研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略

摘要

胰腺癌干细胞（CSCs）可被扩增 体外 利用非贴壁依赖性球体培养技术，该技术是研究肿瘤干细胞（CSC）生物学的有力工具，可作为开发新型靶向CSC治疗策略的第一步。本文提供了胰腺CSC的扩增、分析及靶向方法。

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）包含一类具有独占性致瘤能力的癌症干细胞（CSCs），这些细胞已被证实可驱动肿瘤的发生、转移以及对放疗和化疗的耐药性。本文描述了一种在非贴壁条件下以肿瘤球形式培养原代人胰腺癌症干细胞的特定方法。细胞在无血清、非黏附条件下培养，以富集癌症干细胞，而其分化程度更高的子代细胞在单细胞接种后的初始阶段无法存活和增殖。该检测方法可用于估算肿瘤细胞群体中癌症干细胞所占的比例。所形成的肿瘤球的数量和大小（直径范围为35至250微米）均可反映培养的癌细胞群体或新鲜获取并经消化处理的肿瘤组织中所含的癌症干细胞活性。 ^1,2. 利用该检测方法，我们近期发现二甲双胍可选择性清除胰腺肿瘤干细胞（CSCs）；这一发现随后通过多能性相关基因/表面标志物表达降低以及成球能力减弱等结果得到进一步验证 体内 二甲双胍处理细胞的成瘤性。作为临床前研究的最后一步，我们对已形成肿瘤的小鼠给予二甲双胍治疗，发现其生存期显著延长。目前正在进行评估二甲双胍在胰腺导管腺癌（PDAC）患者中应用的临床研究（例如， NCT01210911、NCT01167738 和 NCT01488552）。从机制上讲，我们发现二甲双胍通过增强活性氧（ROS）的产生并降低线粒体膜电位，诱导肿瘤干细胞（CSCs）发生致命性的能量危机。相比之下，非肿瘤干细胞在二甲双胍处理后并未被清除，而是发生了可逆性的细胞周期阻滞。因此，本研究为二甲双胍在靶向肿瘤干细胞方面的潜力提供了一个成功的范例 体外 将球体形成作为筛选工具以鉴定可能靶向CSCs的化合物，但该技术将需要进一步 体外 和 体内 验证以消除假阳性发现。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的实体瘤之一。目前是第四大^th 西方社会最常见的癌症相关死亡原因，且预计其发病率将上升至第二位^nd 未来十年内最常见原因（全球每年约40万人死亡） ³诊断时，90%的患者已处于疾病晚期，其5年生存率不足5%。尽管过去50年中相关研究日益深入，这一生存率却令人遗憾地始终未见改善。 ⁴在其余可通过手术切除实现潜在“治愈”的10%患者中，有80%将在术后5年内因复发而死亡。多年来，晚期疾病的治疗标准一直是吉西他滨单药治疗，但该方案仅能带来微弱的生存获益。 ⁵. 通过添加厄洛替尼，在短期生存率方面已取得小幅改善 ⁶ 或卡培他滨 ⁷，然而生存获益仅以周为单位，中位总生存期仍约为6个月。近期，吉西他滨/nab-紫杉醇 ⁸ 以及 FOLFIRINOX 联合治疗方案 ^9,10这些疗法分别使中位生存期延长了约2个月和4个月，但毒性较高，长期生存者仍然极为罕见。尽管治疗具有改善预后的潜力，但现有治疗方案毒性强，许多患者对此无应答，或仅在总生存期上表现出微小的改善。因此，迫切需要补充现有的治疗方法，并开发新的、更可能是多模式的治疗策略。

肿瘤异质性

越来越多的证据表明，肿瘤异质性不仅局限于每个肿瘤内部不同的进化亚克隆¹¹，还受到每个亚克隆内部表型和功能异质性及可塑性的驱动¹²。所谓的癌症干细胞（CSCs）或肿瘤促进细胞，是导致克隆内异质性的关键因素^13-16。具体而言，CSCs 是一类癌细胞亚群，我们及其他研究者已在单细胞水平上提供了确凿证据，证明它们是疾病的根源，能够产生每个癌症亚克隆内的所有分化后代细胞¹⁷。更重要的是，这些细胞对于转移行为至关重要，同时也是治疗后疾病复发的重要来源，即使使用了能够有效诱导肿瘤初始退缩的相对高效药物（例如，nab-紫杉醇）亦是如此^15,18-20。需要强调的是，CSCs 并不一定代表真正的干细胞，也并非在多数情况下起源于组织干细胞，而是获得了某些干细胞的特征。其中大多数特征是通过功能定义的，例如，CSCs 具备无限的自我更新能力，使其对传统化疗具有抵抗性，并表现出更强的侵袭性，从而促进转移活性。

