颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

摘要

本文描述了在小鼠中通过FeCl₃诱导血栓形成的模型。该方法通过肠系膜血管的活体显微镜观察以及颈动脉血流测量来监测血栓的生长。

摘要

严重的血栓形成及其缺血性后果，如心肌梗死、肺栓塞和中风，是全球主要的健康问题。三氯化铁损伤法现已成为一种成熟的技术，可快速、准确地在暴露的小或大直径静脉或动脉中诱导血栓形成。该模型在血栓形成病理生理学研究、新型抗血栓药物的发现与验证，以及这些新药作用机制的理解中发挥了关键作用。本文介绍了该技术在小鼠肠系膜血管和颈动脉上的应用。该方法描述了如何用荧光染料标记循环中的白细胞和血小板，并通过活体显微镜观察暴露的肠系膜组织，检测这些细胞在受损血管壁处的聚集，从而形成血栓的过程。在颈动脉实验中，通过多普勒探头监测血流，测量血栓形成所导致的血管闭塞情况。

引言

研究血栓形成机制及评估抗血栓药物疗效需要建立完善的实验动物模型。大型动物模型最早被用于此类研究，因其血管较大，较啮齿类动物更接近人类。¹然而，高昂的成本、所需更大的设施以及遗传操作上的困难是其应用的主要缺点，因此大型动物目前仅限于在啮齿类动物的初步实验获得明确结果后，用于后期的临床前研究。²。由于转基因和基因敲除品系广泛可得，且其体型较小，可最大限度减少抗血栓药物所需的用量 体内 测试时，小鼠主要用于血栓形成研究。因此，已开发出多种小鼠血栓性疾病模型³.

许多已建立的血栓形成模型会破坏血管壁的内膜层，进而使血流暴露于内皮下细胞外基质，诱导血栓形成⁴血栓可能由胶原暴露引发血小板活化，和/或组织因子暴露激活凝血级联反应所致。⁵. 随后采用多种技术实现初始血管损伤。Pierangeli 等 使用显微外科工具在股静脉上建立了一种机械性损伤模型⁶. Kikushi 等 描述了一种模型，该模型包括给予一种光敏化合物（玫瑰红）以使其在内皮细胞的脂质双层中聚集，随后用绿光（540 nm）特异性激发目标血管壁⁷. 也可通过短时高强度脉冲激光照射来诱导损伤⁸另一种最初在大鼠颈动脉上建立的技术是氯化铁（FeCl₃）的局部应用。₃)⁹

方案

所有涉及动物的实验均经阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物伦理委员会批准（E/1534/2015/B）。所有外科操作均在完全麻醉下进行，动物在任何阶段均未经历疼痛。所描述的所有实验均为非复苏性实验。

1. 准备

1. 将滤纸切成细条（1 mm × 2 mm）。
2. 用去离子水新鲜配制4%（w/v）和6%（w/v）的三氯化铁溶液。配制0.3%的罗丹明6G PBS溶液，经0.22 µm滤膜过滤。
3. 从注射器包装的白色塑料部分剪下一小块（5 mm × 1 cm）。

2. 活体显微镜观察肠系膜小动脉血栓形成

1. 称取一只10-12周龄的雄性C57Bl/6野生型小鼠，并通过腹腔注射给予相应剂量的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。通过脚趾、尾巴和/或皮肤夹捏反应，角膜和眼睑反射，以及胡须运动的缺失来监测麻醉深度。 必要时，可注射第二剂氯胺酮（50 mg/kg）以维持动物的麻醉状态。在麻醉期间，于动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于放置于37 °C加热垫上的小型培养皿中。
   注意：尽管腹腔注射可能会引起动物疼痛，但这种不适的持续时间极短（少于3秒）。通过使用经验丰富的操作人员和合适的针头尺寸（25 G），可将注射相关的疼痛与不适降至最低。所有实验操作结束后，采用过量的氯胺酮和赛拉嗪麻醉....

结果

通过荧光活体显微镜观察肠系膜，可显示被FeCl₃损伤的血管壁上聚集了罗丹明6G标记的血小板和白细胞。在一个200 µm的肠系膜血管中监测到部分血栓的逐步形成过程（图1）。暴露于FeCl₃后约1分钟，血栓开始缓慢出现并可被清晰识别（图1，t = 60 秒）。在移除FeCl₃浸润的滤纸40秒后，血栓形成迅速进展，最终在整个被观察的血管节段壁上均可见血栓（图1，t = 100 秒）。

图1：通过肠系膜血管活体荧光显微镜观察血栓生长。 图像分别在放置浸有6% .......

讨论

三氯化铁诱导的血栓形成模型是一种优秀的研究工具。本研究表明，该方法实施极为简便，且当与活体显微镜或激光多普勒血流仪联用时，可实现对血栓形成的良好实时监测。通过调节 FeCl₃ 的作用时间与浓度，还可选择性地生成非闭塞性或闭塞性血栓。

然而，该方法也存在一些局限性。在颈动脉中，主要缺点是尽管可以有效调节闭塞时间，但模型的可重复性仍然较弱，难以精确控制血栓的大小和生长速率¹⁰。多个研究团队已致力于该模型的标准化工作^28,29。Owens et al. 提出，通过实践并减少各种变异因素，例如小鼠的年龄、小鼠的遗传背景、所使用的麻醉方式、三氯化铁暴露技术以及三氯化铁溶液的浓度，可以获得可靠且可重复的闭塞时间²⁸。多普勒探头本身也存在一定局限性，存在一定程度的背景信号，可能影响闭塞的判定。此外，不稳定的血栓形成也可能改变血流状态。

在肠系膜血管上，可重复性可能受到血管尺寸变异的影响，其变异程度大于颈动脉，且脂肪的存在可能会降低损伤程.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
沃特曼色谱纸	GE Healthcare	3030917
氯化铁（III）40%（w/v）	VWR	24212.298
罗丹明6G	Sigma	R4127
倒置显微镜	Olympus	IX81
数字黑白相机	Olympus	XM10
多普勒血流仪	Transonic	TS420
纳米多普勒血流探头	Transonic	0.5 PBS
氯胺酮	Hospira	0409-2051-05
赛拉嗪（Rampun）	Bayer	75313
培养皿	Sarstedt	82.1472
胰岛素注射器（29 G）	BD Ultra-Fine	326103
棉签	BSN medical	211827A
Dynek dysilk缝合线	Dynek Pty Ltd	CS30100
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco life technologies	21600-069
加热垫	Kirchner	T60