此处介绍一种直接立体定位脑内灌注淀粉样蛋白β的实验方案。该方法提供了一种替代性策略 体内 用于研究淀粉样蛋白-beta 对脑神经元短期影响的小鼠模型
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摘要
摘要
阿尔茨海默病是一种影响老年人群的神经退行性疾病。该疾病的关键神经病理学特征是淀粉样蛋白-β的过度产生及其在患者脑区的淀粉样蛋白-β斑块沉积。多年来，科研人员已构建了多种阿尔茨海默病小鼠模型，试图模拟淀粉样蛋白-β的病理过程。然而，这些小鼠模型仅能部分模拟疾病的特征。在阿尔茨海默病患者大脑中显著存在的神经元死亡现象，在这些小鼠模型中却明显缺失。因此，我们及其他研究者采用了一种直接将可溶性寡聚态淀粉样蛋白-β——已被证实对神经元毒性最强的形式——通过立体定位注射方式注入脑内的方法。本报告中，我们使用雄性C57BL/6J小鼠，记录这种在特定脑区提高淀粉样蛋白-β水平的外科手术技术。注射靶点为海马体的齿状回，因为该脑区与通过胆碱能神经环路相连的基底前脑共同构成了疾病中发生退变的主要区域之一。通过立体定位注射在齿状回提高淀粉样蛋白-β水平的结果显示，1周内即可观察到齿状回神经元丢失增加，同时伴有基底前脑Broca斜角带垂直支中细胞死亡及胆碱能神经元丢失的同步增加。这些效应可持续至2周。我们的数据表明，当前的淀粉样蛋白-β注射模型为在短期内研究特定脑区神经元死亡提供了一种替代性小鼠模型。该模型的优势在于，淀粉样蛋白-β的升高可实现空间和时间上的精确控制。
引言
由淀粉样蛋白-beta（Aβ1-42）组成的淀粉样斑块沉积是阿尔茨海默病（AD）病理学的关键特征。大量研究表明，高水平或毒性浓度的重组寡聚体Aβ1-42可引发神经元死亡、突触营养不良、突触丢失与功能障碍，以及学习和记忆能力下降1-4。受累脑区包括海马、皮层以及基底前脑和杏仁核等皮层下结构5,6。迄今为止，已有多种转基因小鼠模型试图模拟AD中的Aβ1-42病理变化。根据不同品系，这些动物模型在研究AD特定病理特征方面具有一定价值。然而，遗憾的是，除APP23和5XFAD两个转基因品系外，其他小鼠模型均未能完全再现AD中神经元丢失这一关键病理特征。即使在APP23和5XFAD小鼠中观察到神经元丢失，其神经元死亡程度也较为轻微，且具有年龄依赖性，仅局限于少数特定脑区7,8。
将寡聚体 Aβ1-42 直接注入野生型小鼠脑内，可建立一种优良的体内模型，用以模拟淀粉样蛋白病（amyloidopathy）中的神经元死亡特征1,9,10。与常用的转基因小鼠模型不同，寡聚体 Aβ1-42 注入模型更适合在空间和时间上精确地急性升高 Aβ1-42 水平。采用野生型小鼠的优势在于可避免转基因小鼠品系中因引入突变而可能产生的代偿效应或副作用。以往研究表明，在海马体内....
