我们建立了一种利用同轴喷嘴将多能干细胞（PS细胞）包封于海藻酸盐水凝胶微胶囊中的方法。该方法可防止细胞过度聚集，并降低悬浮培养过程中细胞所受的剪切应力。该技术适用于多能干细胞的大规模生产以及干细胞微环境的研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
多能干细胞（PS 细胞）因其在再生医学和药物筛选中的重要作用而成为研究热点。然而，要将 PS 细胞应用于这些领域，需要建立大规模培养系统。悬浮培养是一种有前景的 PS 细胞大规模生产方法，但仍存在一些问题尚未解决，例如细胞聚集体的控制以及培养基剪切力对细胞的损伤。为解决这些问题，我们开发了一种使用同轴喷嘴的海藻酸钙（Alg-Ca）包封方法。该方法通过共流氮气（N2）可轻松控制胶囊的尺寸。由于过高的 N2 气体流速会导致液滴破裂，从而产生粒径不均一的胶囊，因此可调控的胶囊直径必须大于 500 µm。此外，低浓度的 Alg-Na 和 CaCl2 会导致胶囊呈非球形。尽管未包覆海藻酸-聚-L-赖氨酸（Alg-PLL）的 Alg-Ca 胶囊易于溶解，便于细胞回收，但细胞也可能从缺乏 Alg-PLL 包覆层的胶囊中泄漏。事实上，海藻酸-PLL 包覆层虽可防止细胞泄漏，但其结构较难破裂。该技术不仅可用于 PS 细胞的大规模生产，还可用于干细胞微环境的研究，因为包封技术能够调控细胞周围的微环境，包括细胞外基质及分泌因子浓度等。
引言
诱导性多能干细胞（iPS细胞）由于在再生医学中的重要作用，目前正受到广泛研究。然而，组织再生需要大量的细胞。例如，治疗一名1型糖尿病患者大约需要十亿个胰腺细胞1。然而，传统的培养皿培养方法仅能获得1 × 105 个细胞/cm2，因此需要1 m2的培养面积才能获得足够治疗一名1型糖尿病患者的干细胞来源的胰腺细胞。因此，再生医学迫切需要建立一种可用于多能干细胞大规模培养的系统，例如微载体2和悬浮培养。悬浮培养是一种具有前景的大规模培养方法，但在人iPS细胞的直接悬浮培养中，细胞聚集的控制仍具挑战性3。事实上，悬浮状态下的细胞会受到剪切应力的影响，从而导致细胞损伤3或发生分化4。
针对悬浮培养中存在的问题，研究人员已开展基于水凝胶包封技术的研究。在水凝胶微胶囊中，细胞可免受培养基流动的影响。已有文献报道了多种用于细胞包封的水凝胶类型，包括琼脂糖5、聚乙二醇6和海藻酸盐（Alg）。其中，海藻酸钙（Alg-Ca）水凝胶是细胞包封中最实用的水凝胶之一，因为将海藻酸盐溶液滴入氯化钙（CaCl2）溶液后可立即形成Alg−Ca水凝胶，且该凝胶可被酶或螯合试剂快速降解。
本文建立了一种利用同轴喷嘴对诱导多能干细胞（iPS细胞）进行稳定海藻酸盐包封的方法。通过使用N2气体流动形成液滴，可在无需油类等其他试剂的条件下，将细胞包封进均一的微胶囊中。该方法中，N2的流速以及CaCl2和海藻酸盐的浓度是影响微胶囊尺寸、形态和均一性的主要操作参数。本报告通过高速相机和显微镜的使用，展示了对这些操作条件的优化过程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备材料
- 配制 10 mM HEPES 缓冲液。在室温下将 pH 调至 7.0，并加入 NaCl 至 0.9%。
- 通过混合步骤 1.1 中制备的 HEPES 缓冲盐水，配制 5% 海藻酸钠溶液和 10 mM EDTA 溶液。在室温下将 pH 调至 7.0。
- 将试剂（1.1、1.2）在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
- 准备经明胶包被的 60 mm 培养皿，其中铺有 1.2 − 2.0 × 106 只小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），作为饲养层细胞，用含 10% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）和 10 µg/ml 丝裂霉素 C 的 DMEM 培养基孵育 90 – 120 分钟进行处理。
