本文介绍了一种用于包封消耗脂肪以产生热量的分解代谢细胞的实验方案，这些细胞存在于腹腔内脂肪组织中，并可在肥胖小鼠中增加能量消耗。
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本文内容
摘要
摘要
细胞封装技术旨在将活细胞包裹于半透膜内。移植后的封装细胞可与宿主组织交换低分子量代谢物，从而实现长期存活。半透膜可使移植的封装细胞避免受到免疫系统的排斥。该封装技术旨在实现对生物活性物质（如胰岛素、其他激素和细胞因子）的可控释放。本文介绍一种用于封装产热分解代谢细胞的方法，这类细胞可在肥胖小鼠的腹腔内脂肪组织中通过消耗脂质产生热量并耗散能量（即产热作用）。封装产热型分解代谢细胞可能适用于肥胖症和2型糖尿病的预防与治疗。分解代谢细胞的另一潜在应用还包括清除酒精或其他有毒代谢物及环境污染物。
引言
慢性疾病发病率的不断上升1推动了治疗性细胞群体移植的研究2。同基因型或异基因型干细胞是这些应用中最常用的细胞类型2。然而，这些治疗方法无法控制干细胞植入后的分化和迁移过程，且成本效益较低。移植具有有益功能的基因修饰细胞有望改善多种疾病的治疗。但基因修饰的细胞会被宿主免疫系统识别，因此这类治疗需要伴随免疫抑制3。Chang 博士开发了胰岛素生成细胞的包封技术4。该技术基于将细胞包裹在海藻酸盐液滴中，并将其浸入氯化钙溶液中。海藻酸分子由甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）组成，可通过 Ca2+ 连接。凝胶化后，微珠被悬浮于聚-L-赖氨酸（PLL）溶液中。在此步骤中，PLL 与海藻酸分子中的 G 和 M 结合，从而形成胶囊的膜结构。胶囊膜的孔隙率可通过调节 M 和 PLL 的浓度、孵育时间及温度进行调控。PLL 的结合还取决于海藻酸的类型和浓度。由 Ca2+ 离子交联的海藻酸盐基质在生理环境或含有高浓度磷酸盐和柠檬酸盐离子的常见缓冲液中不稳定。这些缓冲液可从海藻酸中提取 Ca2+，导致核心液化。海藻酸核心的液化为胶囊内部的细胞运动和生长提供了空间。使用多阴离子海藻酸与多阳离子聚-L-赖氨酸（APL）包封的细胞对免疫球蛋白不可渗透，但允许营养物质流入和毒素流出。APL 的这些特性使得包封细胞在移植到遗传背景不同的宿主体内后能够长期存活。Elliott 等
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方案
本研究方案已获得俄亥俄州立大学伦理委员会批准。动物实验已获IACUC方案批准。所有操作均在II级生物安全柜中进行，且气流为层流。我们遵循了所有标准安全要求和操作规程。微胶囊制备的微囊化技术已如文献17,18所述进行。
1. 材料准备
- 在灭菌生理盐水（0.9% NaCl 水溶液）中配制 10 ml 2% 海藻酸钠溶液。在生理盐水中配制 0.05% 聚赖氨酸（PLL）溶液。上述溶液均于前一日配制，搅拌过夜。使用前用 0.22 μm 滤膜过滤。
- 配制 50 mM 柠檬酸钠和 100 mM CaCl₂2 在0.9% NaCl溶液中并进行高压灭菌。
- 对所有溶液、针头、电极和烧杯进行高压灭菌。使用带线的针头彻底清洁，以防止堵塞。
- 确定用于制备微胶囊的合适细胞数量（每厘米需要102个微胶囊）2 每孔约有500个细胞18使用1 ml海藻酸钠处理两百万个细胞。
- 配制含有10% 小牛血清和100 U/ml 青霉素/链霉素的“成纤维细胞生长培养基”，即高糖（4,500 mg/l 葡萄糖）杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 在DMEM中配制“分化培养基I”，包含10%胎牛血清、10 µg/ml胰岛素、1 µM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1....
