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新鲜分离肾小球中足细胞的单通道分析与钙离子成像

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DOI：

10.3791/52850

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2015年6月27日

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1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

本文内容

摘要

足细胞内钙离子水平的变化是调控肾小球滤过功能最重要的机制之一。本文介绍了一种高通量方法，可用于检测新鲜分离的肾小球足细胞中钙离子的实时动态变化以及单个离子通道的活性。

摘要

足细胞（肾小球上皮细胞）被认为可调节肾小球通透性并维持肾小球结构；已有明确证据表明，这些细胞在多种肾脏疾病发病机制中发挥关键作用，因为足细胞损伤会导致蛋白尿和足突融合。先前有报道称，多种内源性物质可能引起足细胞内 Ca2+ 浓度显著升高，可能导致白蛋白尿，而这一过程可能通过钙离子通道介导。因此，研究足细胞在正常条件及不同病理状态下的钙离子调控显得尤为重要。然而，现有的实验方法仍主要局限于培养细胞和转染细胞。尽管这些模型为相关研究提供了良好的基础，但它们本质上已脱离了肾小球的天然微环境。本文描述了一种将足细胞作为新鲜分离的完整肾小球组成部分进行研究的方法学。该制备方法保留了足细胞的功能潜力，因其仍附着于毛细血管壁上，从而使其处于能够维持肾小球滤过装置主要结构的环境中。本论文详细阐述了两种实验方法：1）借助比率式共聚焦荧光显微镜实时检测钙离子浓度变化；2）记录新鲜分离肾小球中足细胞单个离子通道的活动。这些方法充分利用了肾小球天然微环境的优势，使研究人员能够解析足细胞在施加不同试剂后胞内钙离子调控的急性变化，测定细胞内基础钙离子浓度（例如用于评估疾病进展），并在单个离子通道水平上评估和调控钙离子电导。

引言

肾脏通过调节血容量来维持多种物质的稳态平衡，从而决定总体血压。肾小球滤过、重吸收或分泌功能的紊乱会导致或伴随一系列病理状态，从高血压或低血压到终末期肾病，后者最终需要进行肾移植。肾滤过单位（肾小球）由三层结构组成——毛细血管内皮、基底膜以及一层单层的上皮细胞——即足细胞，后者在维持裂孔隔膜完整性和功能中发挥重要作用1。肾小球选择性滤过屏障功能障碍会导致大分子物质经尿液丢失，例如蛋白尿。多种因素可影响足细胞及其足突结构，而这些结构决定了肾小球滤过屏障的完整性。

足细胞参与维持肾小球的滤过功能。已有研究证实，足细胞对钙离子的异常处理会导致细胞损伤，并在多种类型肾病的进展中发挥重要作用2,3。因此，建立一种能够直接测量细胞内钙离子浓度变化的模型，将对足细胞功能的研究具有重要意义。此前，分离的肾小球已被广泛应用于多项研究中，包括白蛋白反射系数变化的测定4，以及全细胞膜片钳电生理记录中对整体细胞电流的评估5,6。本文所述的实验方案可使研究人员能够测量足细胞在药物刺激下细胞内钙离子浓度的变化，评估细胞内钙离子的基础水平，并分析单个钙离子通道的活性。本研究采用比率法钙离子浓度检测和膜片钳电生理技术，分别测定足细胞内钙离子浓度的变化及离子通道活性。

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方案

动物使用和福利应遵循经机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的方案，符合《实验动物护理和使用指南》（NIH指南）的要求。