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方案
注意：所有动物实验均遵循机构和国家关于实验动物护理与使用的指南。
1. 准备手术器械和手术用溶液
- 将所有不锈钢外科手术器械进行高压灭菌。
- 用无菌分子级去离子蒸馏水稀释200 proof的无水乙醇，配制70%乙醇。
- 将29 G针头连接至汉密尔顿注射器。用纳米纯水反复吸取并推出1分钟，清洗汉密尔顿注射器和针头内部。再用70%乙醇重复此操作。
- 从汉密尔顿注射器上取下活塞和针头，在层流罩中过夜晾干。
- 使用前用紫外线照射针头和注射器30分钟。
- 将NaCl溶解于分子级水中，配制成终浓度为0.9%（重量/体积）的生理盐水溶液。用0.2 μm孔径滤器过滤溶液，进行灭菌。
2. 准备寡聚化 Aβ1-42
- 按照 Fa' 及其他作者发表的方法13，将重组人 Aβ1-42 在 DMSO 中单体化并重悬至 5 mM。
- 在手术前一天，用无菌（1×）PBS 将 5 mM Aβ1-42 稀释至 100 µM。
- 通过吹打充分混匀溶液。
- 将 Aβ1-42 溶液在 4˚C 下孵育 12 小时。
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结果
本方法制备的人重组寡聚体Aβ1-42可获得由单体、二聚体、三聚体和四聚体组成的可溶性寡聚物（图1A）。大量研究表明，这些低分子量的Aβ1-42物种（而非纤维和斑块）在多种情况下对神经元毒性最强1,4,9,17-19。为确定寡聚体Aβ1-42是否可诱导小鼠脑内神经元死亡，将Aβ1-42（4 µl，100 µM储备液）注入9月龄野生型C57BL/6J小鼠单侧海马齿状回（DG）。C57BL/6J小鼠海马重量约为0.018 g，因此Aβ1-42的递送剂量约为100 μg/g。同一只小鼠脑的对侧DG则注入对照/载体溶液作为比较，该溶液由溶解Aβ1-42时所用等体积的DMSO稀释于（1×）PBS中制成。如前所述，也可使用乱序或反向Aβ1-42肽段作为对照，因为我们先前发现其对海马神经元无影响1。由于注射针头进入脑组织会造成局部损伤（图1B），并最终导致DG塌陷，因此我们选择在注射 tra.......
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讨论
为了成功进行 Aβ1-42 注射，实验人员或外科医生必须做到：1）采用无菌技术；2）根据准确的坐标正确定位目标脑区；3）能够将小鼠正确固定在立体定位仪上，并使脑部在前后（AP）和内侧-外侧（ML）轴向上保持水平；4）具备精确操作显微操纵器的能力；5）确保术后护理得当。若遵循这些关键步骤，小鼠应能存活且无明显感染迹象。
与体外（in vitro）研究一致，我们及其他研究者已证实，将Aβ1-42直接注入海马体会导致神经元死亡1,4,9,10，这体现了阿尔茨海默病（AD）的关键特征之一。神经退行性变在注射部位周围表现明显，表现为齿状回体积减小，并伴随神经退行性变标志物的增加1。此外，投射至海马体的胆碱能神经元发生逆行性死亡，这通过基底前脑（BF）中胆碱能标记物减少以及TUNEL阳性染色增加得以证实1,10。因此，这种体内（in vivo）模型是研究Aβ1-42局部半急性效应的优良模型。该注射模型的主要优势在于其动态特性：可.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目NS081333（资助对象：CMT）、阿尔茨海默病协会资助项目NIRG-10-171721以及美国国家精神卫生研究所资助项目MH096702（资助对象：UH），以及由美国国家老龄化研究所资助的哥伦比亚大学阿尔茨海默病研究中心试点项目AG008702（资助对象：YYJ和JB）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸氯胺酮（100 mg/ml） | Henry Schein Medical | 1049007 | 每1 kg动物使用100 mg氯胺酮 |
| 赛拉嗪（20 mg/ml） | Henry Schein Medical | 暂无内容 | 每1 kg动物使用10 mg 咪唑啉酮 |
| 布托啡诺（Buprenex，0.3 mg/ml） | Henry Schein Medical | 1217793 | 每1 kg动物使用0.1 mg布托啡诺 |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM；该淀粉样蛋白在论文中被使用 |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | 可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用 |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | 可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用 |
| 随机序列 Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | 可用作对照肽，用于比较 Aβ1-42 |
| NU4 抗体（寡聚淀粉样蛋白抗体） | William Klein/西北大学惠赠 | 未提供待译文本 | 1:2,000 稀释度 |
| 抗淀粉样蛋白寡聚体抗体 （兔多克隆） | EMD Millipore | AB9234 | 可替代 Nu4 使用；需要 由最终用户进行测试 |
| 6E10 抗体（单克隆小鼠）（淀粉样蛋白抗体） | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 稀释度 |
| ChAT 抗体（多克隆山羊） | Millipore | AB144P | 1:100 稀释 |
| DeadEnd 荧光 TUNEL 检测试剂盒 | 普洛麦格 | G3250 | 遵循制造商的使用说明 |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Invitrogen | P36935 | 使用于盖玻片盖片时 |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | 未提供待译文本 | 2% 溶液 |
