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方法文章

利用可穿透细胞的Cys2-His2锌指结构域向哺乳动物细胞直接递送蛋白质

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DOI：

10.3791/52814

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2015年3月25日

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

锌指结构域具有内在的细胞通透性，能够介导蛋白质递送至多种哺乳动物细胞类型。本文提供了一种利用锌指技术实现细胞内蛋白质递送的详细逐步操作方案。

摘要

由于具有模块化特性，并可被重新编程以识别多种DNA序列，Cys2-His2 锌指DNA结合结构域已成为靶向基因组编辑的有用工具。与其他许多DNA结合蛋白类似，锌指也具有天然穿越细胞膜的能力。我们近期已证明，这种固有的细胞通透性可用于细胞内蛋白质递送。将锌指基序进行基因融合，可实现蛋白质和酶类货物向多种哺乳动物细胞类型的高效转运。与其他蛋白质转导技术不同，通过锌指结构域递送不会抑制酶活性，并可实现高水平的细胞质递送。本文提供了一套利用锌指技术向哺乳动物细胞递送蛋白质的详细分步操作方案，重点强调了实现高水平细胞内锌指介导递送的关键步骤，并讨论了优化该系统性能的策略。

引言

高效且通用的蛋白质递送策略对于许多基础研究和治疗应用至关重要。将纯化的蛋白质直接递送入细胞是实现这一目标最安全、最简便的方法之一。1,2 与依赖核酸基因表达的策略3-5不同，蛋白质递送不存在插入突变的风险，不依赖细胞的转录/翻译机制，并可实现即时效应。然而，由于缺乏简单且可广泛适用的方法来赋予蛋白质穿膜活性，蛋白质直接进入细胞的过程常常受到阻碍。目前促进胞内蛋白质递送的方法主要包括使用天然存在的6-8或设计的穿膜肽9-12、超带电转导结构域13,14、纳米颗粒15和脂质体16、病毒样颗粒17,18以及聚合物微球材料19。遗憾的是，这些方法中的许多存在细胞摄取效率低20,21、稳定性差22、意外的细胞类型特异性23、内体逃逸能力弱24以及毒性25等问题。此外，许多蛋白质转导技术会降低递送蛋白的生物活性。14

本实验室先前已证明，锌指核酸酶（ZFN）蛋白——由可编程的 Cys2-His2 锌指 DNA 结合蛋白与 FokI 限制性内切核酸酶的切割结构域组成的嵌合限制性内切酶26-28 ——具有天然的细胞通透性。29 这种出人意料的穿膜活性被证实是人工设计的锌指结构域本身固有的一种特性；该 DNA 结合平台已被广泛用作靶向基因组编辑的有力工具30-32，其穿膜能力被认为源于蛋白表面六个带正电荷残基的特定排列。事实上，已有研究表明多种 DNA 结合蛋白（如 c-Jun 和 N-DEK）具有天然穿越细胞膜的能力。33 近期，本实验室进一步拓展了这些发现，证明锌指（ZiF）结构域的穿膜活性可用于细胞内蛋白递送。将单指或双指 ZiF 结构域与特定蛋白货物进行基因融合后，其摄取效率超过了多种传统的细胞穿膜肽递送系统。34 尤为重要的是，ZiF 介导的递送并未影响融合酶类货物的活性，并实现了高水平的胞质递送。综上所述，这些研究结果表明 ZiF 结构域在高效、便捷地将蛋白乃至其他更多样化的生物大分子递送入细胞方面具有巨大潜力。

本文介绍了一种利用ZiF技术在哺乳动物细胞中递送蛋白质的详细分步实验方案。我们此前构建了一系列包含一指、两指、三指、四指、五指和六指的ZiF结构域，这些结构域由于α-螺旋DNA结合残基被取代而丧失了DNA结合能力，但仍具备将蛋白质递送入细胞的功能34（图1）。本文以两指ZiF结构域介导Emerald GFP（EmGFP）在HeLa细胞中的表达与转导为例进行说明。该方案可广泛适用于几乎所有能在大肠杆菌（Escherichia coli）中可溶性表达的蛋白质以及多种哺乳动物细胞类型。文中还提供了预期实验结果，并讨论了优化该系统性能的策略。

