足细胞内钙离子水平的变化是调控肾小球滤过功能最重要的机制之一。本文介绍了一种高通量方法，可用于检测新鲜分离的肾小球足细胞中钙离子的实时动态变化以及单个离子通道的活性。
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本文内容
摘要
摘要
足细胞（肾小球上皮细胞）被认为可调节肾小球通透性并维持肾小球结构；已有明确证据表明，这些细胞在多种肾脏疾病发病机制中发挥关键作用，因为足细胞损伤会导致蛋白尿和足突融合。先前有报道称，多种内源性物质可能引起足细胞内 Ca2+ 浓度显著升高，可能导致白蛋白尿，而这一过程可能通过钙离子通道介导。因此，研究足细胞在正常条件及不同病理状态下的钙离子调控显得尤为重要。然而，现有的实验方法仍主要局限于培养细胞和转染细胞。尽管这些模型为相关研究提供了良好的基础，但它们本质上已脱离了肾小球的天然微环境。本文描述了一种将足细胞作为新鲜分离的完整肾小球组成部分进行研究的方法学。该制备方法保留了足细胞的功能潜力，因其仍附着于毛细血管壁上，从而使其处于能够维持肾小球滤过装置主要结构的环境中。本论文详细阐述了两种实验方法：1）借助比率式共聚焦荧光显微镜实时检测钙离子浓度变化；2）记录新鲜分离肾小球中足细胞单个离子通道的活动。这些方法充分利用了肾小球天然微环境的优势，使研究人员能够解析足细胞在施加不同试剂后胞内钙离子调控的急性变化，测定细胞内基础钙离子浓度（例如用于评估疾病进展），并在单个离子通道水平上评估和调控钙离子电导。
引言
肾脏通过调节血容量来维持多种物质的稳态平衡，从而决定总体血压。肾小球滤过、重吸收或分泌功能的紊乱会导致或伴随一系列病理状态，从高血压或低血压到终末期肾病，后者最终需要进行肾移植。肾滤过单位（肾小球）由三层结构组成——毛细血管内皮、基底膜以及一层单层的上皮细胞——即足细胞，后者在维持裂孔隔膜完整性和功能中发挥重要作用1。肾小球选择性滤过屏障功能障碍会导致大分子物质经尿液丢失，例如蛋白尿。多种因素可影响足细胞及其足突结构，而这些结构决定了肾小球滤过屏障的完整性。
足细胞参与维持肾小球的滤过功能。已有研究证实，足细胞对钙离子的异常处理会导致细胞损伤，并在多种类型肾病的进展中发挥重要作用2,3。因此，建立一种能够直接测量细胞内钙离子浓度变化的模型，将对足细胞功能的研究具有重要意义。此前，分离的肾小球已被广泛应用于多项研究中，包括白蛋白反射系数变化的测定4，以及全细胞膜片钳电生理记录中对整体细胞电流的评估5,6。本文所述的实验方案可使研究人员能够测量足细胞在药物刺激下细胞内钙离子浓度的变化，评估细胞内钙离子的基础水平，并分析单个钙离子通道的活性。本研究采用比率法钙离子浓度检测和膜片钳电生理技术，分别测定足细胞内钙离子浓度的变化及离子通道活性。
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方案
动物使用和福利应遵循经机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的方案，符合《实验动物护理和使用指南》（NIH指南）的要求。
1. 肾脏灌注
- 使用8至12周龄的雄性大鼠（建议使用Sprague Dawley品系，但也可根据适当调整使用其他品系、不同年龄或性别的大鼠）。
- 根据IACUC批准的实验动物使用规程对动物进行麻醉，监测麻醉深度并检查动物状态。1.3至1.8步骤中所述手术的详细描述可参见Ilatovskaya et al.7。
- 在充分麻醉后，将动物置于温度可控的手术台上，沿腹部正中线做切口（长度可达3英寸），暴露下腔静脉和主动脉。
- 在腹腔干、肠系膜上动脉以及其上方的腹主动脉周围置入结扎线，但暂不结扎。
- 钝性分离肾动脉下方的腹主动脉，并在其周围放置两道结扎线，暂不结扎；随后在结扎线上方夹闭主动脉，并结扎下方的结扎线。
- 在夹闭下方的腹主动脉处插入连接至注射泵（内含PBS）的聚乙烯PE50导管，并用第二道结扎线固定导管；移除动脉夹，启动注射泵，随后结扎腹主动脉以及腹腔干与肠系膜上动脉。迅速切开肾静脉以释放压力。
- 以6 ml/min的流速，用预冷的PBS灌注主动脉2至3分钟。
- 停止灌注，取出肾脏并剥除包膜7，将肾脏置于含PBS的冰上。根据IACUC批准....
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结果
本文探讨了足细胞内钙离子水平急性变化的检测问题。图1展示了实验方案的示意图，该方案旨在对新鲜分离的啮齿类动物肾小球足细胞进行高分辨率活细胞荧光共聚焦成像以及单离子通道活性记录。简言之，在大鼠麻醉后，应使用PBS灌注肾脏以清除血液。随后切除并去包膜肾脏，通过差速筛分法从肾皮质中分离肾小球。样品的一部分可用于膜片钳分析，其余部分则可加载荧光钙离子染料Fluo-4, AM和Fura Red, AM，以进行共聚焦比率钙成像。
在分离肾小球后，可立即进行单离子通道活性的电生理学测量。可采用膜片钳技术的细胞贴附式和全细胞式两种构型来测量离子通道的活性。为验证本方法的可行性，展示了单个类似TRPC的钙离子通道活性的记录结果（图2）。此外，还可施加可穿透细胞或与受体结合的药物，以检测其对足细胞中钙离子内流在单离子通道水平上的影响。
一种可用于评估单个离子通道活性的方法能够产生多种数据，用以表征足细胞的功能。然而，通过检测整个细胞水平上的钙离子浓度变化，可极大地补充该方法的信息.......