1. 肾脏灌注

  1. 使用8至12周龄的雄性大鼠（建议使用Sprague Dawley品系，但也可根据适当调整使用其他品系、不同年龄或性别的大鼠）。
  2. 根据IACUC批准的实验动物使用规程对动物进行麻醉，监测麻醉深度并检查动物状态。1.3至1.8步骤中所述手术的详细描述可参见Ilatovskaya et al.7。
  3. 在充分麻醉后，将动物置于温度可控的手术台上，沿腹部正中线做切口（长度可达3英寸），暴露下腔静脉和主动脉。
  4. 在腹腔干、肠系膜上动脉以及其上方的腹主动脉周围置入结扎线，但暂不结扎。
  5. 钝性分离肾动脉下方的腹主动脉，并在其周围放置两道结扎线，暂不结扎；随后在结扎线上方夹闭主动脉，并结扎下方的结扎线。
  6. 在夹闭下方的腹主动脉处插入连接至注射泵（内含PBS）的聚乙烯PE50导管，并用第二道结扎线固定导管；移除动脉夹，启动注射泵，随后结扎腹主动脉以及腹腔干与肠系膜上动脉。迅速切开肾静脉以释放压力。
  7. 以6 ml/min的流速，用预冷的PBS灌注主动脉2至3分钟。
  8. 停止灌注，取出肾脏并剥除包膜7，将肾脏置于含PBS的冰上。根据IACUC批准的规程对动物实施安乐死。

2. 大鼠肾小球的分离

  1. 配制 30 ml 新鲜的 5% BSA RPMI 1640 溶液。
  2. 使用剃刀刀片和剪刀分离双侧肾脏的皮质，然后切碎至均匀。此操作步骤此前已有描述7。
  3. 用刮勺将上一步切碎的组织通过一个预先浸泡在 5% BSA/RPMI 溶液中的 100 目不锈钢筛网。收集滤过液，并利用重力使其自然通过 140 目筛网。
  4. 使用预先浸泡过的 200 目筛网过滤从 140 目筛网收集的滤过液，弃去滤液，并用 10–15 ml 配制好的 BSA/RPMI 溶液冲洗筛网表面，以收集沉积在筛网上的肾小球。
  5. 将含有肾小球的 BSA/RPMI 溶液置于冰上，放入 15 ml 离心管中，静置最多 20 分钟，使肾小球沉降至管底。可见肾小球在管底形成沉淀。吸除多余液体，保留约 2 ml 液体于管中。

3. 单通道膜片钳电生理学

  1. 使用分子量为 70,000 - 150,000 的聚-L-赖氨酸（poly-ʟ-lysine）包被 5 × 5 mm 的盖玻片，并使其自然干燥。每张盖玻片使用约 30 µl 的 0.01% 无菌过滤水溶液。
  2. 将实验用溶液恢复至室温，并填充至膜片钳记录浴槽和移液管中。用于 TRPC 通道检测的浴液（单位：mM）成分为：126 NaCl、1 CaCl2、10 HEPES、2 MgCl2、10 葡萄糖，pH 7.4；移液管内溶液成分为：126 NaCl、1.5 CaCl2、10 HEPES、10 葡萄糖，pH 7.4。
    1. 在开始膜片钳实验前，立即向移液管溶液中加入抑制剂，以阻断内源性通道（与本研究无关）的活性（推荐使用：100 µM 氟联苯丙酸（niflumic acid）或 DIDS（用于阻断 Ca2+ 激活的 Cl- 通道）、10 mM 四乙基铵（TEA）（用于抑制大电导 Ca2+ 依赖性 K+ 通道）、10 nM iberiotoxin（用于阻断 Ca2+ 激活的 K+ 通道）、10 µM 尼卡地平（nicardipine）（用于阻断 N 型 Ca2+ 通道））。
  3. 轻轻混匀含有肾小球的溶液，然后取约 50 µl 滴加到已包被聚-L-赖氨酸的盖玻片上，静置约 5 分钟，使肾小球充分贴附。
  4. 将附有肾小球的盖玻片转移至预先装满浴液的膜片钳记录浴槽中，并以 3 ml/min 的流速灌注 1 分钟，以清除未贴附的肾小球。
  5. 采用细胞贴附式（cell-attached mode）进行常规膜片钳记录7。使用玻璃移液管（电阻为 7 - 10 MΩ），通过轻柔施加负压，在移液管尖端与足细胞膜之间形成高阻封接（左图 图 2 展示了连接于离体肾小球表面足细胞上的移液管）。
  6. 在细胞贴附记录过程中，使用八极贝塞尔滤波器（eight-pole Bessel filter）对电流信号进行 300 Hz 的低通滤波。
  7. 离体肾小球可用于膜片钳实验长达 4 - 6 小时。储备的肾小球样本应始终保持在冰上保存。

