多能干细胞的海藻酸钠封装使用同轴喷嘴

摘要

我们建立了一种使用同轴喷嘴将多能干细胞 （PS 细胞） 封装到藻酸盐水凝胶胶囊中的方法。 这可以防止细胞过度聚集，并限制悬浮培养中细胞所承受的剪切应力。 该技术适用于 PS 细胞的大规模生产以及干细胞生态位的研究。

摘要

多能干细胞 （PS 细胞） 由于其在再生医学和药物筛选中的作用，是深入研究的重点。 然而，在这些应用中使用 PS 细胞需要开发大量培养系统。 悬浮培养是一种很有前途的大规模生产 PS 细胞的培养方法，尽管一些问题（例如控制聚集和限制培养基的剪切应力）仍未解决。 为了解决这些问题，我们开发了一种使用同轴喷嘴的海藻酸钙 （Alg-Ca） 封装方法。 这种方法可以通过共流 N₂ 气体来轻松控制胶囊的大小。 可控胶囊直径必须大于 500 μm，因为 N₂ 气体的流速过高会导致液滴分解，从而导致胶囊尺寸异质。 此外，低浓度的 Alg-Na 和 CaCl₂ 会导致非球形胶囊。 尽管没有 Alg-PLL 涂层的 Alg-Ca 胶囊很容易溶解，从而能够收集细胞，但它们也有可能从缺乏 Alg-PLL 涂层的胶囊中泄漏出来。 事实上，藻酸盐-PLL 涂层可以防止细胞泄漏，但也很难打破。 该技术可用于研究干细胞生态位以及 PS 细胞的大规模生产，因为包埋可以改变细胞周围的微环境，包括细胞外基质和分泌因子的浓度。

引言

诱导多能干细胞 （iPS 细胞） 由于其在再生医学中的作用，目前是深入研究的来源。 然而，组织再生需要大量的细胞。 例如，一名 1 型糖尿病患者大约需要 10 亿个胰腺细胞¹。 然而，传统的培养皿培养只能获得 1 × 10⁵ 个细胞/cm²，因此需要 1 m² 的培养面积才能获得足够的干细胞来源的胰腺细胞来治疗 1 型糖尿病患者。 因此，再生医学需要开发一种用于多能干细胞（如微载体² 和悬浮培养）的大规模培养系统。 悬浮培养是一种很有前途的大规模培养方法，但在人 iPS 细胞的直接悬浮培养中，控制细胞聚集具有挑战性³。 事实上，悬浮细胞会受到剪切应力，这会导致细胞损伤³ （cell damage） 或分化⁴（differentation）。

已经对基于水凝胶的包埋进行了研究，以解决与悬浮培养相关的问题。 在水凝胶胶囊中，细胞受到保护，不受培养基流动的影响。 以前的报告记录了使用各种类型的水凝胶，包括琼脂糖⁵、PEG⁶ 和藻酸盐 （Alg），进行细胞包封。 Alg-Ca 水凝胶是用于细胞封装的最有用的水凝胶之一，因为 Alg-Ca 水凝胶是在将藻酸盐溶液滴入 CaCl₂ 溶液后立即形成的，并且也很容易被酶或螯合试剂消化。

在这里，我们使用同轴喷嘴为 iPS 细胞建立了稳定的藻酸盐包封过程。 通过使用 N₂ 气流形成液滴，可以将细胞封装到均匀的胶囊中，而无需其他试剂，例如油。 在该方法中，N₂ 的流速以及 CaCl₂ 和藻酸盐的浓度是影响胶囊大小、形状和均匀性的主要作条件。 本报告展示了通过使用高速相机和显微镜来优化这些作条件。

方案

1.准备材料

1. 准备10毫米的HEPES缓冲。将pH调节至7.0，在室温，添加NaCl至0.9％。
2. 制备5％藻酸盐溶液和10mM EDTA的溶液通过混合1.1制备的HEPES缓冲盐水。将pH调节至7.0，在室温。
3. 高压釜中加入试剂（1.1，1.2）20分钟，在121℃。
4. 制备层状用1.2明胶包衣60毫米菜- 2.0×10 ⁶的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞，其内含有10％ES-合格FBS和丝裂霉素C的10微克/毫升90当作饲养细胞温育 - 120分钟。
5. 保持小鼠诱导多能干细胞（iPS）在与饲养细胞在5毫升含有的ES-合格的FBS 20％，50μM2-巯基乙醇，非必需氨基酸和抗生素的DMEM高葡萄糖存在下的菜（青霉素G钠，硫酸链霉素100微克/毫升100单位/毫升，及amphoteri的250纳克/毫升霉素B）中。
6. 种子4×10 ⁵个iPS细胞在明胶包被60mm培养皿孵育它们在37℃和5％的CO _2。每天孵化过程中改变培养基。后3 -培养的第4天，trypsinize细胞1分钟用500微升含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶在37℃和5％的CO _2。在此之后，通过敲击培养皿十倍分离细胞。
7. 加入2.5的10ml DMEM与ES-合格FBS和抗生素（以下离解小鼠iPS细胞成单个细胞通过移液以1000微升微量三次）离心细胞悬浮液10％，在160×g下3分钟，除去上清液，并计数细胞。以下细胞计数，补种在明胶涂覆的培养皿中收集的细胞，并温育30分钟以从MEF细胞分离iPS细胞。计数细胞后（通常为1 - 3×10 ⁶个细胞/皿可以被收集），上补种4×10 ⁵个iPS细胞这道菜。

