一种利用电穿透图（EPG）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

摘要

电穿透图谱（EPG）是一种研究具口针昆虫取食行为的成熟技术。本文展示了EPG作为一种非侵入性工具的新应用，用于获取植物韧皮部筛管元件（SEs）的细胞内电生理记录，筛管元件是构成植物韧皮部维管组织的细胞。

摘要

细胞的电生理特性常被研究 体外，从其原始环境中分离后。然而，要研究生物体内远距离细胞之间的电传递，则需要 体内，无伪迹地记录嵌在天然环境中的细胞。植物受伤区域向未受伤区域传递电信号的现象长期以来一直引起植物学家的兴趣。韧皮部是遍布植物体内的活体维管组织，被认为在植物电信号传导中起主要作用。然而，由于缺乏合适的电生理学方法，研究韧皮部细胞的电学特性面临诸多挑战。 体内. 本文介绍了一种利用活体蚜虫或其他韧皮部取食型半翅目昆虫整合到电穿透图谱（EPG）电路中，用于筛管分子（SEs）细胞内电生理研究的新方法。该方法具有多功能性、稳定性和高精确度，使得能够详细记录和研究模式植物主脉筛管分子中由伤口诱导产生的电信号 拟南芥¹在此，我们展示了EPG电极可轻松用于边缘叶脉中筛管分子（SEs）的细胞内电生理记录，并可用于研究SEs对多种外界刺激产生电信号反应的能力。将EPG技术应用于SEs的细胞内电生理学研究，可广泛适用于多种植物物种、大量的植物-昆虫组合以及多种研究目的。

引言

产生远距离电信号的能力是一种多细胞生物的有利性状，使其能够高效地响应外界刺激。这一性状在植物和动物中独立演化，因此属于趋同演化的案例。鉴于动物中的电信号与神经传导和肌肉收缩等重要功能密切相关，动物中由刺激诱导的电信号的分子基础、传递机制及其功能一直是深入研究的课题。相比之下，植物中由刺激诱导的电信号研究较少。尽管植物没有神经或肌肉，但已有足够证据表明，植物中由刺激诱导的电信号在其对环境因素的响应中起着关键作用。

韧皮部作为植物维管组织的活体组成部分，被认为是刺激诱导的电信号从受刺激/受损区域向未受刺激/未受损区域传递的主要媒介²韧皮部中的主要细胞是筛管分子（SEs），这类细胞结构相对简单，呈长形。SEs的末端与其他SEs相连，形成贯穿植物体的连续低电阻筛管系统。然而，针对这些高度特化细胞的电学特性研究甚少。在以往的研究中，研究人员通常使用玻璃微电极进入SEs³ 或使用与蚜虫插入植物的吻针相连的玻璃电极，在吻针切断后进行⁴玻璃微电极由玻璃毛细管制成，将毛细管一端经加热拉制成直径小于1 µm的细尖，然后充入KCl溶液。将一根Ag/AgCl或铂丝插入充有KCl溶液的玻璃电极内，并连接至放大器输入端，参考电极则插入待测细胞周围的浴液中，从而构成完整电路。该装置用于记录细胞外参考电极与细胞内测量电极之间的电位差。 即， 细胞的膜电位⁵利用该方法，Umrath 首次对植物细胞进行了细胞内记录，所用材料为藻类 Nitella^6,7. Nitella 是一种结构相对简单的生物，其细胞较大，因此适合进行细胞内电生理实验。相比之下，将玻璃微电极插入多细胞、三维结构的陆生植物的微小细胞中在技术上具有较高难度，需要研究人员具备高超的操作技能，同时还需要配备先进的显微成像系统、显微操作装置以及防震设备。尽管玻璃电极适用于记录植物表层细胞的电活动，例如根表皮细胞⁸，对深埋于植物组织内的细胞（如筛管分子）进行细胞内记录时，极有可能引发由损伤导致的响应，从而干扰实验结果。1989年，Fromm和Eschrich报道了一种替代方法，称为“蚜虫法”，该方法在切除蚜虫口针后，将玻璃电极与蚜虫口针相连接⁴蚜虫法具有较低的侵入性，因为其柔韧的口针不会像玻璃电极那样对组织或细胞造成损伤。蚜虫口针是自然界为植物穿刺而精巧设计的工具，蚜虫在寻找筛管（SE）方面远比人类更为熟练。然而，该蚜虫法在技术熟练度和设备方面要求极高。此外，每次采用该技术的实验成功与否，完全取决于蚜虫在进行口针截断术（stylectomy）时是否正处于取食状态——即口针稳定插入筛管内。回顾性思考，可以看出，若在实验装置中增加一种能够判断蚜虫口针是否已进入筛管的仪器，则该技术的成功率有望得到提升。