4. 足细胞内钙离子浓度的比率式共聚焦荧光检测

  1. 取500 µl肾小球组分（见步骤2.5）置于0.5 ml锥形管中，加入钙离子荧光染料Fura Red, AM和Fluo-4, AM。Fura Red, AM使用2 mM储存液，Fluo-4, AM使用1 mM储存液（均溶于DMSO，-20 °C保存），每500 µl肾小球组分中各加入2.5 µl染料。染料加入后立即用铝箔包裹管子避光。
  2. 将管子置于旋转摇床上，在室温下孵育至少20分钟，最长可达1小时。
    注意：此步骤中可加入药理学试剂。
  3. 准备玻璃盖玻片，用多聚-L-赖氨酸包被后，置于70 °C加热板上干燥。
  4. 钙染料负载完成后，取100 µl含肾小球的溶液滴加至多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，使其贴附于表面约5分钟。将附着肾小球的盖玻片装入成像腔室，并以灌流液（含（单位：mM）145 NaCl、2 CaCl2、4.5 KCl、2 MgCl2、10 HEPES，pH 7.35）以3 ml/min的速度灌流，以去除未贴附的肾小球及残留染料。
  5. 将共聚焦激光扫描显微镜设置为488 nm激发波长，并配置发射滤光片（Fluo-4为525/25 nm，Fura Red为650/25 nm）。根据需要设置成像软件的采集频率和分辨率。
  6. 先在明场下找到肾小球，然后开启荧光信号检测。调节每种染料的激光强度，避免信号饱和。选择紧贴玻璃表面的足细胞所在的焦平面，以最大程度减少药物刺激引起肾小球收缩带来的影响。务必确认所选肾小球已牢固贴附于玻璃表面；
  7. 开始对选定焦平面进行成像（以每4秒一帧的频率采集512 × 512像素图像，以观察快速的Ca2+瞬变变化。使用60X/NA 1.4或类似高分辨率物镜），施加目标药物，并记录响应。
    1. 选择合适的焦平面（尽可能靠近玻璃表面，以确保成像到肾小球表面的足细胞）。检查Fluo4和FuraRed通道的荧光强度，并确认在明场下可清晰观察到肾小球。
    2. 开始成像。在施加任何药物前，至少记录1分钟的基础荧光信号，以确保信号稳定（无突然的信号尖峰或衰减）。
    3. 使用微量移液器施加目标药物；操作需谨慎，确保药物充分扩散并到达肾小球。必要时可轻柔搅动灌流液，同时监测所选焦平面，确保因药物施加未导致焦平面偏移。
    4. 记录Fluo4和FuraRed信号的荧光强度变化。确保记录时间足够长，直至信号达到平台期，或达到峰值后恢复至基线水平。如需更换溶液或添加其他药物，可在此阶段进行。
    5. 停止记录，并以软件原生格式保存文件。

