该共免疫沉淀实验方案可用于研究甲型流感病毒核蛋白与人细胞中抗病毒Mx1蛋白之间的相互作用。本方案强调了N-乙基马来酰亚胺在成功实现Mx1与甲型流感病毒核蛋白共免疫沉淀中的重要性。
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摘要
摘要
研究蛋白质之间的相互作用对于理解其功能至关重要。在复杂样品中研究蛋白质与其他大分子相互作用的一种非常强大的常用方法称为共免疫沉淀。本方案所述的共免疫沉淀方法可用于证明并进一步研究抗病毒的黏病毒抗性蛋白1（Mx1）与其病毒靶标之一——甲型流感病毒核蛋白（NP）之间的相互作用。该实验可从转染的哺乳动物细胞开始，也可使用甲型流感病毒感染的细胞作为起始材料。细胞裂解后，利用特异性抗体富集病毒NP蛋白，并通过蛋白G磁珠沉淀形成的免疫复合物。随后通过蛋白质印迹法检测NP蛋白的有效富集以及抗病毒Mx1蛋白的共免疫沉淀。成功实现Mx1与NP共免疫沉淀的前提条件是在细胞裂解缓冲液中加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）。NEM可烷基化游离的巯基。推测该反应通过维持Mx1蛋白、其病毒靶标或某种未知的第三组分的特定构象，从而稳定了较弱和/或瞬时的NP–Mx1相互作用。共免疫沉淀实验的一个重要局限性是可能因蛋白质非特异性结合于蛋白G磁珠或抗体而导致污染蛋白被意外富集。因此，必须设置对照实验以排除假阳性结果。本方案所述的共免疫沉淀方法可用于研究不同脊椎动物物种Mx蛋白与病毒蛋白之间的相互作用，或任意两种蛋白质之间，以及蛋白质与其他大分子之间的相互作用。NEM在稳定弱和/或瞬时相互作用方面的有益作用需针对每一对相互作用蛋白单独验证。
引言
黏病毒抗性（Mx）蛋白是抵御病毒病原体的先天免疫防御系统的重要组成部分。这些蛋白属于大型的、类似动力蛋白的GTP酶，可由I型和III型干扰素诱导产生。相应的Mx基因几乎存在于所有脊椎动物中，以单拷贝或多拷贝形式存在，其基因产物可抑制多种病毒，包括正黏病毒科（例如，流感病毒）、弹状病毒科（例如，水疱性口炎病毒）、布尼亚病毒科（例如，拉克罗斯病毒）和逆转录病毒科（例如，人类免疫缺陷病毒-1）1-4。目前尚不清楚这些蛋白如何识别如此广泛的病毒，因为这些病毒之间并无明显共有的初级序列基序。通过分析Mx蛋白与其病毒靶标之间的相互作用，可能涉及与其他宿主细胞因子形成的高级复合物，将有助于阐明病毒与其宿主之间“军备竞赛”中所演化的分子机制。
哺乳动物Mx蛋白与病毒靶标的相互作用在人MxA蛋白中研究得最为深入。人MxA能够抑制多种病毒的复制，包括正黏病毒科的甲型流感病毒和托高土病毒。MxA结合托高土病毒的核糖核蛋白复合物（vRNP），从而阻止其进入细胞核，进而阻断感染过程5。MxA与托高土病毒vRNP之间的这种相互作用已通过共沉降和共免疫沉淀实验得到证实6-9。然而，Mx蛋白如何抑制甲型流感病毒尚不明确。一个主要问题是，难以直接证明Mx蛋白与甲型流感病毒基因产物之间存在相互作用。有一项研究报告了在甲型流感病毒感染的细胞中，人MxA与NP蛋白之间存在相互作用10。但这种相互作用仅在细胞裂解前用交联试剂二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸）处理后，才能通过共免疫沉淀检测到，提示该相互作用可能是瞬时的或较弱的。最近的研究表明，不同甲型流感病毒株对Mx蛋白敏感性的差异取决于NP蛋白的来源11,12。与此一致的是，甲型流感病毒可通过突变NP蛋白中的特定残基部分逃逸Mx蛋白的抑制作用13。这表明宿主Mx蛋白抑制甲型流感病毒的主要靶标很可能是NP蛋白，尤其是组装在vRNP复合物中的NP蛋白。然而，这些近期的研究均未证实流感病毒NP蛋白或vRNP复合物与人MxA或小鼠Mx1之间存在直接相互作用。