2.电池封装成海藻酸钠水凝胶胶囊

1. 通过在1.5和1.6中描述的相同的方法收集细胞。离心后，在160×g下3分钟，三次洗涤的iPS细胞沉淀用HEPES缓冲盐水中。后重新悬浮的细胞在HEPES缓冲盐水，过滤细胞悬浮液通过40微米的细胞过滤以除去大的聚集体，这可能否则堵塞喷嘴。
2. 混合料2 ml的细胞悬浮液中的HEPES缓冲盐水和3ml 5％海藻酸钠-Na溶液。最后5毫升细胞悬浮在3％以内海藻酸钠-Na溶液中获得。细胞密度优选大于10 ⁶个细胞/ ml。
3. 收集的细胞悬浮到5ml的注射器之后，注射器上安装同轴喷嘴（ 图1A，B）和设置它们上的注射泵。 EMIT N ₂气流量（低于1L /分钟）通过同轴喷嘴的外针和通过内喷嘴排出的细胞悬浮液。
4. 收集液滴加到250ml 0.5％的CaCl ₂溶液并等待10 - 20分钟进行凝胶化，在60-90转，同时搅拌。

3.治疗藻酸胶囊（可选）

1. 孵育海藻酸钠钙胶囊在0.05％（重量/体积）聚-l-赖氨酸（PLL）中5分钟，溶液在37℃和5％的CO _2。
2. 洗涤用HEPES缓冲的盐水的胶囊后，孵育他们在DMEM含有10％FBS，以中和在其表面上的电荷。利用它们作为包衣胶囊（ 图1C）。
3. 孵育在含有10mM EDTA的5分钟的HEPES缓冲盐水的胶囊。在EDTA处理的胶囊被用作中空胶囊（ 图1C）。

4.文化和收集细胞的藻酸胶囊

1. 孵育封装细胞以75rpm摇动在37℃和5％CO ₂的10天。
2. 收集和孵化在10mM EDTA的胶囊在37℃和5％CO ₂的10分钟。在1,000×g下3分钟收集来自藻酸胶囊不带PLL处理细胞通过离心。
3. 5000×g下5分钟 - 如果藻酸胶囊与PLL处理，通过移液器上下吹吸10倍左右与连接到一个注射器中，并离心它在1000的针打破海藻酸钠-PLL膜。针直径应比胶囊的尺寸和25克（260微米）的针在本实验中使用的低级（600微米）
4. 离心后，从严从破碎的海藻酸钠-PLL膜，如果你想收集样品的mRNA从细胞中收集细胞沉淀。剩余的海藻酸钠-PLL膜可能阻止mRNA纯化。

结果

在协议2.5，排出的藻酸盐溶液构成的球状立即排出后（ 图2A - H）。若悬浮液排出用的N ₂流动速率大于1L /分下，液滴的尺寸是均匀的（ 图2I）。然而，如果N ₂流量低于1L /分高时，液滴分解（ 图2G，白色带箭头）和液滴的尺寸变得不均匀（ 图2J）。鉴于此，它是难以制备的液滴比使用此方法为500μm以下。

在胶凝过程（协议2.4），海藻酸钠娜液滴形成中的CaCl ₂溶液球状海藻酸钠钙胶囊如果海藻酸钠钠（超过3％）的浓度是足够的（ 图3E-H，K，I）。海藻酸钠钠（低于3％）的但是低浓度导致非球形和胶囊的非平滑的形状（ 图3A-D，I），其在涂覆过程中的问题。即使海藻酸钠-Na浓度是不够的，球形胶囊可以通过增加的CaCl ₂浓度（ 图3J）来形成。然而，...

讨论

封装文化可以直接悬浮培养进行比较。悬浮培养是一个更简单的方法，以获得大量的多能干细胞比包封方法。然而，控制在悬浮培养中的细胞的凝集是仍然具有挑战性。在封装方法，蜂窝聚集在胶囊有限的，因此可以很好地控制。先前的出版物表明，包封的细胞形成大小均匀的聚集体，而大细胞团块出现在自由悬浮培养^7。此外，先前的一份报告显示，强烈搅拌导致PS细胞的直接悬浮培养细胞死亡;因此需要在有限的搅拌速度。与此相反，封装能够保护从剪切应力细胞甚至在悬浮条件下。因此，该封装方法允许的灵活性，在操作条件下的水平时在悬浮生长的细胞。

ove_content">封装是为干细胞研究以及大规模生产过程的变型的有用工具。干细胞的封装是在研究的干细胞小生境，包括细胞外基质和生长因子是有用的。一些研究者已证明小鼠ES细胞的包封进VEGF共轭琼脂糖凝胶促进细胞分化成血祖细胞^8。

本文介绍如何轻松地通过使用同轴喷嘴和N ₂流封装小鼠iPS细胞分化成规模控制的海藻酸钠钙胶囊。虽然有一些封装过程的各种工具，例如蠕动泵⁹和电...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠胚胎成纤维细胞	Cell Biolabs	SNL 76/7
小鼠诱导多能干细胞	RIKEN 生物资源中心	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM 高葡萄糖	GIBCO	11995
ES 合格 FBS	GIBCO	16141079
抗菌抗生素	GIBCO	15240
非必需氨基酸	GIBCO	11140
2-巯基乙醇	GIBCO	21985-023
ESGRO 白血病抑制因子	默克米利波尔	ESG1107
胰蛋白酶/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G 针	星生堂
10 ml 注射器	TERUMO	SS-10ESZ
钠 氯化物	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
海藻酸钠	Wako	194-09955
氯化钙	Wako	039-00475
聚-L-赖氨酸 （MW = 15,000 - 30,000）	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge 泵	AS ONE
显微镜	奥林巴斯	IX71
显微镜	徕卡	DM IRB
Hispeed 相机	nac 影像技术	Memrecam HX-3