颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

摘要

本文描述了在小鼠中通过FeCl₃诱导血栓形成的模型。该方法通过肠系膜血管的活体显微镜观察以及颈动脉血流测量来监测血栓的生长。

摘要

严重的血栓形成及其缺血性后果，如心肌梗死、肺栓塞和中风，是全球主要的健康问题。三氯化铁损伤法现已成为一种成熟的技术，可快速、准确地在暴露的小或大直径静脉或动脉中诱导血栓形成。该模型在血栓形成病理生理学研究、新型抗血栓药物的发现与验证，以及这些新药作用机制的理解中发挥了关键作用。本文介绍了该技术在小鼠肠系膜血管和颈动脉上的应用。该方法描述了如何用荧光染料标记循环中的白细胞和血小板，并通过活体显微镜观察暴露的肠系膜组织，检测这些细胞在受损血管壁处的聚集，从而形成血栓的过程。在颈动脉实验中，通过多普勒探头监测血流，测量血栓形成所导致的血管闭塞情况。

引言

研究血栓形成机制及评估抗血栓药物疗效需要建立完善的实验动物模型。大型动物模型最早被用于此类研究，因其血管较大，较啮齿类动物更接近人类。¹然而，高昂的成本、所需更大的设施以及遗传操作上的困难是其应用的主要缺点，因此大型动物目前仅限于在啮齿类动物的初步实验获得明确结果后，用于后期的临床前研究。²。由于转基因和基因敲除品系广泛可得，且其体型较小，可最大限度减少抗血栓药物所需的用量 体内 测试时，小鼠主要用于血栓形成研究。因此，已开发出多种小鼠血栓性疾病模型³.

许多已建立的血栓形成模型会破坏血管壁的内膜层，进而使血流暴露于内皮下细胞外基质，诱导血栓形成⁴血栓可能由胶原暴露引发血小板活化，和/或组织因子暴露激活凝血级联反应所致。⁵. 随后采用多种技术实现初始血管损伤。Pierangeli 等 使用显微外科工具在股静脉上建立了一种机械性损伤模型⁶. Kikushi 等 描述了一种模型，该模型包括给予一种光敏化合物（玫瑰红）以使其在内皮细胞的脂质双层中聚集，随后用绿光（540 nm）特异性激发目标血管壁⁷. 也可通过短时高强度脉冲激光照射来诱导损伤⁸另一种最初在大鼠颈动脉上建立的技术是氯化铁（FeCl₃）的局部应用。₃)⁹在此情况下，血管去内皮作用是由 FeCl 产生的自由基引起的。₃ 导致脂质过氧化和内皮细胞破坏¹⁰损伤会诱导多种黏附分子的表达，从而触发血小板黏附与聚集，以及白细胞的募集。已有研究表明，白细胞尤其是中性粒细胞，在激活血液凝固级联反应并导致血栓形成的过程中发挥着关键作用。¹¹该方法非常适合重现凝血级联反应；研究人员必须注意，在此小鼠模型中，血栓通常在健康的血管中被诱导形成，而人类的血栓主要发生在病变的血管中 例如动脉粥样硬化血管

由于该模型在小动物中实施非常简便且效果显著，现已成为小动物血栓形成研究中最常用的模型 体内 研究。此外，该技术还可用于在多种血管中诱导血栓形成。靶向血管可以是大直径的动脉或静脉（如颈动脉、股动脉、下腔静脉）或小直径的血管（如肠系膜、提睾肌血管）^12–14最近，该方法也被用于大脑中动脉近端，以建立脑卒中模型¹⁵可通过血小板和白细胞荧光标记后利用活体显微镜直接观察血栓形成，或通过温度探针或多普勒探针测量血流减少来监测^12,16,17随后可研究多个参数，如闭塞时间、血栓形成时间或血栓大小。由于所研究血管之间的生理差异，所获得的血栓存在显著差异。因此，研究者通常根据拟测量的参数和/或拟研究的疾病状态来选择目标血管。通常，颈动脉模型更适用于与心肌梗死或脑卒中相关的动脉粥样硬化性血栓形成研究，而下腔静脉模型则更适用于深静脉血栓形成的研究。不同血管的可操作性也决定了血栓生长的测量方法。例如，肠系膜血管易于操作，因此该模型非常适合活体显微观察及血栓形成动态过程的研究。颈动脉较难操作但管径较大，便于血流测量，是研究闭塞性血栓形成的理想模型。