5. 钙离子测量的图像分析

  1. 使用配备 ND Utility 插件的 ImageJ 开源软件进行图像分析，该插件支持以原生 ND2 格式导入图像。
  2. 导入图像序列；确保拆分各通道，并使用多通道灰度模式（hyperstack grayscale mode）。
  3. 在 ImageJ 软件中依次选择 Analyze → Tools → ROI Manager，打开 ROI Manager 窗口。使用椭圆选区工具结合 ROI Manager 中的“Add (t)”功能，选择多个感兴趣区域（足细胞）。将背景区域作为最后一个 ROI 进行选择，并保存所选的 ROI（More → Save）。
  4. 激活用于分析的通道所在窗口。在 ROI Manager 中使用 More → Multi Measure 功能，在弹出的对话框中勾选“one row per slice”选项，然后点击 OK。结果将以可在 Results 窗口中设置的格式显示：进入 Results → Set Measurements 菜单，选择“Mean gray value”，计算每个 ROI 的像素强度值，结果将在 Results 窗口中以每列对应一个 ROI 的方式显示。
  5. 将每个通道（Fluo-4 和 Fura Red）测得的 ROI 强度值复制到所选的数据分析软件中；从每个数据点中减去背景强度值。
  6. 对每个时间点，计算 Fluo-4 与 Fura Red 通道强度的比值。绘制每个 ROI 的 Ca2+ 瞬变散点图/折线图，随时间变化。计算所选肾小球的平均值/标准误（Mean/SE）值。
    注意：时间列应根据步骤 4.5 中设定的成像频率进行设置。

6. 使用 Fluo-4 荧光信号计算细胞内钙离子浓度

  1. 取一部分肾小球样品，按照实验方案进行至第4.7步。在记录背景荧光后，向灌流液中加入离子霉素（Ionomycin，终浓度为10 µM），并记录荧光强度的增加。当荧光强度达到峰值并开始衰减时，加入MnCl2（终浓度为5 mM）以淬灭荧光8。
  2. 分析6.1中获得的数据。使用偏好的分析软件，复制按照5.1–5.5步骤所述方法获得的Fluo-4信号ROI强度值。
  3. 使用以下公式计算与ROI对应的足细胞内钙离子浓度（单位为nM）：
    生物化学中钙离子浓度方程，用于游离离子计算的公式。
    其中Kd为Fluo-4的预测定解离常数（345 nM），F为计算钙浓度时对应时间点的荧光强度值（基线），Fmin和Fmax分别为钙负荷最大时（加入离子霉素后）和荧光淬灭后（加入MnCl2）的荧光强度值（见图3）。

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结果

本文探讨了足细胞内钙离子水平急性变化的检测问题。图1展示了实验方案的示意图，该方案旨在对新鲜分离的啮齿类动物肾小球足细胞进行高分辨率活细胞荧光共聚焦成像以及单离子通道活性记录。简言之，在大鼠麻醉后，应使用PBS灌注肾脏以清除血液。随后切除并去包膜肾脏，通过差速筛分法从肾皮质中分离肾小球。样品的一部分可用于膜片钳分析，其余部分则可加载荧光钙离子染料Fluo-4, AM和Fura Red, AM，以进行共聚焦比率钙成像。

在分离肾小球后，可立即进行单离子通道活性的电生理学测量。可采用膜片钳技术的细胞贴附式和全细胞式两种构型来测量离子通道的活性。为验证本方法的可行性，展示了单个类似TRPC的钙离子通道活性的记录结果（图2）。此外，还可施加可穿透细胞或与受体结合的药物，以检测其对足细胞中钙离子内流在单离子通道水平上的影响。

一种可用于评估单个离子通道活性的方法能够产生多种数据，用以表征足细胞的功能。然而，通过检测整个细胞水平上的钙离子浓度变化，可极大地补充该方法的信息...

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讨论

本文所述方法可用于分析啮齿类动物肾小球足细胞的钙处理能力。该技术可同时应用膜片钳单通道电生理学和荧光比率共聚焦成像，但两种方法也可独立使用。本方案包含若干相对简单的步骤：1）肾脏灌流；2）通过差速筛分法分离肾小球；3）进行膜片钳电生理实验，或用荧光钙标记染料孵育肾小球，以进行细胞内钙变化的比率共聚焦成像。

为了分离肾小球，采用了一种基于 Gloy et al.5 的改良方案。差速筛分法的主要优势在于能够获得去除鲍曼囊的肾小球，从而避免了复杂且耗时的手工去囊步骤。在分离得到的肾小球组分中，大多数为去囊肾小球，但研究者必须意识到其中也存在部分带囊肾小球。务必确保对已去除鲍曼囊的肾小球进行成像，因为囊膜会阻碍药物到达足细胞。如图2所示，去囊肾小球表面粗糙，具有明显的毛细血管和足细胞体，而带囊肾小球则呈现光滑且呈圆形。此外，与去囊肾小球相比，带有囊膜且负载 Fluo4 和 FuraRed 的肾小球发出的荧光信号较弱。

