该共免疫沉淀实验方案可用于研究甲型流感病毒核蛋白与人细胞中抗病毒Mx1蛋白之间的相互作用。本方案强调了N-乙基马来酰亚胺在成功实现Mx1与甲型流感病毒核蛋白共免疫沉淀中的重要性。
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摘要
摘要
研究蛋白质之间的相互作用对于理解其功能至关重要。在复杂样品中研究蛋白质与其他大分子相互作用的一种非常强大的常用方法称为共免疫沉淀。本方案所述的共免疫沉淀方法可用于证明并进一步研究抗病毒的黏病毒抗性蛋白1（Mx1）与其病毒靶标之一——甲型流感病毒核蛋白（NP）之间的相互作用。该实验可从转染的哺乳动物细胞开始，也可使用甲型流感病毒感染的细胞作为起始材料。细胞裂解后，利用特异性抗体富集病毒NP蛋白，并通过蛋白G磁珠沉淀形成的免疫复合物。随后通过蛋白质印迹法检测NP蛋白的有效富集以及抗病毒Mx1蛋白的共免疫沉淀。成功实现Mx1与NP共免疫沉淀的前提条件是在细胞裂解缓冲液中加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）。NEM可烷基化游离的巯基。推测该反应通过维持Mx1蛋白、其病毒靶标或某种未知的第三组分的特定构象，从而稳定了较弱和/或瞬时的NP–Mx1相互作用。共免疫沉淀实验的一个重要局限性是可能因蛋白质非特异性结合于蛋白G磁珠或抗体而导致污染蛋白被意外富集。因此，必须设置对照实验以排除假阳性结果。本方案所述的共免疫沉淀方法可用于研究不同脊椎动物物种Mx蛋白与病毒蛋白之间的相互作用，或任意两种蛋白质之间，以及蛋白质与其他大分子之间的相互作用。NEM在稳定弱和/或瞬时相互作用方面的有益作用需针对每一对相互作用蛋白单独验证。
引言
黏病毒抗性（Mx）蛋白是抵御病毒病原体的先天免疫防御系统的重要组成部分。这些蛋白属于大型的、类似动力蛋白的GTP酶，可由I型和III型干扰素诱导产生。相应的Mx基因几乎存在于所有脊椎动物中，以单拷贝或多拷贝形式存在，其基因产物可抑制多种病毒，包括正黏病毒科（例如，流感病毒）、弹状病毒科（例如，水疱性口炎病毒）、布尼亚病毒科（例如，拉克罗斯病毒）和逆转录病毒科（例如，人类免疫缺陷病毒-1）1-4。目前尚不清楚这些蛋白如何识别如此广泛的病毒，因为这些病毒之间并无明显共有的初级序列基序。通过分析Mx蛋白与其病毒靶标之间的相互作用，可能涉及与其他宿主细胞因子形成的高级复合物，将有助于阐明病毒与其宿主之间“军备竞赛”中所演化的分子机制。
哺乳动物Mx蛋白与病毒靶标的相互作用在人MxA蛋白中研究得最为深入。人MxA能够抑制多种病毒的复制，包括正黏病毒科的甲型流感病毒和托高土病毒。MxA结合托高土病毒的核糖核蛋白复合物（vRNP），从而阻止其进入细胞核，进而阻断感染过程5。MxA与托高土病毒vRNP之间的这种相互作用已通过共沉降和共免疫沉淀实验得到证实6-9。然而，Mx蛋白如何抑制甲型流感病毒尚不明确。一个主要问题是，难以直接证明Mx蛋白与甲型流感病毒基因产物之间存在相互作用。有一项....