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方案

1. 克隆

  1. 获取已亚克隆至pET-28表达载体系统中的丙氨酸取代的双指ZiF结构域，该载体可应要求提供（pET-2F-ZiF）34。
  2. 使用引物5’ XmaI-EmGFP（5’-GGAAATTGCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3’；XmaI位点以粗体显示）和3’ SacI-EmGFP（5’-CGGATCTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3’；SacI位点以粗体显示），从质粒Emerald-pBAD中通过PCR扩增EmGFP。
    1. 在100 μl反应体系中加入5 ng模板DNA、10 μl 10x聚合酶缓冲液、1单位（U）Taq DNA聚合酶、每种dNTP 0.2 mM、每种引物0.2 μM，其余体积用去离子水补足。PCR循环条件为：95 °C预变性5 min；30个循环（95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1 min）；最后72 °C延伸10 min。通过凝胶回收法纯化PCR产物，并使用分光光度计测定DNA浓度（Abs260 × 50 μg/ml）。
  3. 使用限制性内切酶XmaI和SacI，在推荐缓冲液中于37 °C孵育3小时，对pET-2F-ZiF质粒和编码EmGFP的插入片段进行双酶切（每1 μg DNA使用10 U酶）。通过琼脂糖凝胶电泳结合荧光嵌入染料（如溴化乙锭）观察DNA条带。
  4. 使用凝胶回收试剂盒纯化酶切后的DNA，并通过分光光度计测定DNA浓度（Abs260 × 50 μg/ml）。
  5. 将纯化的编码EmGFP的DNA片段与50–100 ng pET-2F-ZiF质粒进行连接，使用1 U T4 DNA连接酶在室温下反应至少1小时。为获得最佳连接效果，建议插入片段与载体的摩尔比为6:1。
  6. 将50 μl化学感受态XL-1 Blue Escherichia coli细胞置于冰上解冻，轻柔混入10–20 ng连接产物pET-2F-ZiF-EmGFP。
  7. 冰上孵育30分钟，42 °C热激90秒，随后在2 ml含有分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC）中，37 °C振荡培养1小时以恢复细胞生长。
  8. 取100 μl复苏后的菌液涂布于含50 μg/ml卡那霉素的溶菌肉汤（LB）琼脂平板，37 °C过夜培养。
  9. 次日，从LB琼脂平板挑取单菌落接种至6 ml含50 μg/ml卡那霉素的超级肉汤（SB）或LB培养基中，37 °C过夜培养。
    注意：可在小量提取质粒前，使用引物5’ XmaI-EmGFP和3’ SacI-EmGFP进行菌落PCR以鉴定阳性克隆。
  10. 通过小量质粒提取法纯化pET-2F-ZiF-EmGFP，并使用T7启动子引物（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）进行DNA测序以确认质粒构建正确。

