利用可穿透细胞的Cys2-His2锌指结构域向哺乳动物细胞直接递送蛋白质

摘要

锌指结构域具有内在的细胞通透性，能够介导蛋白质递送至多种哺乳动物细胞类型。本文提供了一种利用锌指技术实现细胞内蛋白质递送的详细逐步操作方案。

摘要

由于具有模块化特性，并可被重新编程以识别多种DNA序列，Cys₂-His₂ 锌指DNA结合结构域已成为靶向基因组编辑的有用工具。与其他许多DNA结合蛋白类似，锌指也具有天然穿越细胞膜的能力。我们近期已证明，这种固有的细胞通透性可用于细胞内蛋白质递送。将锌指基序进行基因融合，可实现蛋白质和酶类货物向多种哺乳动物细胞类型的高效转运。与其他蛋白质转导技术不同，通过锌指结构域递送不会抑制酶活性，并可实现高水平的细胞质递送。本文提供了一套利用锌指技术向哺乳动物细胞递送蛋白质的详细分步操作方案，重点强调了实现高水平细胞内锌指介导递送的关键步骤，并讨论了优化该系统性能的策略。

引言

高效且通用的蛋白质递送策略对于许多基础研究和治疗应用至关重要。将纯化的蛋白质直接递送入细胞是实现这一目标最安全、最简便的方法之一。^1,2 与依赖核酸基因表达的策略^3-5不同，蛋白质递送不存在插入突变的风险，不依赖细胞的转录/翻译机制，并可实现即时效应。然而，由于缺乏简单且可广泛适用的方法来赋予蛋白质穿膜活性，蛋白质直接进入细胞的过程常常受到阻碍。目前促进胞内蛋白质递送的方法主要包括使用天然存在的^6-8或设计的穿膜肽^9-12、超带电转导结构域^13,14、纳米颗粒¹⁵和脂质体¹⁶、病毒样颗粒^17,18以及聚合物微球材料¹⁹。遗憾的是，这些方法中的许多存在细胞摄取效率低^20,21、稳定性差²²、意外的细胞类型特异性²³、内体逃逸能力弱²⁴以及毒性²⁵等问题。此外，许多蛋白质转导技术会降低递送蛋白的生物活性。¹⁴

本实验室先前已证明，锌指核酸酶（ZFN）蛋白——由可编程的 Cys₂-His₂ 锌指 DNA 结合蛋白与 FokI 限制性内切核酸酶的切割结构域组成的嵌合限制性内切酶^26-28 

方案

1. 克隆

1. 获取已亚克隆至pET-28表达载体系统中的丙氨酸取代的双指ZiF结构域，该载体可应要求提供（pET-2F-ZiF）³⁴。
2. 使用引物5’ XmaI-EmGFP（5’-GGAAATTGCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3’；XmaI位点以粗体显示）和3’ SacI-EmGFP（5’-CGGATCTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3’；SacI位点以粗体显示），从质粒Emerald-pBAD中通过PCR扩增EmGFP。
   1. 在100 μl反应体系中加入5 ng模板DNA、10 μl 10x聚合酶缓冲液、1单位（U）Taq DNA聚合酶、每种dNTP 0.2 mM、每种引物0.2 μM，其余体积用去离子水补足。PCR循环条件为：95 °C预变性5 min；30个循环（95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1 min）；最后72 °C延伸10 min。通过凝胶回收法纯化PCR产物，并使用分光光度计测定DNA浓度（Abs₂₆₀ × 50 μg/ml）。
3. 使用限制性内切酶XmaI和SacI，在推荐缓冲液中于37 °C孵育3小时，对pET-....

结果

可表达双指ZiF-EmGFP融合蛋白 E. coli 与 >95% 纯度及高产量（>25 mg/ml) (图2）。通常情况下，单指和双指ZiF融合蛋白的表达量几乎与野生型未修饰蛋白相当。然而，在某些情况下，五指和六指ZiF融合蛋白的表达产量不足以满足后续应用的需求。

在37 °C条件下，将双指ZiF-EmGFP蛋白直接作用于HeLa细胞90分钟，可导致EmGFP荧光呈剂量依赖性增强（图3A）。关键的是，在缺乏ZiF结构域的情况下未观察到任何荧光信号。我们先前发现，仅用2 μM双指ZiF-EmGFP蛋白处理后，几乎所有细胞均呈现荧光；且当ZiF融合蛋白浓度低至0.25 μM时，HeLa细胞仍可检测到EmGFP荧光（图3B）。

讨论

本文介绍了一种利用可穿透细胞的锌指（ZiF）结构域进行蛋白质递送的分步实验方案。ZiF结构域不会降低融合酶类货物的活性³⁴；能够以接近未修饰蛋白的产量实现蛋白质的表达与纯化；并且可将蛋白质和酶高效地导入多种细胞类型，其递送效率超过传统的细胞穿透肽或蛋白质转导结构域系统。综上所述，这些结果表明ZiF结构域在介导蛋白质直接递送入细胞方面具有广泛的应用潜力。

尽管由三个和四个锌指（ZiF）结构域组成的扩展阵列带有更高的正电荷，但此前实现最大蛋白递送效率时仅使用了双指ZiF结构域。这些结果表明，ZiF介导的细胞摄取可能受到除电荷以外其他因素的影响，包括蛋白质稳定性或构象刚性。研究还发现，ZiF结构域介导的蛋白递送具有能量依赖性，因此所有经蛋白处理的细胞均需在37 °C条件下孵育。通过使用针对不同内吞途径的小分子抑制剂，发现巨胞饮作用以及（程度较轻的）小窝蛋白依赖性内吞作用是ZiF介导细胞进入的主要途径³⁴。值得注意的是，与其他蛋白转导系统不同，ZiF结构域能够高效地从内体中逃逸，从而介导融合的大分子货物在细胞质中的高水平递送，凸显了这些结构域在实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
XmaI	新英格兰生物实验室	R0180L
SacI	新英格兰生物实验室	R0156L
Expand High Fidelity PCR 系统	罗氏	11759078001
dNTPs	新英格兰生物实验室	N0446S
4%-20% Tris-甘氨酸迷你蛋白凝胶，1.5 mm，10 孔	Life Technologies	EC6028BOX
2x Laemmli 上样缓冲液	BioRad	161-0737
T4 DNA 连接酶	Life Technologies	15224-017
BL21 (DE3) 感受态 E. coli	新英格兰生物实验室	C2527I
IPTG	Thermo Scientific	R0391
氯化锌	Sigma-Aldrich	208086-5G
硫酸卡那霉素	费舍尔科技	BP906-5
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Tris 碱	费舍尔科技	BP152-25
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888-25G
DTT	费舍尔科技	PR-V3151
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ni-NTA 琼脂糖树脂	QIAGEN	30210
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
咪唑	Sigma-Aldrich	I5513-25G
Amicon Ultra-15 离心滤过装置	EMD Millipore	UFC900324
DMEM	Life Technologies	11966-025
胎牛血清	Life Technologies	10437-028
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
24 孔平底培养板	Sigma-Aldrich	CLS3527-100EA
多聚赖氨酸	Sigma-Aldrich	P7280
不含钙、镁的 DPBS	Life Technologies	21600010
硫酸乙酰肝素	Sigma-Aldrich	H4777
胰蛋白酶	Life Technologies	25300054
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2
Nano Drop ND-1000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28104
QIAquick 凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704