功能性肿瘤干细胞表型

CSCs 的功能表型基于其自我更新能力，该能力可进行检测 体外 分别通过连续成球实验和集落形成实验进行检测。更为重要的是，具有自我更新能力的肿瘤干细胞（CSCs）具备 体内 通过有限稀释法可检测的致瘤性 体内 将功能测定作为最终的功能性读出指标，最好在连续移植过程中进行，以指示独有的长期致瘤性。此外，CSC 室内存在异质性，其中存在一个独特的 CSC 亚群，具有专属形成转移的能力，而这种能力并不仅仅源于其独有的 体内 致瘤性。事实上，转移性肿瘤干细胞获得了逃逸原发性肿瘤、抵抗失巢凋亡并最终迁移至继发部位定植的能力。这些高级功能特性可通过实验进行检测。 体外 使用改良的侵袭实验以及 体内 使用转移实验。

靶向癌症干细胞

我们及其他研究者已提供令人信服的证据表明，针对已分化胰腺导管腺癌（PDAC）细胞为主的肿瘤主体的治疗，即使联合使用靶向间质的药物，若不同时结合靶向肿瘤干细胞（CSC）的策略，则对肿瘤进展及后续预后的影响十分有限^21,22。因此，鉴于CSC在疾病进展及治疗耐药中发挥的关键作用，这些细胞应被视为任何新型治疗策略中不可或缺的核心组成部分^18,20，但这需要对CSC的调控机制有更为深入的理解。尽管CSC及其更分化的子代细胞在基因改变方面具有相同的遗传基础，CSC却表现出独特且由表观遗传决定的基因表达谱，这些表达谱与多能干细胞共享部分调控模块。在诱导多能干细胞（iPSC）形成过程中发挥关键作用的多数基因（如Nanog、Oct3/4、Klf4、Sox2）不仅与癌症相关，其表达通常也仅局限于CSC群体。此外，通过基因操作工具进行功能缺失实验，已从功能层面确证了靶向CSC的作用，从而为多种癌症类型中CSC概念的成立提供了坚实依据^23-25。尽管这些研究大多基于小鼠模型，尚难以直接转化为临床应用，但它们为在临床中联合靶向CSC与肿瘤主体细胞的潜在价值提供了概念验证。

研究癌症干细胞 体外 以识别其致命弱点

为了发现靶向CSCs的新方法及其临床应用途径，研究人员经常对其特征进行研究 体外 且成球实验在此背景下被广泛应用。该实验最初用于研究正常干细胞生物学，包括自我更新和分化能力，随后被改进用于肿瘤干细胞（CSCs）的研究。 体外 并已用于研究从胰腺导管腺癌（PDAC）中分离出的肿瘤干细胞（CSCs） ²⁰我们发现，由原代人PDAC细胞形成的肿瘤球具有CSCs的全部典型特征，因此表明其中含有 真正 胰腺 CSCs ²¹因此，肿瘤球体实验是一种用于筛选更有效疗法的强大工具 体外，但结果还需在更严格的条件下进一步评估 体内 检测。事实上，使用此方法生成的数据 体外 该检测应谨慎对待，因为其可能存在显著误差。应建立高度标准化的实验方案，包括采用自动化计数形成的球体，以确保获得可重复且具有预测性的数据。