2. 表达与纯化

  1. 解冻50 μl化学感受态BL21 E. coli 将细胞置于冰上，轻轻加入100 ng pET-2F-ZiF-EmGFP质粒。按步骤1.7–1.8所述进行转化。
  2. 次日，取单菌落接种于10 ml含50 μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37 °C振荡过夜培养。
  3. 次日，将10 ml过夜培养物稀释至1 L LB培养基中，LB培养基中添加50 μg/ml卡那霉素、0.2%葡萄糖和100 μM ZnCl₂2在37 °C下振荡培养，使菌液在600 nm处的光密度（OD600) 达到 0.8 后，加入 2 mM 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。在 37 °C 下继续培养 6 小时后，于 4 °C 下以 5,000 × g 离心 10 分钟收集细胞。
    注意：诱导条件差异较大，取决于所表达蛋白的稳定性。监测OD600 每30分钟一次，直至OD600 达到0.8时。
  4. 将细胞沉淀重悬于 5 ml 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl₂, 10% 甘油，1 mM β-巯基乙醇，0.5% NP-40，1× 蛋白酶抑制剂）中。2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），1 mM MgCl2，1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 10 mM 咪唑，pH 8.0）。将细胞置于冰上，采用以下条件进行超声破碎：输出功率 50%，处理时间 4 分钟，工作 5 秒、间歇 10 秒。避免溶液过热。
  5. 在 4 °C 条件下，以 25,000 x g 离心细胞裂解液 30 分钟，将上清液转移至新的收集管中。为获得最佳效果，后续所有步骤均应在 4 °C 下进行。
  6. 将上清液通过预装有1 ml平衡好的Ni-NTA悬浊液的层析柱。用20 ml洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，100 μM ZnCl₂）洗涤树脂。2，1 mM DTT，1 mM MgCl2 和 30 mM 咪唑，pH 8.0）
  7. 用 5 ml 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，100 μM ZnCl₂）洗脱蛋白质2，1 mM DTT，1 mM MgCl2，以及 300 mM 咪唑，pH 8.0）。
  8. 用储存缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，100 μM ZnCl₂）对洗脱的蛋白质进行缓冲液置换2，1 mM DTT，1 mM MgCl2 含10%甘油，pH 8.0）中，并使用离心浓缩器根据制造商说明书通过离心浓缩蛋白至至少40 μM。
  9. 通过BCA法或Bradford法测定蛋白浓度。取2 μl纯化蛋白与2 μl 2× SDS-PAGE上样缓冲液混合，95 °C煮沸10分钟，随后在4%–20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上电泳以检测蛋白纯度（图2).

3. 蛋白质储存

  1. 将浓缩的蛋白质分装，用液氮速冻后于 -80 °C 保存。对于 EmGFP 融合蛋白，需用铝箔包裹管子，以避免蛋白暴露于光照下。
  2. 避免蛋白质溶液反复冻融。注意：ZiF 融合蛋白在上述条件下至少可稳定保存 1 个月。不当保存或 >4 个月的长期保存可能导致蛋白质沉淀或 EmGFP 发生光漂白。

4. 蛋白质转导

  1. 在含有10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% 抗生素-抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的完全湿润环境中培养HeLa细胞。
    注意：传代超过30次的细胞不推荐用于蛋白质转导。
  2. 在25 °C下，用500 μl浓度为50 μg/ml的多聚赖氨酸预包被24孔板，孵育30至60分钟。以每孔2 × 105个细胞的密度将细胞接种至24孔板中。接种后24小时，或当细胞融合度达到80%-90%时，吸除各孔中的培养基，并用500 μl预热的无血清DMEM（SFM）洗涤一次。
  3. 向每孔加入含2 μM ZiF-EmGFP蛋白和100 μM ZnCl2的250 μl SFM。在37 °C孵育1小时。注意：ZiF结构域主要通过巨胞饮作用进入细胞34，这是一种依赖能量的过程。因此，必须在37 °C孵育细胞，以实现高效的蛋白质内化。
  4. 吸除培养基，用含0.5 mg/ml肝素的无钙、无镁杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞三次，每次500 μl。注意：肝素对于去除可能干扰后续分析的细胞表面结合蛋白是必需的。
  5. （可选）可重复处理最多三次，以增强递送效果。
  6. 用0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C消化2分钟，立即在肝素洗涤后分离处理过的细胞。将脱落的细胞重悬于含1% FBS的0.5 ml DPBS中。
  7. 使用异硫氰酸荧光素（FITC）通道通过流式细胞术35测定各样本的荧光强度（图3）。调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），使目标细胞群位于量程范围内，确保具有不同特性的细胞群彼此分离。
  8. 每样本收集10,000个活细胞事件，并使用流式细胞术数据分析软件36分析数据。将经ZiF-EmGFP处理的HeLa细胞的荧光信号归一化至仅用SFM处理的细胞。