- 将小鼠诱导性多能干细胞（iPS 细胞）接种于含有饲养层细胞的培养皿中，加入 5 ml 高糖 DMEM 培养基，其中含 20% 胚胎干细胞级 FBS、50 µM 2-巯基乙醇、非必需氨基酸以及抗生素（100 Units/ml 青霉素 G 钠、100 µg/ml 硫酸链霉素和 250 ng/ml 两性霉素 B），进行培养。
- 将 4 × 105 个 iPS 细胞接种至明胶包被的 60 mm 培养皿中，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。孵育期间每天更换培养基。培养 3 – 4 天后，在 37 °C 和 5% CO2 条件下，用 500 µl 含 0.02% EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶消化 1 分钟，随后轻拍培养皿十次使细胞脱落。
- 加入 2.5 ml 含 10% 胚胎干细胞级 FBS 和抗生素的 DMEM 培养基（用 1,000 µl 移液器吹打三次，使小鼠 iPS 细胞解离为单细胞），将细胞悬液以 160 × g 离心 3 分钟，弃上清，计数细胞。根据细胞计数结果，将收集的细胞重新接种至明胶包被的培养皿中，孵育 30 分钟，以分离 iPS 细胞与 MEF 细胞。细胞计数后（通常每皿可收集 1 – 3 × 106 个细胞），将 4 × 105 个 iPS 细胞重新接种至培养皿中。
2. 细胞包封至海藻酸盐水凝胶微胶囊中
- 按照1.5和1.6中所述相同步骤收集细胞。在160 × g条件下离心3分钟后，用HEPES缓冲盐溶液洗涤iPS细胞沉淀三次。将细胞重悬于HEPES缓冲盐溶液中后，通过40 µm细胞筛网过滤细胞悬液，以去除可能堵塞喷嘴的大块聚集体。
- 取2 ml 含HEPES缓冲盐溶液的细胞悬液与3 ml 5%海藻酸钠（Alg-Na）溶液混合，最终获得5 ml含3% Alg-Na溶液的细胞悬液。细胞密度宜大于106个细胞/ml。
- 将细胞悬液吸入5 ml注射器后，将同轴喷嘴（图 1A, B）安装在注射器上，并将装置置于注射泵上。向同轴喷嘴的外层针管通入N2气体（流速低于1 L/min），同时将细胞悬液从内层针管挤出。
- 将产生的液滴收集至250 ml含0.5% CaCl2的溶液中，在60–90 rpm搅拌条件下静置10–20分钟，使其充分凝胶化。
3. 海藻酸盐胶囊的处理（可选）
- 将海藻酸钙（Alg-Ca）微胶囊置于含0.05%（w/v）聚-L-赖氨酸（PLL）的溶液中，在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。
- 用HEPES缓冲盐水洗涤微胶囊后，将其置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中孵育，以中和其表面电荷。将处理后的微胶囊用作包被微胶囊（图1C）。
- 将微胶囊在含10 mM EDTA的HEPES缓冲盐水中孵育5分钟。经EDTA处理的微胶囊用作中空微胶囊（图1C）。
4. 在海藻酸盐胶囊中培养并收集细胞
- 将包封的细胞在37 °C、5% CO2条件下，以75 rpm振荡培养10天。
- 收集胶囊并在10 mM EDTA中于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。通过在1,000 × g下离心3分钟，从未经PLL处理的海藻酸盐胶囊中收集细胞。
- 若海藻酸盐胶囊经过PLL处理，则使用连接在注射器上的针头反复吹打约十次以破坏Alg-PLL膜，并在1,000 - 5,000 × g下离心5分钟。针头直径应小于胶囊尺寸，本实验中使用25 G（260 µm）针头（胶囊尺寸为600 µm）。
- 离心后，若需从细胞中收集mRNA样品，应严格从已破碎的Alg-PLL膜中收集细胞沉淀。残留的Alg-PLL膜可能影响mRNA的纯化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在方案 2.5 中，挤出的海藻酸钠溶液在挤出后立即形成球形（图 2A – H）。如果以低于 1 L/min 的 N2 流速挤出悬浮液，则液滴大小均匀（图 2I）。然而，若 N2 流速高于 1 L/min，液滴会破裂（图 2G，白色箭头所示），导致液滴尺寸变得不均一（图 2J）。因此，使用该方法难以制备直径小于 500 µm 的液滴。