在此背景下，我们近期利用该检测方法对来源于多种原发性人源胰腺导管腺癌（PDAC）的胰腺肿瘤干细胞（CSCs）进行了筛选，并发现这些细胞对降糖药物二甲双胍诱导的代谢重编程高度敏感。此前已有研究证实，二甲双胍可通过间接激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路，进而抑制mTOR²⁶，从而减少蛋白质合成与细胞增殖²⁷。除对肿瘤总体细胞群体的作用外，我们及其他研究团队还发现，二甲双胍能够靶向并有效清除多种实体瘤中的CSC亚群，包括乳腺癌、食管癌、胶质母细胞瘤及胰腺癌^28-31。因此，二甲双胍代表了一种具有前景且安全的新型治疗策略，可用于目前尚无有效疗法的多种癌症。此外，通过球体形成法富集CSCs后，我们发现二甲双胍对胰腺CSCs的主要作用独立于AMPK的激活，主要依赖于其轻度的线粒体毒性（通过抑制复合物I），而这种毒性似乎仅对特定CSC亚群具有致死效应。对于后者，我们可通过检测细胞耗氧量和线粒体活性氧（ROS）的产生，作为评估药物在细胞水平毒性的指标。随后，这些体外数据在临床前小鼠模型中得到了验证，确实显著延长了生存期³¹。本文所介绍的方法可快速生成CSCs的药物敏感性谱型，包括对其代谢影响的研究。现提供所用的互补性体外与体内实验流程的详细操作步骤。

方案

人源PDAC肿瘤组织通过书面知情同意书获得（西班牙马德里自治区（C.P. CNIO-CTC-11 - C.I. 11/103-E)）。将人胰腺肿瘤植入免疫缺陷小鼠需获得机构审查委员会（IRB）以及机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。异种移植胰腺肿瘤小鼠模型的操作必须遵循机构和国家相关法规（此处为西班牙马德里卡洛斯三世健康研究所伦理委员会；西班牙马德里；方案编号 PA 34_2012）。

1. 培养基

1. 配制完全培养基。
   1. 在 RPMI 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/毫升青霉素/链霉素。 500 ml RPMI 中加入 55 ml 热灭活的 FBS 和 6 ml 青霉素/链霉素（10,000 U/ml，100 倍浓缩液）。
   2. 将完全培养基置于 4 °C 保存。
2. 制备CSCs培养基。
   1. 在无血清的DMEM/F12培养基中添加100单位/毫升青霉素/链霉素和2 mM谷氨酰胺。
   2. 将CSC培养基储存在4 °C。每次实验前需在培养基中新鲜添加B27（1:50）和20 ng/ml bFGF。
      注意：已有研究表明，添加B27可促进肿瘤球的形成，并支持球体培养物的多次传代 ³²培养基的成分是关键步骤，必须针对每种培养的细胞类型进行测试。我们建议检测球体的自我更新能力和分化能力，并通过流式细胞术分析CSC标志物的表达情况。即， CD133+ 和 CD44+
3. 配制细胞外通量测定培养基。
   1. 该特定培养基为不含谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸盐和碳酸氢盐的DMEM 5030基础培养基，含有维生素、氨基酸及其他添加剂。
   2. 在当前的检测中，向培养基中添加 2 mM 谷氨酰胺、8 mM 葡萄糖和 2 mM 丙酮酸钠，以实现完全的线粒体代谢活性。
      注意：为了准确测量培养细胞的细胞外酸化，培养基中不能含有碳酸氢钠，因为含有碳酸氢盐的常规培养基会在检测过程中缓冲pH变化。此外，使用基础培养基可严格控制L-谷氨酰胺（以L-丙氨酰-谷氨酰胺形式）、葡萄糖或丙酮酸钠的浓度，以满足不同检测条件和/或应用的需求。

2. 球体形成实验与分析

注意：所有组织培养方案及操作均须采用无菌技术进行，并需格外注意使用洁净、无洗涤剂残留的无菌玻璃器皿。使用前，将所有培养基和溶液在37 °C水浴中预热（也可选择在室温下预热的培养基和溶液）。按前述方法获取人源胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤²¹。