氯化铁诱导的血栓形成模型在理解该病理机制方面取得了巨大进展。该模型已被广泛应用于多项聚焦于血管性血友病因子在血栓形成中作用的研究中^18,19结合基因修饰技术，该方法已助力识别出许多参与血栓性疾病的相关基因。Lamrani 等例如，已有研究证明，JAK2 的基因敲入^V617F 基因与不稳定凝块的加速形成相关²⁰. Zhang 等 已研究了血小板P2Y12受体的生理学意义，并证明仅在血小板中特异性过表达该受体的转基因小鼠，在三氯化铁损伤的肠系膜动脉中表现出更快且更稳定的血栓形成₃²¹该方法还研究了组织型纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）在纤维蛋白降解过程中的关键作用。²²此外，该模型还提供了一种简单且准确的方法，用于检测多种新型药物的纤溶能力。 体内例如，Wang 等 已采用该模型对一种靶向活化血小板的新型重组纤溶酶原激活剂进行临床前验证²³该方法还可用于验证从蜱虫、吸血蝙蝠和蚊子的唾液或蛇毒中分离得到的治疗性蛋白质，并能特异性地识别其靶标。^24-27这些实例展示了三氯化铁模型的多功能性。本文中，我们重点介绍两种方法，并研究三氯化铁在两种不同类型血管——肠系膜血管和颈动脉上诱导的血栓形成。

方案

所有涉及动物的实验均经阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物伦理委员会批准（E/1534/2015/B）。所有外科操作均在完全麻醉下进行，动物在任何阶段均未经历疼痛。所描述的所有实验均为非复苏性实验。

1. 准备

1. 将滤纸切成细条（1 mm × 2 mm）。
2. 用去离子水新鲜配制4%（w/v）和6%（w/v）的三氯化铁溶液。配制0.3%的罗丹明6G PBS溶液，经0.22 µm滤膜过滤。
3. 从注射器包装的白色塑料部分剪下一小块（5 mm × 1 cm）。

2. 活体显微镜观察肠系膜小动脉血栓形成

1. 称取一只10-12周龄的雄性C57Bl/6野生型小鼠，并通过腹腔注射给予相应剂量的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。通过脚趾、尾巴和/或皮肤夹捏反应，角膜和眼睑反射，以及胡须运动的缺失来监测麻醉深度。 必要时，可注射第二剂氯胺酮（50 mg/kg）以维持动物的麻醉状态。在麻醉期间，于动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于放置于37 °C加热垫上的小型培养皿中。
   注意：尽管腹腔注射可能会引起动物疼痛，但这种不适的持续时间极短（少于3秒）。通过使用经验丰富的操作人员和合适的针头尺寸（25 G），可将注射相关的疼痛与不适降至最低。所有实验操作结束后，采用过量的氯胺酮和赛拉嗪麻醉，随后行颈椎脱位法处死所有动物。
2. 在皮肤上做一条长约3 cm的腹部正中切口，并小心切开腹膜。
3. 将小鼠置于培养皿的一侧，轻柔地将肠管外置，并用两根棉签小心展开肠系膜，使合适的血管暴露于培养皿表面。用柔软的擦拭纸适当擦干。
   注意：为限制肠系膜血管的移动，可使用罂粟碱抑制肠道蠕动。
4. 将小鼠尾部浸入温水中以扩张血管，并注射 30 µl 通过29 G注射器将罗丹明6G（0.3%）注入小鼠尾静脉，以标记白细胞和血小板。
5. 将培养皿置于倒置显微镜下，使用明场通道对选定的微动脉进行聚焦。
6. 用一条浸有6%（w/v）氯化铁溶液的滤纸条，借助两把镊子将其贴附于微动脉上；其中一把镊子用于夹持滤纸条，另一把轻轻将其压在目标区域。自滤纸条放置后立即观察前10秒内的血栓形成情况。
   注意：损伤周围微血管的情况较为常见，因此精确放置滤纸并施加轻柔压力至关重要，以尽量减少此类问题。
7. 通过滤纸使用荧光显微镜（TRITC通道：最大激发波长557 nm，最大发射波长576 nm）观察血栓形成。循环中的白细胞和血小板摄取了罗丹明6G，其在血栓中的聚集现象因此易于识别。
8. 暴露于氯化铁1分钟后取下滤纸，继续监测血栓的形成。用PBS冲洗血管。
9. 观察并记录用罗丹明6G标记血小板和白细胞后所呈现的血栓动态形成过程。采集图像并测量血栓的大小。本文所示图像采用倒置活体显微镜通过4X物镜在TRITC荧光通道下获得。
10. 按照所有操作步骤后，使用过量的氯胺酮和赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱位。