最近，我们首次通过优化的共免疫沉淀实验方案，证实了流感病毒核蛋白（NP）与小鼠 Mx1 蛋白之间的相互作用14，此处将对其进行详细描述。通常，共免疫沉淀是研究蛋白质-蛋白质相互作用最常用的生化方法之一。该技术常优于其他替代方法， 例如， 酵母双杂交，因为它能够在蛋白质的天然环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用。如果存在针对目标蛋白的抗体，则可对内源性表达的蛋白质进行共免疫沉淀。或者，可通过转染或感染在细胞中表达目标蛋白，并可使用亲和标签。除了上述优点外，本研究所描述的共免疫沉淀方案还能够检测弱相互作用和/或瞬时的蛋白质相互作用。该优化方案的主要组分是在细胞裂解缓冲液中添加N-乙基马来酰亚胺（NEM）。NEM是一种烷基化试剂，在pH 6.5–7.5条件下可与半胱氨酸中的游离巯基反应，形成稳定的硫酯图1在较高 pH 下，NEM 也可与氨基反应或发生水解15NEM通常用于阻断游离巯基，以防止二硫键形成或抑制酶活性。例如，NEM常用于抑制去SUMO化酶的活性，这类酶属于半胱氨酸蛋白酶。在本描述的共免疫沉淀实验方案中，裂解缓冲液最初含有NEM，因为已有报道指出流感病毒蛋白的SUMO化修饰可能影响病毒蛋白之间的相互作用。16令人意外的是，在通过共免疫沉淀实验记录流感病毒NP与小鼠Mx1之间相互作用时，加入NEM被证明是关键步骤。目前尚不清楚为何添加NEM对于检测NP–Mx1相互作用至关重要，可能是因为该相互作用过于短暂和/或微弱。NEM可能起到稳定这一相互作用的作用。 例如， 通过维持Mx1的特定构象、病毒蛋白甚至某种未知的第三组分而实现。NEM的这种稳定作用此前已有报道， 例如， 核糖核苷酸还原酶M1与其抑制剂吉西他滨（F2dC）之间的相互作用17Mx1 和 NP 均含有多个半胱氨酸残基，这些残基可被 NEM 修饰。例如，Rennie 近期的一项研究 等 已证明无茎部的MxA变异体含有三个暴露于溶剂的半胱氨酸残基，可被碘乙酰胺修饰。将这些残基突变为丝氨酸不影响MxA的酶活性，但可阻止由二硫键介导的聚集。18由于这些半胱氨酸在Mx1中是保守的，这表明Mx1中相应的半胱氨酸也可能被NEM修饰，从而影响其构象或溶解度。此外，NEM还可能影响Mx1的GTP酶活性，而GTP酶活性对Mx1的抗流感病毒功能至关重要，进而可能稳定Mx1与NP之间的相互作用。然而，NEM对Mx1的GTP酶活性产生直接作用的可能性较小，因为NEM在检测流感病毒NP与GTP酶失活的Mx1突变体之间相互作用时同样必不可少。14显然，需要进一步的研究来阐明NEM对NP–Mx1相互作用的影响。
总之，所述的共免疫沉淀实验方案可用于研究抗病毒Mx1蛋白与其病毒靶标——流感病毒NP蛋白之间的相互作用。该方案也可用于研究其他依赖特定蛋白质构象稳定的弱相互作用或瞬时相互作用。此前已有文献报道过依赖特定构象的蛋白质-蛋白质相互作用。 例如， 对于钙结合蛋白，如钙调蛋白19最后，NEM 的有益作用也可应用于其他检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法中，例如共沉淀实验。
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方案
注意：以下转染与共免疫沉淀实验方案适用于9 cm培养皿。其他规格经适当缩放后也可使用。
1. 接种人胚胎肾（HEK）293T细胞
- 转染前一天，将 HEK293T 细胞以每 9 cm 培养皿 1.2 × 106 个细胞的密度接种于 12 ml 添加了 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、0.4 mM Na-丙酮酸盐、0.1 mM 非必需氨基酸、100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
- 在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞 16 小时。
- 转染前使用倒置光学显微镜观察细胞形态和活力。为获得最佳转染效率，细胞应处于亚汇合状态。
2. HEK293T细胞的磷酸钙转染
注意：每个9 cm培养皿使用0.5–1 µg的pCAXL-NP或空pCAXL质粒，与1–3 µg的pCAXL-Mx1联合使用。所有样品中质粒DNA总量应保持相等；必要时用空质粒补足。
- 准备以下转染缓冲液：
- 配制含1.0 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.1 mM EDTA（pH 8.0）的Tris-EDTA（TE）缓冲液。