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讨论
本文所述方法可用于分析啮齿类动物肾小球足细胞的钙处理能力。该技术可同时应用膜片钳单通道电生理学和荧光比率共聚焦成像，但两种方法也可独立使用。本方案包含若干相对简单的步骤：1）肾脏灌流；2）通过差速筛分法分离肾小球；3）进行膜片钳电生理实验，或用荧光钙标记染料孵育肾小球，以进行细胞内钙变化的比率共聚焦成像。
为了分离肾小球，采用了一种基于 Gloy et al.5 的改良方案。差速筛分法的主要优势在于能够获得去除鲍曼囊的肾小球，从而避免了复杂且耗时的手工去囊步骤。在分离得到的肾小球组分中，大多数为去囊肾小球，但研究者必须意识到其中也存在部分带囊肾小球。务必确保对已去除鲍曼囊的肾小球进行成像，因为囊膜会阻碍药物到达足细胞。如图2所示，去囊肾小球表面粗糙，具有明显的毛细血管和足细胞体，而带囊肾小球则呈现光滑且呈圆形。此外，与去囊肾小球相比，带有囊膜且负载 Fluo4 和 FuraRed 的肾小球发出的荧光信号较弱。
所获得的大鼠肾小球组分纯度达95%（含有少量近端小管残留），可根据需要直接用于.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Glen Slocum（威斯康星医学院）和 Colleen A. Lavin（尼康仪器公司）在显微镜实验中提供的出色技术支持。感谢 Gregory Blass 对手稿的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 HL108880 和美国糖尿病协会资助项目 1-15-BS-172（资助对象：AS），以及美国肾脏病学会 Ben J. Lipps 研究奖学金（资助对象：DVI）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl 二甲基亚砜（DMSO）溶液 |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| 多聚-L-赖氨酸（Poly-ʟ-lysine） | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| 泊洛沙姆酸（Pluronic acid） | Sigma-Aldrich | F-68 | 溶液 |
| 离子霉素（Ionomycin） | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| 试管旋转仪 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | 德国 |
| 尼康共聚焦显微镜（倒置） | 尼康（Nikon） | Nikon A1R | 激光激发波长 488 nm，发射滤光片 500–550 nm 和 570–620 nm |
| 物镜 | 尼康（Nikon） | Plan Apo 60x/NA 1.4 油镜 | |
| 盖玻片 | 赛默飞世尔科技（Thermo Scientific） | 6661B52 | |
| 高真空润滑脂 | 道康宁（Dow Corning） | 硅基化合物 | |
| 软件 | 尼康（Nikon） | Nikon NIS-Elements | |
| 记录/灌流腔室 | 沃纳仪器公司（Warner Instruments） | RC-26 | |
| 膜片钳放大器 | 分子器件公司（Molecular Devices） | MultiClamp 700B | |
| 数据采集系统 | 分子器件公司（Molecular Devices） | Digidata 1440A | Axon Digidata® 系统 |
| 低通滤波器 | 沃纳仪器公司（Warner Instruments） | LPF-8 | 8 极贝塞尔滤波器 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 世界精密仪器公司（World Precision Instruments） | 1B150F-4 | |
| 微电极拉制仪 | 苏特仪器公司（Sutter Instrument Co） | P-97 | Flaming/Brown 型微电极拉制仪 |
| 微电极抛光仪 | 成机（Narishige） | MF-830 | 日本 |
| 电动显微操作器 | 苏特仪器公司（Sutter Instrument Co） | MP-225 | |
| 倒置显微镜 | 尼康（Nikon） | Eclipse Ti | |
| 微振动隔离台 | TMC | 配备法拉第笼 | |
| 多通道阀式灌流系统 | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| 记录/灌流腔室 | 沃纳仪器公司（Warner Instruments） | RC-26 | |
| 软件 | 分子器件公司（Molecular Devices） | pClamp 10.2 | |
| 硝苯地平（Nicardipine） | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| 伊比毒素（Iberiotoxin） | Sigma | I5904-5UG | |
| 尼氟灭酸（Niflumic acid） | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| 四乙胺氯化物（TEA chloride） | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11835030 | 不含抗生素 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% 白蛋白溶液 |
| 温控手术台 | MCW 核心设施（MCW core） | 适用于啮齿类动物 | |
| 不锈钢筛网： | #100（150 μm）、#140（106 μm） | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | 费舍尔科技（Fisher Sci） | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | 费舍尔科技（Fisher Sci） | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | 费舍尔科技（Fisher Sci） | 50-871-320 | |
| 200 目筛网 | Sigma-Aldrich | s4145 | 用于 CD-1 小鼠 |
| 双目显微镜 | 尼康（Nikon） | Eclipse TS100 | |
| 双目显微镜 | 尼康（Nikon） | SMZ745 | |
| 基于注射泵的灌流系统 | 哈佛仪器公司（Harvard Apparatus） | ||
| 聚乙烯导管 | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| 异氟烷麻醉剂 |  VetEquip, Inc. | 911103 | |
| 其他基础试剂 | Sigma-Aldrich |
参考文献
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of pro....
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