1964年，McLean 和 Kinsey 描述了一种用于实时研究蚜虫取食行为的“电子监测系统”^9,10在此系统中，蚜虫和被其口针刺入的植物被整合到一个电路中。随后在1978年，Tjallingii 设计了一种该系统的改进版本，称为“电穿透图”（Electrical Penetration Graph，EPG）系统。^11,12而最初的电子监测系统仅对由电阻产生的电位敏感，使用EPG系统后，可检测由电动势（emf）产生的电位， 即， 在植物或昆虫体内产生的电位，除了可记录蚜虫体内由抗性（R）产生的电位外，还可被记录下来。这一改进意义重大，因为电动势（emf）和电阻（R）这两个信号组分均可提供蚜虫刺探植物过程中相关生物学事件的重要信息。EPG前置放大器之所以对R组分敏感，是因为其输入电阻相对较低，为1 GΩ，接近植物与蚜虫电阻的平均水平。微小的偏移电压（图 1，施加约+100 mV的电压至植物，该电压随后在植物与昆虫一侧，以及输入电阻另一侧之间分配。在某一点测量电压及其变化图1A,B）之间，位于昆虫与输入电阻之间。因此，R组分代表了蚜虫-植物电阻对偏移电压的调节，而电动势（emf）组分则是蚜虫口针尖端处植物电位以及昆虫体内产生的电位的特定组成部分。其中最为相关的植物电位主要是蚜虫口针穿刺的植物细胞的膜电位；昆虫体内的电位则主要由口针内两条导管中液体流动所引起的流动电位构成。 即， 食物和唾液管；在EPG中未记录到内部神经或肌肉电位。实际上，口针尖端起到电极尖端的作用。相对于细胞外部的正电荷，所有植物细胞内部均带负电荷。电流（即， 带电离子在水溶液中的移动）从内部流向外部 反之亦然 由于细胞膜的高电阻性，离子跨膜流动非常有限。通常情况下，静息电位保持恒定。然而，当负离子向外移动或正离子向内移动通过细胞膜时，膜电位会降低。 即， 细胞发生“去极化”。当细胞受到刺激而兴奋时，就会发生去极化。此时，若细胞膜上的特异性离子通道打开，或膜结构受损导致离子外泄或内流，离子便会进出细胞。所有细胞的质膜上均含有离子通道和离子泵，可通过恢复细胞内各种离子的原始浓度，使膜电位恢复至静息水平。静息电位及其变化属于电动势（emf）的组成部分，因此，EPG技术适用于测量这些电位变化。

图1. EPG-电极EPG电极是由一只活体蚜虫整合到电穿透图谱（EPG）电路中构成的，其口针插入筛管分子（SE）并处于稳定取食状态。若被口针刺入的筛管分子处于静息状态（图A），则EPG记录到的电路电压稳定，处于静息电位水平（图C，静息）。当筛管分子受到刺激时，其膜发生去极化（图B），在EPG图谱上表现为电压的逐渐升高（图C，去极化）。随着筛管分子内离子平衡恢复至静息状态， 即， 当其复极化时，EPG记录到的电压逐渐下降至静息电位水平（图C，复极化）。图C中，“A”和“B”分别对应图A和图B所示的情况。V = 可调偏移电压源。Ri = 输入电阻。放大器并联了一个1 GΩ的外部电阻，同时其内部（运算放大器内）含有一个1.5 TΩ的高阻值电阻（图A和图B中以灰色表示）。通过远程控制开关，EPG前置放大器可从正常模式切换至emf模式，从而获得高精度的电压值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

在下一节中，我们将为读者提供一个进行EPG实验的基本方案，该方案适用于以昆虫为重点和以植物为重点的研究。

方案

1. 蚜虫饲养

注意：EPG 记录中植物和蚜虫物种的选择取决于研究目的。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，选用菜缢管蚜（Brevicoryne brassicae）是合适的。