在凝胶化过程（方案 2.4）中，若海藻酸钠（Alg-Na）浓度足够（高于 3%），其液滴在 CaCl2 溶液中会形成球形的海藻酸钙（Alg-Ca）微胶囊（图 3E-H,K,I）。然而，当 Alg-Na 浓度过低（低于 3%）时，形成的微胶囊呈非球形且表面不光滑（图 3A-D, I），这会影响后续包被过程。即使 Alg-Na 浓度不足，也可通过提高 CaCl2 浓度来...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
包封培养可与直接悬浮培养进行比较。与包封方法相比，悬浮培养是一种更简单的大规模获取多能干细胞的方法。然而，控制悬浮培养中细胞的聚集仍具挑战性。在包封方法中，细胞聚集被限制在微胶囊内，因此可以得到良好控制。先前的一项研究显示，包封的细胞形成了大小均一的细胞聚集体，而在无载体悬浮培养中则出现了较大的细胞团块7。此外，早期有报道表明，强烈搅拌会导致多能干细胞直接悬浮培养中的细胞死亡，因此必须限制搅拌速率。相比之下，包封技术即使在悬浮条件下也能保护细胞免受剪切应力的影响。因此，包封方法在悬浮培养细胞时提供了操作条件上的更大灵活性。
包封技术在干细胞研究以及大规模生产工艺的改进方面均具有重要应用价值。干细胞的包封有助于研究干细胞微环境，包括细胞外基质和生长因子的作用。一些研究人员已证明，将小鼠胚胎干细胞（ES细胞）包封于VEGF偶联的琼脂糖水凝胶中，可促进这些细胞向血液前体细胞分化8。
本文展示了如何利用同轴喷嘴和N，通过简便的方法将小鼠iPS细胞包封到尺寸可控的海藻酸钙胶囊中2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由日本科学技术振兴机构（JST）的S-Innovation项目、东京大学生命创新领军人才研究生项目（GPLLI）以及日本学术振兴会青年科学家研究奖学金资助。我们感谢nac Image Technology Inc. 使用高速摄像机拍摄视频。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| 小鼠诱导性多能干细胞 | RIKEN 生物资源中心 | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| 高糖DMEM培养基 | GIBCO | 11995 | |
| 胚胎干细胞专用 胎牛血清（FBS） | GIBCO | 16141079 | |
| 抗菌抗生素 | GIBCO | 15240 | |
| 非必需氨基酸 | GIBCO | 11140 | |
| 2-巯基乙醇 | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO 白血病抑制因子 | Merck Millipore | ESG1107 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G 针头 | Hoshiseido | ||
| 10 ml 注射器 | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 氯化钠 | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| 海藻酸钠 | Wako | 194-09955 | |
| 氯化钙 | Wako | 039-00475 | |
| 聚-L-赖氨酸（分子量 = 15,000 - 30,000） | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| 注射泵 | AS ONE | ||
| 显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 显微镜 | Leica | DM IRB | |
| 高速摄像机 | nac image technology | Memrecam HX-3 |
参考文献
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