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结果
图1显示，在显微镜下可控制微珠制备的每一步骤。图2A展示了如何将脂肪细胞与一层包封细胞共培养。图2B是使用第5节所述脂肪细胞/微胶囊共培养体系进行定量研究的代表性示例。脂肪细胞裂解物通过蛋白质印迹法进行分析。本实验未对包封细胞进行分析。一抗ATGL和β-actin的使用稀释比例均为1:1,000。ATGL与β-actin的比值以三次独立实验的均值±标准差（S.D.）表示。类似的共培养方法也可用于分析mRNA，并研究共培养体系中包封细胞与脂肪细胞相互作用的影响。数据显示，与包封的野生型（WT）脂肪细胞相比，包封的产热型Aldh1a1-/-脂肪细胞可显著诱导脂肪细胞中更高水平的ATGL脂肪酶表达及脂解作用18。
图3 显示GFP可指示胶囊在宿主脂肪组织中的位置及其完整性。GFP的表达也是细胞活力的指标。
定性评估
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讨论
已采用多种方法对细胞进行包封，包括干燥、挤出和乳化19在此方法中，海藻酸盐珠通过针头挤出，随后包被PLL，再溶解海藻酸盐核心以完成包封。尽管该方法已使用多年，但制备具有理想尺寸和球形形态的微珠仍具挑战性。微囊的尺寸高度依赖于海藻酸钠溶液的黏度、挤出器直径以及针尖与CaCl₂溶液之间的距离。2 溶液20针尖与CaCl₂表面之间的距离越短2 溶液浓度越高，产生的微珠越小。所述方案可制备出具有孔隙的APL<32 kD）。可使用荧光标记的免疫球蛋白通过实验测定孔径大小（>32 kD）以及荧光小肽，方法如前所述18该孔径大小足以支持细胞存活 体外 培养2周后 体内 植入脂肪组织至少80天18微珠的形状是影响包封细胞存活的重要因素。带有多个卫星微珠的破裂微珠会增加细胞的突出。21当使用较低浓度和低粘度的中等G型藻酸盐溶液时，会发生卫星液滴形成现象22，而尾部的形成是由于高G型海藻酸盐所致23由于剪切力也.......
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致谢
我们感谢 Jennifer Petrosino 和 David DiSilvestro 提供的编辑帮助。本研究得到了美国蛋品委员会资助项目（编号 20020728）和诺和诺德制药公司资助项目（编号 10040042）的支持，同时也得到了俄亥俄州立大学（OSU）食品创新中心、国际事务办公室、先进功能食品研究中心及创业部门，以及美国国家科学基金会项目 EEC-0914790（L.J.L.）的资助。本项目还获得了美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）资助项目 R21OD017244（O.Z.）和 UL1RR025755（OSUCCC）的支持，上述资助由美国国立卫生研究院院长办公室（OD）提供资金，并得到 NIH 医学研究路线图以及 NCI P30CA16058 的支持。本内容仅由作者负责，不代表研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 包封装置（VAR V1） | Nisco | LIN-0042 | 无 |
| KD 科学注射泵 | KD scientific | 780100Y | 无 |
| 奥林巴斯显微镜 | Olympus Optical | IX70-S8F2 | 无 |
| 海藻酸钠 | Sigma | MKBP8122V | 无 |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL） | Sigma | 020M5006V | 无 |
| 氯化钙 | Sigma | SLBJ2662V | 无 |
| 柠檬酸三钠三碱二水合物 | Sigma | 030M0200 | 无 |
| 氯化钠 | Sigma | SLBD2595V | 无 |
| Mini-PROTEAN TGX 凝胶 | Bio-Rad | 456-1093 | 无 |
| ATGL 一抗（兔源） | Cell Signaling | 2138S | 无 |
| 二抗（抗兔） | LI-COR | 926-68071 | 无 |
| 放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA buffer） | Boston BioProducts | D25Y6Z | 无 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | RNBD2893 | 无 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | 无 |
| 可的松10止痒软膏 | Cortizone 10 | C4029138 | 无 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11965-092 | 无 |
| 新生牛血清（CS） | Sigma | N4762 | 无 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F4135 | 无 |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | I0516 | 无 |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | 无 |
| 胰岛素（牛源） | Sigma | I5879 | 无 |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 4693159001 | 无 |
参考文献
- Vogeli, C., et al. Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs. Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).
- Vija, L., et al.
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重印与许可
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