1. 在温室中以Brassica oleracea饲养B. brassicae蚜虫。将用于饲养蚜虫的植株置于防虫网罩中，以避免污染其他植株。将蚜虫饲养植株与实验用植株（本实验中为B. oleracea和A. thaliana）分别放置于不同房间，以防止实验植株被蚜虫污染。
2. 大约每两周将蚜虫转移至新鲜植株一次，以避免造成严重的植株损伤或种群过度繁殖。每次转移10–20只成年蚜虫至新的饲养植株，以建立新的种群。
3. 定期检查饲养植株，防止其他蚜虫种类、昆虫植食者、蚜虫寄生蜂以及可能影响蚜虫种群健康的真菌污染。
4. 用于EPG记录的蚜虫应为最后一次蜕皮后一周内的成年无翅型个体。
5. 实验结束后，将未使用的实验植株放回生长室，因为这些植株上通常已产生部分子代，若不妥善处理可能意外污染其他植株。

2. 用于EPG记录的昆虫接线

1. 制作昆虫电极时，需准备黄铜连接针（钉子，直径 1.2 mm）、细铜线（直径 0.2 mm）、极细金线（直径约 20 µm）、水性银胶、带助焊剂和树脂芯焊锡丝的简易小型烙铁、10倍放大倍率的体视显微镜、小剪刀或解剖刀、两把精细镊子，以及聚苯乙烯泡沫板或泡沫箱。注意：漩涡振荡器可能有用。注意：制作电极的分步操作流程见于 图2.
2. 用于蚜虫操作和胶水涂抹，需准备：小型柔软的水彩骆毛笔（2号或更小）以及昆虫针，例如用于昆虫标本采集的昆虫针，细缝纫针或牙签也可替代使用。第4步展示如何开始EPG记录。
3. 步骤1。
   注意：以下步骤1和步骤2展示如何制备昆虫电极（不包括蚜虫）。步骤3展示如何将蚜虫连接至电极。在进行电极连接时，建议使用真空固定装置固定蚜虫，但对于移动缓慢的物种并非必需。例如， B. brassicae).
   1. 打开焊枪电源，将其尖端接触焊锡丝以熔化少量焊锡图 2A）。用一些助焊剂润湿黄铜连接针的头部（图 2B）并将其浸入熔化的焊料金属中（图 2C).
   2. 在一段长1-2 cm的细铜丝一端涂覆一层熔融的焊料金属图 2D）。然后将针和铜线一起接触灼热的螺栓（图 2E）并将它们一同移开以冷却并固化（图 2F).
4. 步骤 2.
   1. 充分振荡（或涡旋）银胶小瓶数分钟，直至形成均匀乳液。在体视显微镜的载物台上，用剪刀或手术刀截取数段长约1.5 cm的金丝图 2G).
   2. 取一根带焊接铜线的黄铜针（按2.3节制备），将铜线的自由端浸入样品瓶瓶盖内侧开口后积聚的小量银胶中图 2H）。注意：仅需少量液滴。
   3. 将蘸有胶水的铜丝末端移至金丝上，同时抬起一端以避免胶水沾到体视显微镜的物镜载片上。尽量使铜丝与金丝重叠数毫米图 2I），将胶水涂布于两根金属丝的重叠部分。
   4. 等待胶水充分干燥，以确保导线保持连接。干燥后检查胶水接触情况，若发现连接处的导线有未被胶水覆盖的部分，可用细针或其他细铜丝添加少量新鲜胶水。
   5. 昆虫电极制备完成后，可将其插入一块聚苯乙烯泡沫中存放。
      注意：金线的长度将决定蚜虫的活动自由度：如果金线过短（小于5 mm），蚜虫可能会感到受限，无法正常活动；如果金线过长（>2 cm），蚜虫将自由移动。若条件允许，蚜虫倾向于移动至叶片的近轴面。若金线接触到叶片，信号将发生短路。
5. 步骤 3。
   1. 蚜虫可通过轻微吸力固定，使用真空装置；此时，将吸力装置安装在体视显微镜下方。将吸力开口置于视野中央。
   2. 将装有银胶的小瓶充分振荡数分钟（或使用涡旋振荡器），直至形成均匀乳液。用小毛刷采集一只蚜虫。
   3. 打开抽吸装置，将蚜虫置于抽吸口上（图 2J），使腹部背面朝向实验者。用细刷除去腹部表面的蜡质（甘蓝蚜虫中较为丰富）。
   4. 打开胶水小瓶，用微量银胶润湿一根细针图 2K）。将一滴银胶涂在蚜虫腹部的背面（图 2L-M）。让液滴完全干燥数分钟，再次剧烈震荡胶水小瓶，然后在第一滴银胶上再添加第二滴银胶。注意：银胶虽为电导体，但不会对昆虫的外骨骼造成明显损伤。
   5. 关闭胶水瓶后，将金线的自由端插入湿润的液滴中，并保持金线静止，直至胶水完全干燥（图 2N）。避免将胶水沾到蚜虫的足或触角上，若发生此情况，则弃用该蚜虫。
   6. 关闭吸力固定装置，并小心地提起昆虫（图 2O如有需要，可使用细毛刷辅助将蚜虫从吸虫装置上取下。
      注意：接线 B. brassicae 不需要使用真空装置，因为可以将蚜虫固定在一块精密实验室擦拭纸上，其粗糙的表面为蚜虫提供了足够的附着力，使其在腹部滴加湿胶后不会被抬起。待胶水干燥后，可用细毛刷将蚜虫从擦拭纸上轻轻提起。
   7. 将带有导线的昆虫插入泡沫塑料中，并根据需要，继续为其他所有用于EPG记录实验的昆虫进行导线连接。
      注意：这些蚜虫接线方案对我们的实验效果良好。使用者可自行探索适合的蚜虫接线方法。
6. 步骤 4。
   1. 将植物放入法拉第笼中（图 2P使用非导电性材料作为支撑：可采用培养皿或玻璃、塑料板。
   2. 将植物电极插入每个花盆的土壤中。将连接导线的昆虫上的黄铜针插入EPG前置放大器的输入连接口图 2Q）。注意：土壤电极并不等同于其他电生理技术中使用的接地电极，它具有调节和补偿电极极化电压所需的偏移电压。
   3. 在采集软件 Stylet+ 界面上，以固定的 100 Hz 采样频率，输入文件名，设定记录时间，并填写文本以注明实验细节（处理方式、植物/昆虫种类， 等等。在第2行和第3行的注释中。
   4. 将昆虫放置于植物上合适的着陆区域，然后点击采集软件（Stylet+）界面上的“开始”按钮，启动记录过程。
      注意1：EPG实验设置中最多可同时使用8个通道。每株植物可使用一个或多个EPG电极。
      注2：当研究重点为蚜虫行为时，应在蚜虫接触植物前开始记录，以避免遗漏最初的植物刺探活动。
   5. 为研究SEs对刺激的电生理反应，需在蚜虫进入韧皮部阶段后至少等待10分钟，以确保蚜虫处于持续的韧皮部取食阶段且信号基线稳定。只有在此之后，方可开始任何植物刺激实验。