- 配制含25 mM HEPES（5.96 g/L，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、274 mM NaCl（16 g/L）、10 mM KCl（0.74 g/L）、1.5 mM NaHPO4·12H2O（0.5 g/L）和11.1 mM葡萄糖（2 g/L）的BS/HEPES缓冲液。用NaOH调节pH至7.05。
- 配制含1.25 M CaCl2·2H2O（183.8 g/L）和125 mM HEPES（29.79 g/L）的CaCl2/HEPES缓冲液。用NaOH调节pH至7.05。
- 使用前将转染缓冲液预热至37 °C。
- 通过将质粒DNA稀释于600 µl TE缓冲液中来制备质粒样品。将这些混合物加入6孔板的孔中。
- 以逐滴方式向质粒样品中加入150 µl CaCl2/HEPES缓冲液，并用移液器上下吹打3次混匀。
- 在新的6孔板中，将质粒溶液（TE + DNA + CaCl2/HEPES；共750 µl）逐滴加入750 µl BS/HEPES缓冲液中，以制备转染溶液。将质粒溶液均匀滴加至含有BS/HEPES缓冲液的整个孔中。
- 将转染溶液置于板式摇床上，以1,000 RPM振荡90秒。
- 室温孵育混合物5分钟。
- 将转染溶液（1.5 ml）逐滴加入细胞中。使用P1000微量移液器将转染溶液滴加到细胞表面。将混合物均匀分散至整个9 cm培养皿中，并轻轻晃动培养板。
- 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育6小时。随后通过抽吸去除培养基，并立即更换为12 ml新鲜预热的培养基。添加新鲜培养基时应轻柔操作，以防止细胞脱落。操作时，将移液器吸头紧贴孔壁，缓慢推出培养基。
- 继续将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育额外16小时。
3. 共免疫沉淀
注意：转染后 24 小时进行共免疫沉淀实验。
- 低盐裂解缓冲液和高盐洗涤缓冲液的制备。
- 称取适量N-乙基马来酰亚胺（NEM），溶于无水乙醇中，配制2 M的NEM储备液。NEM储备液需现用现配。
警告：NEM 毒性很强，配制和使用该储存液时应在通风橱中进行。 - 配制低盐裂解缓冲液，组分为 50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1% NP40 和蛋白酶抑制剂混合物（将 1 片抑制剂溶于 50 ml 裂解缓冲液中）。加入 NEM 至终浓度为 25 mM（即， 稀释1:80）。加入蛋白酶抑制剂和NEM后，置于冰上保存。
注意：使用前务必新鲜加入蛋白酶抑制剂和NEM。 - 配制高盐洗涤缓冲液，组成为 50 mM Tris-HCl pH 8、500 mM NaCl、5 mM EDTA 和 1% NP40。注意高盐洗涤缓冲液不含 NEM。
- 称取适量N-乙基马来酰亚胺（NEM），溶于无水乙醇中，配制2 M的NEM储备液。NEM储备液需现用现配。
- 细胞裂解物的制备
- 吸除培养基，用 2 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入洗涤缓冲液时动作需非常轻柔，因为 HEK293T 细胞容易脱落。
- 吸除 PBS，每 9 cm 培养皿中加入 600 µl 冰冷的低盐裂解缓冲液。
- 将培养板置于冰上孵育20分钟。确保培养板保持水平，以使裂解缓冲液充分覆盖板面。每5分钟轻轻振荡培养板一次。
- 将细胞裂解液收集至1.5 ml微量离心管中，在4 °C、16,000 × g条件下离心3分钟，使不溶性组分沉淀。
- 转移可溶性组分， 即 将细胞裂解液转移至新的1.5 ml微量离心管中，置于冰上保存。立即继续进行共免疫沉淀实验，以防止相互作用的蛋白质解离。后续所有步骤应尽可能在冰上或4 °C条件下操作，以抑制裂解液中的蛋白水解活性。
- 免疫复合物的制备
注意：在此步骤中，目标蛋白由相应的抗体结合。为研究NP–Mx1相互作用，请使用小鼠抗NP单克隆抗体。- 每个样本中，将135 µl裂解液与2 µl抗NP单克隆抗体及113 µl低盐裂解缓冲液混合（总体积为250 µl）。剩余裂解液储存于-20 °C，用于后续分析（如蛋白质印迹），以检测转染细胞中推测的相互作用蛋白的表达水平。
注意：或者，测定裂解液的蛋白浓度（例如 使用Bradford试剂）并采用固定量的总蛋白， 例如， 400 µg，每份裂解液。 - 将抗体-裂解液混合物在4 °C下于旋转仪上孵育3小时。此步骤可延长至过夜孵育。