1. 从人源PDAC中分离CSCs（图 1）
   1. 在无菌生物安全柜中，将人源PDAC组织转移至含有1 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）的60 × 15 mm培养皿中。使用无菌手术刀和镊子将肿瘤组织切碎成小块（1 - 5 mm）。
   2. 向培养皿中加入1 ml无菌1×PBS，并重复吹打操作，直至组织完全解离，通常需要3-4轮。将组织悬液（用1×PBS补足至终体积5 ml）转移至无菌离心管中，并使用组织解离仪（如gentleMACS）进行机械匀浆。
   3. 将匀浆后的组织在37 °C下用胶原酶（在1×PBS中使用2.5 mg/ml胶原酶）孵育60分钟，然后在900 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml完全培养基中。通过40 µm滤网过滤细胞悬液，并在900 × g下离心5分钟。
   4. 弃去上清液，将沉淀用5 ml红细胞裂解缓冲液（氯化铵-氯化钾，ACK）重悬，并孵育
   5. 将沉淀重悬于CSCs培养基中，接种至明胶包被的培养皿中，在37 °C孵育1小时。此步骤可去除大部分快速贴壁的成纤维细胞。
   6. 从孵育箱中取出培养皿，小心回收细胞悬液，并使用血细胞计数板定量活细胞（台盼蓝阴性细胞）数量。为此，轻轻混匀悬液，吸取20 µl悬液转移至Eppendorf管中。向微量离心管中的细胞加入20 µl（1:1比例）台盼蓝染液，充分混匀。吸取约10 µl混合液滴加至血细胞计数板上。
   7. 计数计数室四个角象限内的所有透明细胞，以获得活细胞数。注意：不同肿瘤样本之间的细胞活力和得率可能存在显著差异。PDAC样本的细胞活力通常在45%-70%之间，直径为3 - 5 mm的宏观肿瘤组织块应可获得约5×10⁶个活细胞。
2. 成球实验及二甲双胍处理
   1. 取所需数量的细胞，加入适量CSCs培养基，配制成2,000个细胞/ml的细胞浓度。细胞悬液置于冰上不得超过1小时，接种前应充分混匀。
   2. 向24孔板的第一行和最后一行各加入500 µl 1×PBS以增加湿度，有助于减少培养基蒸发。将细胞以每孔2,000个细胞的密度接种至超低吸附细胞培养板中，每孔加入1 ml肿瘤成球培养基（2,000个细胞/ml）。
      ​注意：不同肿瘤类型用于成球实验的细胞数量可能有所不同。
   3. 至少设置4个孔加入溶剂对照（阴性对照），4个孔加入每种指定处理，例如，3 mM二甲双胍。将细胞置于37 °C孵育箱中，在5% CO₂条件下培养一周。
      注意：为避免干扰肿瘤球的形成，培养期间不应更换培养基，但可每日补充生长因子，因其在培养基中不稳定。
   4. 每隔一天向各孔加入处理剂，例如，3 mM二甲双胍或溶剂对照。在培养5天和/或7天后，使用可计数较大结构的自动细胞计数仪评估形成的肿瘤球数量（图 2）。
      注意：仅计数直径不小于40 µm的肿瘤球，并可根据大小分类为小球（40 - 80 µm）或大球（80 - 120 µm）。结果可表示为形成的肿瘤球数量占初始接种细胞数的百分比（例如，2,000个细胞）。
3. 第一代肿瘤球的连续传代
   1. 孵育7天后，使用40 µm细胞滤网收集肿瘤球，并在室温下以900 × g离心5分钟。
   2. 使用胰酶将肿瘤球沉淀解离为单细胞，然后将获得的单细胞悬液按前述方法（见2.2）再次扩增培养7天。