| 无水乙醇（200 proof） | Fisher Scientific | BP2818-4 | 用于配制70%乙醇以进行消毒和灭菌 |
| Novex 10-20% Tricine 胶 | Life Technologies | EC6625BOX | 用于分离Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS 电泳缓冲液 (10X) | Life Technologies | LC1675 | 用于运行10-20% Tricine凝胶 |
| Novex Tris-甘氨酸转膜缓冲液（25X） | Life Technologies | LC3675 | 用于转移10-20% Tricine凝胶 |
| SuperSignal 蛋白质印迹增强剂 | 赛默飞世尔科技 | 46640 | 用于增强Aβ1-42 信号；遵循制造商方案 |
| Protran BA79 硝酸纤维素印迹膜，0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | 用于转移10-20% Tricine凝胶 |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | 用于运行10-20% Tricine凝胶的电泳装置 |
| GenTeal 润滑眼用凝胶 | 诺华 | 暂无内容 | 用于在手术期间保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买 |
| [标题] | |||
| Refresh Optive 润滑型滴眼液 | Allergan | 未提供待译文本 | 用于手术期间保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买；可替代GenTeal使用 |
| 聚维酮碘 | 斯托尔ティング | 50998 | 用于消毒和灭菌 |
| 圆形/锥形刮铲 | VWR | 82027-490 | 用于打开动物口腔 |
| Bulldog Serrefines 止血钳（钳口尺寸 9×1.6 mm；长度 28 mm） | Fine Science Tools | 18050-28 | 可选；用于注射时保持头皮皮肤分离 |
| 直头精细剪刀（刃长25 mm；全长11.5 cm） | Fine Science Tools | 14060-11 | 用于切割头皮 |
| #3 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 手术刀片 | Fine Science Tools | 10011-00 | 用于制作头皮切口 |
| 学生用标准型镊子（尖端尺寸 2.5×1.5 mm；长度 11.5 cm） | Fine Science Tools | 91100-12 | 缝合时用于固定头皮闭合 |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | 用于剃除毛发 |
| T/Pump 温水循环器 | Kent Scientific | TP-700 | 用于手术期间动物保温 |
| 可重复使用加热垫（5" 10 倍") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | 用于将其连接至T/Pump温水循环器，以在手术期间为动物保温 |
| 无线微型钻机 | 斯托尔廷 | 58610 | 使用0.8 mm钢钻头在颅骨上钻孔 |
| 用于小鼠的实验室标准立体定位仪 &和新生大鼠适配器 | 斯托尔ティング | 51615 | |
| 仅用于小鼠立体定位仪 | 斯托尔ティング | 51730 | 可替代 Stoelting 目录号 #51615 使用 |
| 经典的立体定位注射器 | 斯托尔廷 | 53311 | |
| 干玻璃珠灭菌器 | 斯托尔廷 | 50287 | 用于不锈钢器械的灭菌 |
| 无菌手术巾（18" x 26") | 斯托尔ティング | 50981 | |
| Hamilton 50 ml 注射器，型号 705 RN SYR，NDL | Hamilton公司 | 7637-01 | 用于脑内注射时；不同溶液应使用不同的注射器 |
| 29 G 针头，小 hub RN NDL | Hamilton公司 | 7803-06 | 用于连接 Hamilton 注射器以进行脑部注射 |
| 1 ml BD 结核菌素注射器 | VWR | BD309659 | 用于麻醉和生理盐水给药 |
| 30 G 针头（0.5") | VWR | BD305106 | 用于麻醉和生理盐水给药 |
| Ohaus 便携式电子 CS 系列天平 | VWR | 65500-202 | 用于称量动物以确定麻醉剂量 |
| 热板（顶板尺寸：7.25英寸×7.25英寸） | VWR | 47751-148 | 术后动物保温 |
| Sofsilk 丝线缝合线 C-1 3/8弧，12 mm，带切割针 | Covidien | S1173 | 缝合伤口 |
| Vetbond 组织粘合剂 (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | 可选：辅助伤口闭合；与缝合线配合使用。 |
| 无菌棉签（木柄） | Fisher scientific | 22-029-488 | 用于清洁和干燥手术伤口 |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 用于收集脑切片 |
| VWR 显微盖玻片 24 × 50 mm | VWR | 48393241 | 用于载玻片的封片 |
| 赛默飞世尔科技 Nalgene 注射器滤器 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | 用于生理盐水溶液的灭菌 |
| Viscot Medical 无菌双头皮肤标记笔 | 医学索引 | VIS1422SRL91 | 用于标记颅骨上的坐标 |
参考文献
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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