所获得的大鼠肾小球组分纯度达95%（含有少量近端小管残留），可根据需要直接用于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Glen Slocum（威斯康星医学院）和 Colleen A. Lavin（尼康仪器公司）在显微镜实验中提供的出色技术支持。感谢 Gregory Blass 对手稿的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 HL108880 和美国糖尿病协会资助项目 1-15-BS-172（资助对象：AS），以及美国肾脏病学会 Ben J. Lipps 研究奖学金（资助对象：DVI）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Fluo4 AMLife TechnologiesF14217500 µl 二甲基亚砜（DMSO）溶液
FuraRed AMLife TechnologiesF-3020
多聚-L-赖氨酸（Poly-ʟ-lysine）Sigma-AldrichP4707
泊洛沙姆酸（Pluronic acid）Sigma-AldrichF-68溶液
离子霉素（Ionomycin）Sigma-AldrichI3909-1ML
试管旋转仪Miltenyi Biotec GmbH130-090-753德国
尼康共聚焦显微镜（倒置）尼康（Nikon）Nikon A1R激光激发波长 488 nm，发射滤光片 500–550 nm 和 570–620 nm
物镜尼康（Nikon）Plan Apo 60x/NA 1.4 油镜
盖玻片赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）6661B52
高真空润滑脂道康宁（Dow Corning）硅基化合物
软件尼康（Nikon）Nikon NIS-Elements
记录/灌流腔室沃纳仪器公司（Warner Instruments）RC-26
膜片钳放大器分子器件公司（Molecular Devices）MultiClamp 700B
数据采集系统分子器件公司（Molecular Devices）Digidata 1440AAxon Digidata® 系统
低通滤波器沃纳仪器公司（Warner Instruments）LPF-88 极贝塞尔滤波器
硼硅酸盐玻璃毛细管世界精密仪器公司（World Precision Instruments）1B150F-4
微电极拉制仪苏特仪器公司（Sutter Instrument Co）P-97Flaming/Brown 型微电极拉制仪
微电极抛光仪成机（Narishige）MF-830日本
电动显微操作器苏特仪器公司（Sutter Instrument Co）MP-225
倒置显微镜尼康（Nikon）Eclipse Ti
微振动隔离台TMC配备法拉第笼
多通道阀式灌流系统AutoMake ScientificValve Bank II
记录/灌流腔室沃纳仪器公司（Warner Instruments）RC-26
软件分子器件公司（Molecular Devices）pClamp 10.2
硝苯地平（Nicardipine）Sigma-AldrichN7510
伊比毒素（Iberiotoxin）SigmaI5904-5UG
尼氟灭酸（Niflumic acid）Sigma-AldrichN0630
DIDSSigma-AldrichD3514-25MG
四乙胺氯化物（TEA chloride）TocrisT2265
RPMI 1640 培养基Life Technologies11835030不含抗生素
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA832730% 白蛋白溶液
温控手术台MCW 核心设施（MCW core）适用于啮齿类动物
不锈钢筛网：#100（150 μm）、#140（106 μm）
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200费舍尔科技（Fisher Sci）50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270费舍尔科技（Fisher Sci）50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400费舍尔科技（Fisher Sci）50-871-320
200 目筛网Sigma-Aldrichs4145用于 CD-1 小鼠
双目显微镜尼康（Nikon）Eclipse TS100
双目显微镜尼康（Nikon）SMZ745
基于注射泵的灌流系统哈佛仪器公司（Harvard Apparatus）
聚乙烯导管Sigma-AldrichPE50
异氟烷麻醉剂figure-materials-1 VetEquip, Inc.911103
其他基础试剂Sigma-Aldrich

参考文献

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