人源单克隆抗体的合成是研究自身抗体介导的免疫反应病理生理机制的首要步骤。我们已建立一种从分选的血液B细胞中制备重组人免疫球蛋白G（IgG）单克隆抗体的实验方案，包括B细胞分离、抗体克隆及 体外 合成
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本文内容
摘要
摘要
寻找生成人单克隆抗体的新方法是一个活跃的研究领域，对基础科学和应用科学（包括免疫治疗药物的开发）均具有重要意义。然而，用于鉴定和生产此类抗体的技术往往较为繁琐，有时还会导致抗体的重链与轻链配对分离。本文介绍一种相对简单、直接的方案，即利用EB病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）感染并结合Toll样受体9激活，从人外周血单个核细胞中制备人源重组单克隆抗体。通过适当的染色标记，可分离出产生抗体的B细胞，进而进行永生化和克隆扩增。由永生化B细胞克隆所产生的抗体转录本可通过PCR扩增，测序获得对应的重链和轻链配对序列，并克隆至免疫球蛋白表达载体中。利用该技术获得的抗体可成为研究相关人类免疫应答（包括自身免疫）的有力工具，并为新型治疗药物的开发奠定基础。
引言
本文的目的是详细描述一种从人外周血单个核细胞（PBMCs）中获取并表征人源IgG单克隆抗体的方法学。
研究人类抗体的兴趣已在多个研究领域中不断增长。特别是，许多研究团队关注由自身抗体引起的病理机制1-3。我们已克隆并表征了致病性自身抗体1。对自身抗体的研究有助于鉴定其靶标，并开发治疗策略，例如，使用竞争性抗体4。此外，人类抗体的研究在其他研究领域也具有重要意义，即，评估疫苗接种后的免疫应答5，表征暴露于特定病原体后产生抵抗力的个体的抗体谱型6，或研究天然抗体库中存在哪些抗体7,12。
已开发出多种技术用于生成重组人源单克隆抗体8-12；其中大多数技术采用噬菌体展示和B细胞永生化方法。噬菌体展示技术已广泛应用于新抗体的发现13。然而，该方法存在一个主要缺点，即人免疫球蛋白的重链和轻链 在过程中会发生解离。利用人B细胞生成杂交瘤或EBV转化可克服这一缺陷。
我们采用EBV感染胸腺B细胞，并结合通过Toll样受体9（TLR-9）进行的多克隆B细胞刺激6,12。
本文详细描述了我....
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方案
已获得研究参与者的知情同意。本研究经机构伦理委员会批准。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
- 在采血后尽快将25 ml 受试者的肝素抗凝血以900 × g离心15分钟。若血液量较少，应相应减少试剂用量。所有后续操作均需在生物安全柜中进行。
- 将血清转移至洁净离心管中。该血清可用于后续步骤中PBMC的冻存，或针对自身免疫性疾病患者用于检测自身抗体。
- 用10 ml RPMI 1640培养基稀释血液，并通过反复吹打重悬细胞。
- 向一个新的50 ml 离心管中加入15 ml 含多蔗糖和泛影酸钠（密度为1.077 g/ml）的溶液。
- 将步骤1.3中的血液轻柔地叠加至步骤1.4的溶液上方：将两支离心管管口靠近，使液体缓慢接触，然后缓慢倾注PBMC悬液至50 ml 离心管液面上方。此步骤对实现PBMC的良好分离至关重要。
- 将步骤1.5获得的离心管在室温下以400 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
- 离心结束后，用移液器小心吸取管中部出现的白色环状层，其中含有PBMCs。
- 用25 ml RPMI 1640培养基洗涤细胞。
- 在室温下以300 × g离心10分钟。
- 弃去上清液，用10 ml RPMI 1640培养基....
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结果
染色CD22和IgG阳性细胞后的分选设门策略如图1所示。该图中，双阳性细胞（即产生IgG抗体的B细胞）区域被选中，以将所有此类细胞分选至单独的离心管中。在分析中，该双阳性细胞群约占总PBMCs的1%。所获得的分选细胞数量将取决于第1节中获取的细胞数量。
EBV 永生化和 CpG（ODN2006）刺激处理 5 周后的不同结果如图 2所示。检测生长中的克隆较为容易：Wi38 饲养层细胞呈更长的成纤维细胞样形态，而 B 细胞克隆则表现为非常小的圆形细胞，聚集生长在圆底多孔板的中央区域。在此阶段，可明显观察到部分克隆开始生长。然而，生长速度可能存在差异，且某些含有永生化细胞的孔中可能完全无细胞生长。
如表2所示，通过ELISA检测增殖克隆的上清液以鉴定IgG。该ELISA中同时检测IgG的标准曲线、克隆上清液以及空白对照。当ELISA检测值高于空白对照值3个标准差时，判定为阳性克隆；阴性克隆的检测值则低于空白对照3个标准差。为确认结果.......