图 2. 利用蚜虫或其他半翅目昆虫制作EPG电极，用于电穿透图谱（EPG）记录。 请点击此处查看此图的高清版本。

图 A-I 展示了制备 EPG 电极（不含蚜虫）所需的步骤。首先，在焊接螺栓的尖端熔化一小块焊料金属（A）。然后，将黄铜针的头部浸入一滴助焊剂中（B），并使其接触焊接螺栓尖端的熔融金属（C）。在此步骤完成后立即进行下一步：将一根铜线的末端接触焊接螺栓的尖端，以将其粘接到黄铜针的头部（E-F）。使用解剖刀或刀片截取一段金线（G）。将铜线的自由端（另一端已连接至黄铜针）浸入银胶中（H），并在银胶干燥前迅速将金线连接到该端（I）。金线是一种优良的导体，且可被极化。实际上，在大多数情况下，这种极化程度极小，难以检测；若存在，可通过偏移电压（V）进行补偿。

图示 J-O 为将蚜虫（或其他半翅目昆虫）连接至电极所需的步骤。首先，使用细毛水彩画笔小心地提起一只蚜虫，并将其放置在真空吸力装置的开口处（J）。打开真空泵，并用一小片纸覆盖气阀孔以产生吸力。在体视显微镜下，将昆虫针的尖端蘸取银胶（K），然后在蚜虫腹部顶端滴加少量银胶（L-M）。在接下来约 20 秒内，趁蚜虫身上的银胶尚未干燥，将昆虫电极的金丝末端插入湿润的银胶液滴中，并保持固定 1–3 分钟，直至银胶完全在空气中干燥（N）。此时，通过移除覆盖吸力装置气阀孔的纸片来关闭吸力，并小心地将蚜虫从吸力装置上取下：接线完成后提起蚜虫时常需借助细毛画笔辅助操作（O）。