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结果

可表达双指ZiF-EmGFP融合蛋白 E. coli 与 >95% 纯度及高产量（>25 mg/ml) (图2）。通常情况下，单指和双指ZiF融合蛋白的表达量几乎与野生型未修饰蛋白相当。然而，在某些情况下，五指和六指ZiF融合蛋白的表达产量不足以满足后续应用的需求。

在37 °C条件下，将双指ZiF-EmGFP蛋白直接作用于HeLa细胞90分钟，可导致EmGFP荧光呈剂量依赖性增强（图3A）。关键的是，在缺乏ZiF结构域的情况下未观察到任何荧光信号。我们先前发现，仅用2 μM双指ZiF-EmGFP蛋白处理后，几乎所有细胞均呈现荧光；且当ZiF融合蛋白浓度低至0.25 μM时，HeLa细胞仍可检测到EmGFP荧光（图3B）。

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讨论

本文介绍了一种利用可穿透细胞的锌指（ZiF）结构域进行蛋白质递送的分步实验方案。ZiF结构域不会降低融合酶类货物的活性34；能够以接近未修饰蛋白的产量实现蛋白质的表达与纯化；并且可将蛋白质和酶高效地导入多种细胞类型，其递送效率超过传统的细胞穿透肽或蛋白质转导结构域系统。综上所述，这些结果表明ZiF结构域在介导蛋白质直接递送入细胞方面具有广泛的应用潜力。

尽管由三个和四个锌指（ZiF）结构域组成的扩展阵列带有更高的正电荷，但此前实现最大蛋白递送效率时仅使用了双指ZiF结构域。这些结果表明，ZiF介导的细胞摄取可能受到除电荷以外其他因素的影响，包括蛋白质稳定性或构象刚性。研究还发现，ZiF结构域介导的蛋白递送具有能量依赖性，因此所有经蛋白处理的细胞均需在37 °C条件下孵育。通过使用针对不同内吞途径的小分子抑制剂，发现巨胞饮作用以及（程度较轻的）小窝蛋白依赖性内吞作用是ZiF介导细胞进入的主要途径34。值得注意的是，与其他蛋白转导系统不同，ZiF结构域能够高效地从内体中逃逸，从而介导融合的大分子货物在细胞质中的高水平递送，凸显了这些结构域在实...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（DP1CA174426，授予 Carlos F. Barbas）和中国上海科技大学（授予 J.L）资助。分子图形使用 PyMol 生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
XmaI新英格兰生物实验室R0180L
SacI新英格兰生物实验室R0156L
Expand High Fidelity PCR 系统罗氏11759078001
dNTPs新英格兰生物实验室N0446S
4%-20% Tris-甘氨酸迷你蛋白凝胶，1.5 mm，10 孔Life TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli 上样缓冲液BioRad161-0737
T4 DNA 连接酶Life Technologies15224-017
BL21 (DE3) 感受态 E. coli新英格兰生物实验室C2527I
IPTGThermo ScientificR0391
氯化锌Sigma-Aldrich208086-5G
硫酸卡那霉素费舍尔科技BP906-5
葡萄糖Sigma-AldrichG8270-100G
Tris 碱费舍尔科技BP152-25
氯化钠Sigma-AldrichS9888-25G
DTT费舍尔科技PR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA 琼脂糖树脂QIAGEN30210
甘油Sigma-AldrichG5516-500ML
咪唑Sigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 离心滤过装置EMD MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
胎牛血清Life Technologies10437-028
抗生素-抗真菌剂 Life Technologies15240-062
24 孔平底培养板Sigma-AldrichCLS3527-100EA
多聚赖氨酸Sigma-AldrichP7280
不含钙、镁的 DPBSLife Technologies21600010
硫酸乙酰肝素Sigma-AldrichH4777
胰蛋白酶Life Technologies25300054
HeLa 细胞ATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 分光光度计 Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28704

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