- 每个样本中，将135 µl裂解液与2 µl抗NP单克隆抗体及113 µl低盐裂解缓冲液混合（总体积为250 µl）。剩余裂解液储存于-20 °C，用于后续分析（如蛋白质印迹），以检测转染细胞中推测的相互作用蛋白的表达水平。
- 蛋白G磁珠的制备
注意：蛋白G珠子以20%乙醇保存并以此状态运输。珠子悬液通常含有50%的珠子，使用前需洗涤，以用于免疫沉淀免疫复合物。- 使用50 µl的磁珠， 即， 每个样品取100 µl珠子悬液。将共免疫沉淀实验所需的所有样品的珠子总量置于同一管中进行洗涤。剪去1 ml移液枪头的尖端，以便更顺畅地移取珠子悬液。
- 在 8,000 × g 和 4 °C 条件下离心蛋白 G 珠-悬液 30 秒。去除乙醇溶液，加入等体积低盐裂解缓冲液。在 8,000 × g 和 4 °C 条件下离心蛋白 G 珠-悬液 30 秒，小心去除上清液。重复此洗涤步骤 3 次。
注意：用于洗涤磁珠的低盐裂解缓冲液无需含有蛋白酶抑制剂或NEM。 - 估算蛋白G磁珠的体积，并加入等体积的低盐裂解缓冲液，配制低盐裂解缓冲液中的50%磁珠悬液。
- 每个样本取100 µl珠悬液，转移至新的1.5 ml微量离心管中，冰上保存备用。分装前请充分重悬珠悬液，因为这些珠子会迅速沉降至管底。
- 利用蛋白G磁珠对免疫复合物进行免疫沉淀及其洗脱。
- 在使用蛋白G磁珠进行免疫沉淀之前，将所有离心管在8,000 × g、4 °C条件下离心30秒，并通过目视检查确认各样品中的磁珠量相等。如有必要，调整部分样品中的磁珠量，并再次离心。弃去上清液，注意不要扰动沉淀的蛋白G磁珠。
- 短暂离心免疫复合物（即，将含有抗体的裂解液（250 µl）在 8,000 x g、4 °C 条件下离心 30 秒，使样品完全沉降至管底。转移免疫复合物至蛋白 G 琼脂糖 beads（50 µl）中。
- 4 °C 条件下在旋转仪上孵育 60 分钟。为减少蛋白质非特异性结合至蛋白 G 琼脂糖珠，免疫复合物与琼脂糖珠孵育时间不得超过 75 分钟。
- 以8,000 × g在4 °C离心蛋白G磁珠（含结合的免疫复合物）30秒，弃去上清液。注意勿扰动沉淀的蛋白G磁珠。可选：将此上清液于4 °C或-20 °C保存，以备后续分析。 例如， 以估算游离蛋白质的含量。
- 用900 µl高盐裂解缓冲液洗涤蛋白G磁珠约5分钟。确保磁珠在洗涤缓冲液中充分重悬，以实现最佳洗涤效果。在8,000 × g、4 °C条件下离心30秒，弃去上清液。重复此洗涤步骤4次。操作时需小心，避免扰动沉淀的蛋白G磁珠，以防免疫沉淀物损失。
- 最后一次洗涤步骤后，加入 50 µl 的 2x 向珠子中加入Laemmli样品缓冲液，95 °C加热10分钟，以洗脱（共）免疫沉淀的蛋白质。
- 配制10 ml 6x Laemmli缓冲液：称取1 g十二烷基硫酸钠，加入3.5 ml甘油、3.5 ml 1 M Tris-HCl（pH 6.8）和420 µl β-巯基乙醇。用蒸馏水定容至10 ml。使用蒸馏水稀释3倍，得到2x Laemmli缓冲液。
注意：β-巯基乙醇具有毒性，配制和使用Laemmli缓冲液时应在通风橱中进行。
- 配制10 ml 6x Laemmli缓冲液：称取1 g十二烷基硫酸钠，加入3.5 ml甘油、3.5 ml 1 M Tris-HCl（pH 6.8）和420 µl β-巯基乙醇。用蒸馏水定容至10 ml。使用蒸馏水稀释3倍，得到2x Laemmli缓冲液。
- 加热后，将蛋白G珠在8,000 × g离心30秒，样品置于4 °C（短期）或-20 °C（长期）保存。
4. 分析（共）免疫沉淀的蛋白质
- 通过 SDS-PAGE20 和 Western 印迹法21,22 检测共免疫沉淀所得细胞裂解液及洗脱液中的蛋白质。通常将 Laemmli 洗脱液的一半上样至凝胶中。取样上样时需注意不要扰动已沉淀的蛋白 G 珠。Mx1 和 NP 的表达分别使用抗 Mx1 抗体和抗 NP 抗体进行检测14。蛋白条带通过基于 HRP 的化学发光法检测，并使用 X 射线胶片显影仪显影。
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结果
N-乙基马来酰亚胺是一种有机化合物，可用于不可逆地修饰游离巯基。 例如 以抑制半胱氨酸蛋白酶（图1).