3. 通过血流速度测量评估颈动脉血栓形成

1. 称取一只10至12周龄的雄性C57Bl/6小鼠体重，并通过腹腔注射给予相应剂量的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
2. 将小鼠用胶带固定于手术显微镜下，四肢固定于调节至37 °C的加热垫上。
3. 用一张擦拭纸制作一个小枕头，用胶带固定在小鼠头部下方，使其头部略微抬高。使用带镊子的线圈钩住小鼠鼻部并向下牵拉（钩住上门齿），以暴露颈总动脉区域，便于操作。
4. 在下颌正下方的皮肤上做一个小切口，深度5毫米，沿正中线向下至胸骨。
5. 解剖筋膜，分离出左侧或右侧颈总动脉分叉上方的一段血管片段。
6. 用镊子小心地插入动脉与神经之间，将其分离。避免干扰紧邻动脉走行的神经，不要过度触碰颈动脉，以免损伤血管。分离出至少5 mm长的一段动脉。
7. 用擦拭纸将动脉部位彻底擦干，以避免任何液体干扰 FeCl₃₃.
8. 将小块白色塑料片置于分离出的颈总动脉下方，使 FeCl₃₃ 不会浸润周围组织。为此，使用第二把镊子将组织片移至第一把镊子处，然后缓慢将塑料纸插入动脉下方。
9. 将一张滤纸用4%（w/v）或6%（w/v）的氯化铁溶液浸湿，然后将其环绕放置在动脉周围。
10. 孵育3分钟后，移除滤纸，用PBS冲洗，并用擦拭纸擦干该区域。
11. 将多普勒血流探头放置于损伤区域的血管周围，开始记录血流变化。在成年小鼠健康的颈总动脉中，血流速度通常约为1 ml/min。注意！探头接触氯化铁会对其造成损伤，因此应避免任何接触。本文所示数据采用Transonic System Inc. 流量计TS420，配备Nano Doppler血流探头0.5 PBS的血管周围模块获得。
    注意：氯化铁的浓度会影响血栓形成的动力学，导致不同的闭塞时间。因此，6%（w/v）氯化铁处理比4%（w/v）氯化铁处理产生更快的闭塞。
12. 完成所有操作后，使用过量的氯胺酮和赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱位，并仔细清洁多普勒探头。

结果

通过荧光活体显微镜观察肠系膜，可显示被FeCl₃损伤的血管壁上聚集了罗丹明6G标记的血小板和白细胞。在一个200 µm的肠系膜血管中监测到部分血栓的逐步形成过程（图1）。暴露于FeCl₃后约1分钟，血栓开始缓慢出现并可被清晰识别（图1，t = 60 秒）。在移除FeCl₃浸润的滤纸40秒后，血栓形成迅速进展，最终在整个被观察的血管节段壁上均可见血栓（图1，t = 100 秒）。

图1：通过肠系膜血管活体荧光显微镜观察血栓生长。 图像分别在放置浸有6% ...

讨论

三氯化铁诱导的血栓形成模型是一种优秀的研究工具。本研究表明，该方法实施极为简便，且当与活体显微镜或激光多普勒血流仪联用时，可实现对血栓形成的良好实时监测。通过调节 FeCl₃ 的作用时间与浓度，还可选择性地生成非闭塞性或闭塞性血栓。

然而，该方法也存在一些局限性。在颈动脉中，主要缺点是尽管可以有效调节闭塞时间，但模型的可重复性仍然较弱，难以精确控制血栓的大小和生长速率¹⁰。多个研究团队已致力于该模型的标准化工作^28,29。Owens et al. 提出，通过实践并减少各种变异因素，例如小鼠的年龄、小鼠的遗传背景、所使用的麻醉方式、三氯化铁暴露技术以及三氯化铁溶液的浓度，可以获得可靠且可重复的闭塞时间²⁸。多普勒探头本身也存在一定局限性，存在一定程度的背景信号，可能影响闭塞的判定。此外，不稳定的血栓形成也可能改变血流状态。

在肠系膜血管上，可重复性可能受到血管尺寸变异的影响，其变异程度大于颈动脉，且脂肪的存在可能会降低损伤程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
沃特曼色谱纸	GE Healthcare	3030917
氯化铁（III）40%（w/v）	VWR	24212.298
罗丹明6G	Sigma	R4127
倒置显微镜	Olympus	IX81
数字黑白相机	Olympus	XM10
多普勒血流仪	Transonic	TS420
纳米多普勒血流探头	Transonic	0.5 PBS
氯胺酮	Hospira	0409-2051-05
赛拉嗪（Rampun）	Bayer	75313
培养皿	Sarstedt	82.1472
胰岛素注射器（29 G）	BD Ultra-Fine	326103
棉签	BSN medical	211827A
Dynek dysilk缝合线	Dynek Pty Ltd	CS30100
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco life technologies	21600-069
加热垫	Kirchner	T60