能性去泛素化酶（DUBs）的共价修饰，从而在蛋白质印迹实验中直接可视化这些酶的活性4。该探针具有一个C端硫醇反应基团，可作为活性位点半胱氨酸残基的自杀性底物5。利用这些探针，可以在细胞的病理和生理状态下，研究多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平。
DUB 活性的改变与多种病理状态相关，例如帕金森病、阿尔茨海默病、贫血以及多种癌症6-10。该技术为疾病研究提供了强有力的工具。在本文中，我们展示了该技术在使用玻璃珠裂解的 HeLa 和 M17 细胞中的应用。此外，我们还概述了如何在小鼠脊髓组织样本中使用该方法。通过该技术获得的信息可作为识别治疗靶点....
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方案
1. 裂解缓冲液的配制
- 将蔗糖溶解于去离子水（DI水）中，配制成2 M的储备液。使用真空驱动的0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜过滤2 M蔗糖溶液。
- 将二硫苏糖醇（DTT）溶解于去离子水中，配制成500 mM的储备液，并在厌氧条件下保存。将氯化镁（MgCl2）溶解于去离子水中，配制成100 mM的储备液。将三磷酸腺苷（ATP）二钠水合物溶解于去离子水中，配制成50 mM的储备液。
- 将Trizma盐酸盐溶解于去离子水中，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4，配制pH为7.4的Tris溶液。
- 将上述储备液按一定比例加入去离子水中，配制成裂解缓冲液，其中含250 mM蔗糖、1 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和50 mM Tris。例如，取535.3 µl Tris溶液、500 µl MgCl2溶液、1.25 ml蔗糖溶液、20 µl DTT溶液、200 µl ATP溶液以及7.4947 ml去离子水，混合后定容至10 ml，即可得到10 ml裂解缓冲液。该缓冲液可用于约20次实验。
2. 实验用细胞的培养
- 将 DMEM 加 10% 胎牛血清（FBS）分装至 50 ml 锥形管中，每管 30 ml，制备培养基。
- 将冻存的 M17 或 HeLa 细胞....
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结果
采用本方案中所述方法（3. 细胞收获）收集培养的 M17 和 HeLa 细胞，并获取小鼠脊髓组织。将细胞沉淀或脊髓组织置于含有试剂制备部分所述裂解缓冲液的离心管中。使用玻璃珠对细胞沉淀进行裂解（图 1A），使用匀浆器对小鼠脊髓组织样本进行匀浆处理（图 1B）。裂解或匀浆后，将样品在 5,030 ×g 条件下离心，以去除玻璃珠和/或未破裂的膜结构及细胞器（图 2）。这两种方法均为机械裂解方式，旨在保持酶活性。随后采用 BCA 法测定细胞中的蛋白质浓度。取 20 µg 总蛋白与 2 µl 浓度为 1.35 µM 的探针在 37 °C 下孵育 1 小时（图 3）。然后将样品置于 4× Laemmli 样品缓冲液中，在 95 °C 下孵育以终止反应。将制备好的样品上样至 4–20% 的 Tris-甘氨酸凝胶，在 95 V 条件下电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部。随后将蛋白质在 PVDF 膜上过夜转膜。使用氨基黑染色检测蛋白上样量（图 4）。该对照步骤可确保观察到的活性差异源于真.......
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讨论
由于泛素化是一种基本的细胞活动，理解其调控机制可能是揭示疾病和病理过程的关键。本文报道的使用HA标签的泛素衍生活性位点定向探针，为研究泛素介导的蛋白质降解提供了一种简便且高度适用的方法。该方法比单独研究每一种去泛素化酶（DUB）更快且成本更低。
该方法通过机械方式——使用玻璃珠来实现细胞裂解。这种温和的裂解方法能够保持细胞内代谢状态的真实情况。然而，该裂解方法的主要缺点是裂解效率较低，约为60-70%。这意味着需要大量细胞才能确保裂解液浓度足以满足实验需求。应使用细胞融合度为80-90%的T75培养瓶来制备高浓度的裂解液。此外，实验中的胰酶消化步骤至关重要，因为必须使绝大多数贴壁细胞悬浮于溶液中。在将细胞转移至50 ml离心管前，需在显微镜下检查培养瓶，确保培养物中有大量细胞处于悬浮状态。若贴壁细胞未充分消化，将导致细胞沉淀量减少，进而使裂解液产量降低且浓度不足。不立即使用的裂解液应保存在-80 °C，使用前24小时转移至-20 °C，并在使用当天置于冰上解冻。这样可使裂解液均匀缓慢解冻，避免因快速解冻对酶活性造成损伤。
将该.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢明尼苏达大学的Lee实验室提供了所使用的小鼠脊髓组织样本。本研究由美国国防部卵巢癌研究项目（OCRP）OC093424（资助MB）、Randy Shaver癌症研究与社区基金（资助MB）以及明尼苏达卵巢癌联盟（MOCA）（资助MB）提供支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PowerGen 125（匀浆器） | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| 真空驱动滤器，0.22 µm | BPV2210 | ||
| 酸洗玻璃珠，≤106 µm（约140目美国标准筛） | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| 蔗糖 | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Life Technologies | 11965-092 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 10010-023 | |
| 组织培养瓶，75 cm2，带250 ml滤杯，每箱120个 | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×） | Life Technologies | 25300-054 | |
| 热灭活胎牛血清 | Life Technologies | 16140-071 | |
| 小鼠来源的单克隆抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| 泛素乙烯砜（HA标签） | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli SDS样品缓冲液（4×，还原型） | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
参考文献
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D.
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重印与许可
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