抗病毒Mx1蛋白通过与流感病毒核蛋白（NP）相互作用来抑制甲型流感病毒的复制。本文所述的优化共免疫共沉淀实验方案可用于研究NP与Mx1之间的相互作用。在有或无流感病毒NP蛋白共表达的情况下，将抗病毒Mx1蛋白的表达载体转染至HEK293T细胞中。随后，使用NP特异性的单克隆抗体从全细胞裂解液中沉淀NP蛋白。图2显示，仅在共表达NP蛋白的情况下，Mx1蛋白才能被共免疫共沉淀。在无NP蛋白表达时，Mx1蛋白可能出现非特异性共沉淀，其原因可能是抗NP抗体非特异性地拉下了Mx1蛋白，或Mx1蛋白非特异性地结合于蛋白G磁珠。因此，实验中必须始终设置阴性对照，以评估此类非特异性共沉淀现象。图3显示，NP与Mx1的相互作用仅在存在NEM的条件下才能被检测到。在该实验中，通过在无抗NP抗体条件下进行共免疫共沉淀反应，评估了Mx1蛋白与蛋白G磁珠之间的非特异性结合。
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讨论
研究抗病毒蛋白与其病毒靶标之间的相互作用，对于理解这些蛋白抗病毒机制的细节至关重要。这有助于深入了解病毒与其宿主共同进化的机制，并为开发新的抗病毒策略提供基础。本文所述的优化共免疫沉淀实验方案可用于研究小鼠Mx1蛋白与其病毒靶标——流感病毒NP蛋白之间的相互作用。该方案最关键的步骤是在裂解缓冲液中添加NEM，因为在缺乏NEM的情况下，NP与Mx1的相互作用无法被检测到（图3）。目前尚不清楚为何NEM的存在对该相互作用的检测至关重要。然而，该方案可能适用于研究其他微弱和/或瞬时的蛋白质相互作用，特别是当这些相互作用依赖于特定蛋白构象的稳定，且涉及半胱氨酸残基时。
共免疫沉淀实验的一个重要局限性在于，能否获得高亲和力识别相互作用蛋白之一构象表位的特异性高质量抗体。我们实验室制备的抗Mx1多克隆抗血清无法用于验证NP与Mx1之间的相互作用。该抗血清即使在无Mx1存在的情况下，也能免疫沉淀流感病毒NP蛋白。此外，所使用的抗NP单克隆抗体仅识别A/Puerto Rico/8/34流感毒株的NP蛋白，遗憾的是，其不适用于沉淀禽流感病毒毒株的NP蛋白。本共免疫沉...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由弗拉芒研究基金会（FWO-Vlaanderen）、IOF 项目 IOF10/StarTT/027 以及根特大学特别研究基金 BOF12/GOA/014 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 高糖 | Gibco | 52100-047 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | E-3876 | 有毒 |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | 也称为 NP40 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11 873 580 001 | |
| 抗 NP 单克隆抗体 | 美国国立卫生研究院生物防御与新发感染研究资源库 | NR-4282 | A1 和 A3 克隆的腹水混合物 |
| 抗 RNP 多克隆血清 | 美国国立卫生研究院生物防御与新发感染研究资源库 | NR-3133 | 靶向 A/苏格兰/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL 蛋白印迹底物 | Pierce | 32106 |
参考文献
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