3. 代谢分析（活性氧产生和氧气消耗）

1. 活性氧产生
   1. 在本实验方案中，我们以羧基-DCFDA为例来检测活性氧（ROS）的产生，因为该探针价格低廉、检测快速且被广泛用于ROS检测。然而，也有其他多种探针和方法可用于此检测。
   2. 按照步骤2.2所述，用二甲双胍处理肿瘤球体，作用指定时间。处理结束后，使用40 µm细胞筛过滤收集肿瘤球体，以900 × g离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于1 ml胰蛋白酶溶液中，37 °C孵育20分钟。
   3. 待细胞完全解离为单细胞后，以900 × g离心，弃上清，将细胞重悬于含2.5 μM羧基-DCFDA的HBSS缓冲液中，37 °C避光孵育20分钟。
   4. 在进行流式细胞术分析前，需将染色后的细胞避光保存，因为羧基-DCFDA可发生光氧化反应，导致假阳性结果。分析前将样品管置于冰上。
      注意：羧基-DCFDA可与多种活性氧和活性氮物种反应后产生荧光，检测通道为FL1（激发波长488 nm，发射波长520 nm）。
2. 耗氧量测定
   1. 本实验方案以Seahorse Biosciences公司的细胞外通量分析仪（Extracellular Flux Analyzer）为例进行说明。将所需细胞培养板用22.4 μg/ml的细胞与组织黏附溶液在室温下包被20分钟，接种细胞前用去离子水清洗孔板2–3次。
   2. 处理结束后，使用40 µm细胞筛过滤收集肿瘤球体，以900 × g离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于1 ml胰蛋白酶溶液中，37 °C孵育20分钟。
   3. 将解离后的单细胞以每孔30,000个细胞的密度接种于96孔板（终体积150 µl）。细胞用含8 mM葡萄糖和2 mM丙酮酸钠的耗氧检测培养基重悬。
   4. 通过低速离心将细胞沉降至孔底：将培养板置于离心机中，以逐渐升速至100 × g的条件离心，并在停止时关闭刹车。随后将板子翻转方向，重复一次该离心过程。将板子转移至37 °C、无CO₂的培养箱中孵育30分钟。
   5. 在此期间，准备检测用探针卡。每个探针孔配有4个独立的注射口（每口加样25 µl）：
      1. 注射口A：二甲双胍。为使加样后孔内终浓度达到3 mM，需配制8倍浓缩液（24 mM），因注射口A加样后总体积将为175 µl 。
      2. 注射口B：二甲双胍。为再增加3 mM，使孔内终浓度达到6 mM，需配制9倍浓缩液（27 mM），因注射口B加样后总体积将为200 µl 。
      3. 注射口C：二甲双胍。为再增加3 mM，使孔内终浓度达到9 mM，需配制10倍浓缩液（30 mM），因注射口C加样后总体积将为225 µl 。
      4. 注射口D：鱼藤酮，11 µM，加样后孔内终浓度为1 µM（11倍浓缩液）。注意：鱼藤酮可完全抑制线粒体的残余呼吸活性。
   6. 校准探针卡后将其装载至细胞培养板上，按照标准程序进行混合与检测。
   7. 以鱼藤酮所达到的线粒体呼吸抑制率设为100%，计算二甲双胍对总线粒体呼吸的抑制百分比。

4. 免疫缺陷小鼠中人胰腺癌的异种移植模型

注意：为实验准备足够数量的雌性裸鼠或其它免疫缺陷更严重的小鼠模型，如 NOD-SCID、SCID-Beige 或 NSG 小鼠³³。实验前对所有手术器械进行高压灭菌，并使其冷却至室温后再使用。对于皮下成瘤实验，每种条件至少使用 4 只小鼠，每侧 flank 接种一个肿瘤，共 8 个肿瘤。

1. 异种移植移植
   1. 从人胰腺癌组织标本中制备肿瘤组织块。将肿瘤转移至培养皿中，使用解剖刀和镊子将组织切割成小块（直径约2 mm，体积约8 mm³），并用镊子夹持组织进行操作。将获得的组织块浸入置于冰上的凝胶状蛋白混合液中。
   2. 使用1–3%异氟烷或其他吸入性或注射性麻醉剂对小鼠进行麻醉。
      注意：在开始任何外科手术前，需用眼科镊轻刺腹部皮肤或脚趾，确认小鼠已完全失去意识。涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
   3. 麻醉生效后，用含乙醇的皮肤消毒剂擦拭小鼠背部。术前给予丁丙诺啡（0.05 mg/kg 体重）以确保术后镇痛。
   4. 用镊子提起小鼠背部皮肤，使用无菌显微剪刀做0.7–1.0 cm长的切口，钝性分离形成一个小的皮下囊腔，将一块来源于患者的胰腺癌组织（约8 mm³）植入其中。
   5. 使用1–2个皮肤钉合器闭合伤口，7天后拆除。将小鼠放回笼中，并置于加热垫或加热灯下，直至其完全恢复活动能力。
   6. 肿瘤植入后，每周至少监测两次小鼠的肿瘤生长情况以及出现不适症状的一般体征，如毛发竖立、弓背姿势和活动减少。
   7. 当肿瘤平均体积达到200 mm³时，将小鼠随机分组接受相应治疗。每日通过腹腔注射（150 mg/kg 体重）或饮水给药（150 mg/kg 体重）给予溶剂对照或二甲双胍，两种给药方式的治疗效果相当。
   8. 使用游标卡尺监测肿瘤负荷，并每周计算一次肿瘤体积（肿瘤体积 = 1/2 × 长 × 宽 × 高）。
   9. 当肿瘤直径达到1 cm，或小鼠出现上述严重疼痛或疾病症状时，实施安乐死。