图P展示了屏蔽室内整个EPG系统的设置概览，图Q展示了用于EPG的植物-蚜虫组合概览。有关此过程的更详细说明，请参见上述第2节。

小写字母为制作EPG电极所需物品的标签：a：焊接螺栓；b：熔化的焊料；c：助焊剂；d：黄铜连接针（钉）；e：铜线；f：直径 18µm 的金线；g：吸液装置；h：蚜虫；i：水性银胶；j：法拉第笼；k：植物电极；l：EPG前置放大器的输入连接器（BNC）。

结果

在之前的一项研究中，我们采用了EPG电极技术，旨在表征毛虫攻击期间中脉筛管分子（SEs）产生的电信号¹。中脉是传统玻璃电极以及玻璃微吸管电极的首选插入位点，因为该区域筛管分子密集且结构相对坚固，便于实施这些技术所需的固定操作。在此，我们利用EPG电极的多功能性，获取更难接近的筛管分子（特别是叶片边缘叶脉中的筛管分子）的电生理信息。图3展示了来自拟南芥（A. thaliana）植物边缘叶脉筛管分子的典型EPG记录，其中包含由远端创伤诱导的电信号。与主脉筛管分子不同，边缘叶脉中的筛管分子对远距离损伤产生单一、缓慢的去极化波，该波可能对应于中央筛管分子中的缓慢去极化波。平均而言，这种在叶缘筛管分子中由远端诱导的缓慢去极化波持续时间为61 ± 27秒，平均振幅为37 ± 2 mV（n = 3，均值 ± 标准误）。这些通过EPG电极易于获得的数据表明，创伤诱导的电信号可在未受伤叶片中从主维管束传播至细小叶脉的韧皮部。

我们还利用了EPG电极的稳定性，探究一个筛管分子（SE）是否能在数分钟的时间间隔内响应多种损伤刺激。当...

讨论

本文提供了一种进行电穿透图（Electrical Penetration Graph，EPG）记录的详细实验方案。EPG技术已得到广泛应用，全球约有100至200名活跃用户，并已被用于多个不同领域的研究，例如：a）寄主植物对蚜虫及其他具刺吸式口器昆虫的抗性研究¹³；b）植物病毒与病原体传播机制的研究¹⁴；c）杀虫剂作用机制（包括毒性和行为变化）的研究¹⁵；d）EPG甚至被用于证明蚜虫之间的争斗对获胜个体有利，因其可提高取食效率¹⁶。

学习如何为昆虫连接EPG记录导线并不困难，但需要耐心和实践经验才能掌握。从制作电极到最终完成昆虫接线，建议进行为期一至两周的练习。在此期间，研究人员将熟悉所选昆虫物种的操作方法，并能够顺利地完成所有步骤。关键步骤包括：正确进行焊接、在取用银胶前充分摇匀试剂瓶，以获得大小适中的胶滴（既不能太小也不能太大）、确保良好的电学和机械连接，以及将金丝准确放置于昆虫腹部的银胶滴内，同时避免限制昆虫的活动。若这些步骤操作不当，将导致电连接不良，从而产生质量差或无法接受的数据。当将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黄铜连接针	EPG Systems/hardw.shop		Φ 1.2 mm
细铜丝	EPG Systems/hardw.shop		约 Φ 0.2 mm
细金丝	EPG Systems		Φ 18 µm
焊剂	五金店		与焊锡丝匹配
树脂芯焊锡丝	五金店
泡沫塑料板	任意品牌
水性银胶	EPG Systems		配方见：www.epgsystems.eu
纸巾	Kimberly-Clark	5511
焊接螺栓	任意品牌
体视显微镜	Hund Wetzlar		最低放大倍数为10倍
小型剪刀	Fine Science Tools	14088-10
手术刀	Fine Science Tools	10050-00
精细镊子	Fine Science Tools	11231-20
涡旋振荡器	A. Hartenstein	L46
水彩画笔	任意品牌		1号或2号
空气抽吸装置			参见说明：www.epgsystems.eu
昆虫针	任意品牌		1号或2号
稳固的实验台
法拉第笼			手工制作
计算机	Fujitsu Siemens
数据采集软件	EPG Systems		Stylet+d
Giga-4 (-8) 完整系统	EPG Systems
包含以下组件：
带USB输出的主控箱		Di155/Di710	12/14 位，采样率 100 Hz（软件固定）
EPG 探针 4（8）个			50倍直流前置放大器
杆上旋转夹具
直流电源适配器			双极性，230/115 VAC 转 -/+8 VDC
植物电极及连接线
额外的测试和接地电缆