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方案
注意：以下转染与共免疫沉淀实验方案适用于9 cm培养皿。其他规格经适当缩放后也可使用。
1. 接种人胚胎肾（HEK）293T细胞
- 转染前一天，将 HEK293T 细胞以每 9 cm 培养皿 1.2 × 106 个细胞的密度接种于 12 ml 添加了 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、0.4 mM Na-丙酮酸盐、0.1 mM 非必需氨基酸、100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
- 在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞 16 小时。
- 转染前使用倒置光学显微镜观察细胞形态和活力。为获得最佳转染效率，细胞应处于亚汇合状态。
2. HEK293T细胞的磷酸钙转染
注意：每个9 cm培养皿使用0.5–1 µg的pCAXL-NP或空pCAXL质粒，与1–3 µg的pCAXL-Mx1联合使用。所有样品中质粒DNA总量应保持相等；必要时用空质粒补足。
- 准备以下转染缓冲液：
- 配制含1.0 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.1 mM EDTA（pH 8.0）的Tris-EDTA（TE）缓冲液。
- 配制含25 mM ....
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结果
N-乙基马来酰亚胺是一种有机化合物，可用于不可逆地修饰游离巯基。 例如 以抑制半胱氨酸蛋白酶（图1).
抗病毒Mx1蛋白通过与流感病毒核蛋白（NP）相互作用来抑制甲型流感病毒的复制。本文所述的优化共免疫共沉淀实验方案可用于研究NP与Mx1之间的相互作用。在有或无流感病毒NP蛋白共表达的情况下，将抗病毒Mx1蛋白的表达载体转染至HEK293T细胞中。随后，使用NP特异性的单克隆抗体从全细胞裂解液中沉淀NP蛋白。图2显示，仅在共表达NP蛋白的情况下，Mx1蛋白才能被共免疫共沉淀。在无NP蛋白表达时，Mx1蛋白可能出现非特异性共沉淀，其原因可能是抗NP抗体非特异性地拉下了Mx1蛋白，或Mx1蛋白非特异性地结合于蛋白G磁珠。因此，实验中必须始终设置阴性对照，以评估此类非特异性共沉淀现象。图3显示，NP与Mx1的相互作用仅在存在NEM的条件下才能被检测到。在该实验中，通过在无抗NP抗体条件下进行共免疫共沉淀反应，评估了Mx1蛋白与蛋白G磁珠之间的非特异性结合。
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讨论
研究抗病毒蛋白与其病毒靶标之间的相互作用，对于理解这些蛋白抗病毒机制的细节至关重要。这有助于深入了解病毒与其宿主共同进化的机制，并为开发新的抗病毒策略提供基础。本文所述的优化共免疫沉淀实验方案可用于研究小鼠Mx1蛋白与其病毒靶标——流感病毒NP蛋白之间的相互作用。该方案最关键的步骤是在裂解缓冲液中添加NEM，因为在缺乏NEM的情况下，NP与Mx1的相互作用无法被检测到（图3）。目前尚不清楚为何NEM的存在对该相互作用的检测至关重要。然而，该方案可能适用于研究其他微弱和/或瞬时的蛋白质相互作用，特别是当这些相互作用依赖于特定蛋白构象的稳定，且涉及半胱氨酸残基时。
共免疫沉淀实验的一个重要局限性在于，能否获得高亲和力识别相互作用蛋白之一构象表位的特异性高质量抗体。我们实验室制备的抗Mx1多克隆抗血清无法用于验证NP与Mx1之间的相互作用。该抗血清即使在无Mx1存在的情况下，也能免疫沉淀流感病毒NP蛋白。此外，所使用的抗NP单克隆抗体仅识别A/Puerto Rico/8/34流感毒株的NP蛋白，遗憾的是，其不适用于沉淀禽流感病毒毒株的NP蛋白。本共免疫沉.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由弗拉芒研究基金会（FWO-Vlaanderen）、IOF 项目 IOF10/StarTT/027 以及根特大学特别研究基金 BOF12/GOA/014 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 高糖 | Gibco | 52100-047 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | E-3876 | 有毒 |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | 也称为 NP40 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11 873 580 001 | |
| 抗 NP 单克隆抗体 | 美国国立卫生研究院生物防御与新发感染研究资源库 | NR-4282 | A1 和 A3 克隆的腹水混合物 |
| 抗 RNP 多克隆血清 | 美国国立卫生研究院生物防御与新发感染研究资源库 | NR-3133 | 靶向 A/苏格兰/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL 蛋白印迹底物 | Pierce | 32106 |
参考文献
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
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重印与许可