结果

二甲双胍选择性靶向胰腺癌干细胞

我们首先考察了二甲双胍处理对功能的影响 体外 CSCs的自我更新能力。为此，我们采用从手术切除的胰腺导管腺癌（PDAC）组织中分离得到的原代人胰腺癌细胞进行了成球实验。我们观察到，二甲双胍显著减小了所形成细胞球的体积（图1A）。这很可能是通过抑制CSC后代细胞的扩增实现的，因为尽管球体富集了CSCs，其中仍主要包含其后代细胞。事实上，球体在不传代的情况下培养时间越长，分化程度更高的后代细胞扩增就越显著。因此，我们发现二甲双胍能显著减少实际形成的球体数量，且与球体大小无关，这种减少呈剂量依赖性，提示其对CSC自我更新能力具有强烈抑制作用（数据未显示）。我们发现，3 mM的二甲双胍可显著减少所形成的球体数量（图 1B）。为了更严格地研究二甲双胍对肿瘤干细胞（CSCs）自我更新能力的长期影响，我们随后将形成的一级球体传代培养为二级和三级球体。尽管仅对一级球体进行了二甲双胍处理，但在第二和第三轮传代中，球体的形成能力显著且逐级减少，表明二甲双胍处理确实已不可逆地清除了大部分肿瘤干细胞（CSCs）图 1C因此，我们的数据表明二甲双胍对原代胰腺肿瘤干细胞的自我更新能力具有显著的治疗作用，这促使我们进一步开展机制性以及 体内 研究。

二甲双胍抑制线粒体耗氧并诱导活性氧产生

由于已有研究显示二甲双胍可通过部分抑制复合体I活性而发挥线粒体毒物作用，我们接下来考察了二甲双胍对类球体来源细胞的细胞耗氧的急性影响。为此，我们选取了两个代表性原发性胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤来源的细胞，通过依次注射3 mM二甲双胍（共三次）和1 µM鱼藤酮（一次），测定其随时间变化的耗氧量。如图所示， 图 2A，二甲双胍注射引起耗氧量迅速且呈剂量依赖性下降，不同肿瘤之间的变化差异显著。我们通过注射鱼藤酮（一种强效复合体I抑制剂，可完全抑制线粒体耗氧）来计算二甲双胍处理后的残余线粒体活性。二甲双胍对线粒体耗氧的敏感性与其诱导活性氧（ROS）生成的能力相关，后者定义为二甲双胍处理后细胞群体平均值的偏移图 2B， 左侧面板），可轻松进行定量分析（图2B， 右图所示。正如预期，对氧消耗抑制最敏感的原代细胞在二甲双胍处理后也表现出活性氧（ROS）生成最显著的增加。因此，这些代谢 体外 实验表明，二甲双胍通过抑制肿瘤干细胞对线粒体功能的依赖性，导致线粒体活性氧（ROS）产生增加，最终诱导细胞凋亡。

二甲双胍阻滞胰腺导管腺癌进展 体内

我们最终研究了二甲双胍的作用 体内 使用来自不同胰腺导管腺癌（PDAC）患者的组织异种移植模型。我们观察到，与对照组相比，接受二甲双胍治疗的小鼠肿瘤进展显著减缓，但肿瘤并未完全消失（图 3随后，在长期随访过程中，所有肿瘤最终均复发，提示在治疗早期存活下来的细胞对二甲双胍产生了耐药性。然而，即使作为单一药物使用，二甲双胍治疗仍显著延长了所有小鼠的生存期。

图 1. 二甲双胍选择性靶向肿瘤干细胞（CSCs）。（A）二甲双胍减小了类球体的尺寸。右侧图显示经指定剂量二甲双胍处理7天后获得的代表性类球体图像。左侧图为类球体尺寸的定量分析（n≥6），横轴所示数字代表各个独立肿瘤样本。（B）在有或无二甲双胍存在下培养7天后的类球体形成能力（n≥6），横轴所示数字代表各个独立肿瘤样本。（C）原代胰腺癌细胞在继代和三传代类球体中肿瘤干细胞自我更新能力的代表性图示。类球体仅在第一代形成期间接受处理，共持续7天（n = 6）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 二甲双胍处理抑制耗氧并诱导活性氧生成。（A）添加二甲双胍可抑制球体来源细胞的耗氧率（OCR）。两种不同的胰腺导管腺癌（PDAC）继代球体经二甲双胍处理后，通过细胞外通量分析检测OCR变化。使用鱼藤酮注射作为线粒体总OCR消耗的对照。横轴表示经每孔蛋白含量标准化后的耗氧速率，单位为pmol O₂/hr。 （B）在A图中使用的PDAC球体经8小时二甲双胍处理后，采用羧基-DCFDA染色并通过流式细胞术检测活性氧（ROS）的生成。左侧为代表性流式细胞术图谱；右侧为三次独立实验的数据汇总。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 二甲双胍阻滞胰腺导管腺癌进展 体内. 将两种不同的胰腺导管腺癌（PDAC）异种移植组织植入免疫缺陷小鼠体内，在确认肿瘤成功植入后开始分配治疗方案。小鼠通过饮水给予二甲双胍（Met），剂量为150 mg/kg体重（基于每日5 ml饮水消耗量）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