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讨论
本文详细介绍了从人外周血单个核细胞（PBMC）产生IgG抗体的全部步骤。该方案相较于先前发表的技术具有一些优势。其中一项优势是，所产生的抗体保留了B细胞克隆中原始配对的重链和轻链。IgG抗体的鉴定可适用于任何类型的人类供体，且无需通过疫苗接种来增强免疫反应5。使用wi38成纤维细胞系作为饲养细胞，能够更快速地检测到生长中的克隆，因为它们在形态上与PBMC明显不同，易于区分，而此前报道的研究中所使用的饲养细胞为PBMC1,6-8。此外，使用wi38作为饲养细胞有利于大量细胞分装物的冷冻保存，可在每次实验前方便地解冻并进行培养。
本方案中的一个关键步骤是起始材料：外周血单个核细胞（PBMCs）。如果血液在离心前放置时间过长，或在PBMC提取后未保存于适当的冷冻条件下，则活细胞数量将减少，从而导致获得的IgG抗体产生型B细胞克隆数量下降。因此，为确保实验成功，建议尽早提取并妥善保存PBMCs。实验开始时IgG产生型克隆的数量受限于初始PBMC的数量；PBMC数量越多，获得的IgG产生型克隆数量也越多，抗体产物的多样性也越高。另一个关键步骤是抗体.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
西班牙国家卫生研究所（ISCIII）米格尔·塞尔韦特研究合同（CD14/00032）资助（G.N.-G.）。荷兰科学研究组织“转化神经科学研究生项目”奖学金（022005019）资助（C.H.）。
Prinses Beatrix Fonds 基金会（项目编号 WAR08-12）和法国肌病协会（Association Française contre les Myopathies）向 P.M.-M. 提供的资助；以及荷兰科学研究组织（Netherlands Organization for Scientific Research）Veni 人才项目（916.10.148）、荷兰脑基金会（Brain Foundation of the Netherlands，项目编号 FS2008(1)-28）和 Prinses Beatrix Fonds 基金会（项目编号 WAR08-12）向 M.L. 提供的资助。
我们感谢 Jozien Jaspers 在通过流式细胞术进行 B 细胞分选方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 含多蔗糖和泛影酸钠的溶液 |
| FACSAria II 细胞分选仪 | BD Biosciences | ||
| 96 孔 U 型底微量培养板 | Costar | 3799 | |
| 高级罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640 培养基 | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| B95-8 细胞系含 EB 病毒的上清液（30% v/v） | ATCC | CRL-1612 | 3.4 × 10⁸ 拷贝/mL |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 细胞 | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| 白细胞介素-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA 板 | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')₂ 片段山羊抗人 IgG、Fcγ 片段特异性（未偶联） | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% 脱脂干奶粉（印迹级封闭剂） | Biorad | 170-6404 | |
| 人 IgG | Sigma | I 2511 | 纯化的人免疫球蛋白 IgG，5.6 mg/mL |
| 山羊 F(ab)2 抗人 IgG Fcγ（与过氧化物酶（PO）偶联） | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA 读板仪（Perkin Elmer 2030） | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| 过氧化物酶偶联的 AffiniPure 兔抗人 IgM、Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA 合成系统 | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 系统 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA 提取试剂盒 | Roche | 11828665001 | |
| 逆转录系统试剂盒 | Promega | A3500 | |
| 重组 Taq DNA 聚合酶 | TAKARA | R001A | |
| 引物（2 μl） | Sigma | ||
| 超纯琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp DNA 标准分子量标记 | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2（Gel Doc 2000） | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒 | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml 反应板（MicroAMP 光学 96 孔板） | Applied Biosystems | 4346906 | |
| 遗传分析仪 ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α 感受态细胞（E. coli） | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1（4,493 bp） | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4（4,484 bp） | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk（3,875 bp） | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2（3,883 bp） | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC 培养基 | Invitrogen | 15544-034 | |
| 含 Zeocin 的 LB 琼脂培养基（Fast-Media Zeo Agar） | Invivogen | fas-zn-s | |
| 含 Zeocin 的 TB 液体培养基（Fast-Media Zeo TB） | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA 小量提取试剂盒 | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop（ND1000 分光光度计） | Nanodrop | ||
| 含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的 LB 琼脂培养基（Fast-Media Blast Agar） | Invivogen | fas-bl-s | |
| 含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的 TB 液体培养基（Fast-Media Blast TB） | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA 标准分子量标记 | New England Biolabs | N3200S | 0.1–10.0 kb，1,000 μg/mL |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/mL，溶于 10× CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/mL，溶于 10× CutSmart Buffer |
| FastAP 热敏感碱性磷酸酶 | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL，溶于 10× FastAP Buffer |
| DH5α 感受态细胞 | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE 标记小鼠抗人 IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| 抗 CD22，PerCP-Cy5.5，克隆号：HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
参考文献
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S.
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