随着肿瘤干细胞（CSC）概念在多种肿瘤中的提出及后续验证，药物研发领域获得了新的动力，有望开发出更高效的癌症治疗方法，从而降低疾病复发的风险。然而，CSC 研究领域仍处于早期阶段，在理解 CSC 的起源与扩增机制，以及其在塑造肿瘤结构和促进转移中的作用方面，仍需取得更多进展。

在此背景下，采用可重复且具有生物学意义的肿瘤干细胞（CSC）检测方法，并对所得数据进行科学合理的解读，是推动我们深入理解CSC生物学特性的关键环节。从多种生物学角度来看，成球实验已被视为一种极为有价值的检测手段；然而，使用者应充分认识到该方法的局限性，以便正确解读实验结果。在评估成球形成数据之前，一个重要的考虑因素是所研究样本的来源，因为来源于新鲜患者样本的结果可能与来源于已建立的癌细胞系的结果存在显著差异。

经典的球体形成实验包括将细胞以克隆密度接种于超低吸附培养板中，并在表皮生长因子（EGF）和/或碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）添加但无血清的培养基中评估球体形成能力^21,34。培养基的组成也是一个需要考虑的重要因素。根据我们的经验，DMEM/F12 培养基添加 B27、bFGF 和谷氨酰胺且不含血清的条件，是用于培养、扩增并维持肿瘤干细胞（CSC）处于未分化状态的最佳培养体系。我们发现，在该培养条件（培养基及悬浮培养）下，细胞高表达肿瘤干细胞标志物（包括 CD133+、CD44+ 和 CD24+），而不表达与分化相关的蛋白（CK-20 和 CK-19）。

这些检测方法的基本假设之一是每个细胞球均为克隆来源，即 每个细胞球均由单个干细胞扩增而来。然而，细胞球本质上是动态结构，即使在较低的接种密度下也容易发生融合³⁵。细胞铺板是实验方案中的关键步骤，以每孔一个细胞的密度接种固然可以避免细胞聚集问题。但对于经前瞻性分选的前体细胞而言，由于其固有的成球能力较低，且因稀释效应导致自分泌刺激受限，该方法通常会导致成球率极低。根据我们的经验，仅有约30%的接种细胞能够形成细胞球。我们建议每孔至少接种100个细胞，以获得稳定且可重复的实验结果。

用于培养CSC的其他培养方法基于固体或半固体三维培养体系（例如， 基于Matrigel、胶原蛋白或甲基纤维素的方法。这些方法已被用于限制细胞迁移及后续的细胞聚集 ³⁶然而，这些基质各自都存在一定的局限性。例如，Matrigel 是一种从 Engelbreth-Holm-Swan（EHS）肿瘤中分离得到的可溶性基底膜，尽管其提取物类似于多种组织中复杂的肿瘤细胞外微环境，但它含有多种定义不完全明确的生长因子，这往往使得针对特定调控元件的机制研究变得十分困难。另一个需要考虑的问题是，成球能力与干细胞功能并非可互换的概念。 ³⁴尽管某些干细胞和祖细胞已被证明具有形成球体的能力 ³⁷，无法形成球体 体外 不排除 体内 干细胞/祖细胞功能。例如，静息态干细胞可能根本不会对所选的细胞外信号产生响应 体外 培养条件。因此，长期 体外 和 体内 应通过连续传代培养，评估纯化细胞群体的自我更新能力，以验证或证伪其干细胞功能。在此背景下，前瞻性地同时扩增不同类型的干细胞和前体细胞群体的能力，是成球实验的关键优势，也使该实验在肿瘤干细胞研究领域具有重要价值；但需在解读实验结果时充分考虑其局限性。

成球实验已广泛用于在体外单细胞水平上，根据细胞的自我更新和分化能力回溯性地鉴定干细胞。随着标志物的发现，人们能够前瞻性地分离干细胞及其子代细胞 体内 微环境可用于定义纯化细胞群体的功能特性。  成球实验与FACS联用是一种成功分离实体组织中细胞或在培养过程中富集特定胰腺导管腺癌亚群的有效策略。例如，EpCAM、CD24和CD44的共表达定义了一群具有自我更新、分化及成瘤能力的肿瘤干细胞亚群，反映了原始肿瘤的异质性。Hermann 等结果显示，CD133+ 细胞具有增强的增殖能力及肿瘤干细胞特征 ¹⁵其他标记物也被用于肿瘤干细胞（CSCs）的鉴定：ALDH1（醛脱氢酶1）的表达与胰腺癌中高致瘤性细胞相关。 ³⁸；能够排出DNA染料Hoechst 33342的细胞，称为侧群（side population, SP）细胞，已被证实具有启动肿瘤形成的能力 ³⁹最近，我们发现一种亚细胞自发荧光区室可表征一类具有独特肿瘤干细胞特性的细胞亚群，该特性存在于不同类型的肿瘤中 ⁴⁰尽管这些标志物中没有一种能够选择性地表征出纯粹的肿瘤干细胞群体，但需要使用越来越复杂的标志物组合，通过FACS来纯化出更为精确的细胞群体。

关于肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤发生、进展及耐药性中的确切作用，仍有许多问题尚未解决。例如，可通过分析疾病不同阶段的患者样本，并在治疗期间及治疗后动态追踪肿瘤干细胞数量的变化，来探究克隆进化问题，以明确单个肿瘤干细胞是否以及如何启动肿瘤形成。通过回答这些问题，我们能够深入理解实体瘤中肿瘤干细胞的特性，推动药物疗法的开发，最终防止肿瘤进展和复发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计数室/血细胞计数板	Hausser Scientific Co	3200
用于增殖和活力检测的CASY细胞计数与分析仪	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS组织解离器	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C型管	Miltenyi Co	130-093-237
24孔超低吸附培养板	Corning	3474
100毫米组织培养皿	BD Falcon	353803
细胞滤网	BD Falcon	352350
15毫升聚丙烯锥形管	BD Falcon	352097
50毫升聚丙烯锥形管	BD Falcon	352070
1.5毫升无菌离心管	Eppendorf	0030 120.086
50毫升离心管	Corning	430828
无菌培养皿，直径10厘米	Corning	353003
26G针头	BD Falcon	300600
100微升Hamilton注射器	Hamilton Syringe Co	81075
IV型胶原酶	Stem Cell Technologies	7909
RPMI 1640培养基	Life technologies	11875-085
青霉素/链霉素溶液，100倍浓缩液	Life technologies	SV30010
二甲双胍	Sigma	D150959-5G
L-谷氨酰胺，200 mM，100倍浓缩液	Life technologies	25030-081
D-葡萄糖	Sigma	G8270
100 mM丙酮酸钠溶液	Life technologies	11360-070
Seahorse检测专用培养基	Seahorse Bioscience	100965-000
BD Cell-TAK细胞与组织粘附剂	BD Biosciences	354240
胰蛋白酶溶液，0.05%	Life technologies	25300054
B27添加剂，50倍浓缩液	Life technologies	17504-044
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma	F0291
牛血清白蛋白	Sigma	A9576
Dulbecco改良Eagle培养基/F12’	Sigma	D8437
无菌1倍Dulbecco磷酸盐缓冲液’	Sigma	D8537
台盼蓝	Life technologies	15250-061
羧基-DCFDA（5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯）	Life technologies	C-369
鱼藤酮	Sigma	R8875
70%乙醇（体积/体积）	Sigma	459844
异氟烷	IsoVet, Braun	571105.8
Matrigel基质胶	BD Biosciences	35620
无菌棉签	Puritan medical
XF96e FluxPak试剂盒（含细胞板、校准液和检测卡）	Seahorse Bioscience	102416-100
XF96e 细胞外通量分析仪	Seahorse Bioscience
带CO2输入接口的培养箱
微型剪刀
弯头镊子
细长镊子
游标卡尺