通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

摘要

颅面骨细胞的组织结构长期以来一直被假设，但从未被直接观察到。多光谱细胞标记和 体内 活体 成像技术可实现对斑马鱼下颌动态细胞行为的可视化观察。本文详细描述了操作Zebrabow转基因斑马鱼的实验方案，以直接观察Meckel软骨中软骨细胞的细胞嵌合行为及形态学变化。

摘要

脊椎动物颅面结构的发育需要细胞迁移、增殖、黏附和分化的精确协调。作为第一咽弓的衍生物，梅克尔软骨的模式形成涉及颅神经嵴（CNC）细胞的迁移以及分化软骨细胞的逐步分区、增殖和有序排列。已有多个研究描述了下颌发育过程中颅神经嵴细胞的迁移 形态发生，但软骨细胞在梅克尔软骨生长与延伸过程中实现有序排列的具体机制仍不明确。 sox10 受限且由化学诱导的Cre重组酶介导的重组可产生不同荧光蛋白（RFP、YFP和CFP）的组合表达，从而实现对前体细胞及其子代的多光谱标记，反映不同的克隆群体。通过共聚焦时间推移成像，可观察斑马鱼麦氏软骨发育过程中软骨细胞的行为。

多光谱细胞标记技术使科学家能够展示麦克尔软骨细胞的延伸过程。 在麦克尔软骨（下颌骨的前体结构）的延伸阶段，软骨细胞通过有序地堆叠成单层细胞列，进行嵌入式排列以实现结构延伸。这一有序嵌入过程若未能正常介导细胞延伸，将导致下颌发育不全，这正是我们在下颌畸形中所观察到的细胞机制解释。

引言

颅面发育需要复杂的分子、细胞和组织相互作用，以驱动细胞增殖、迁移和分化^1,2,3。这一受到严密调控的复杂过程易受遗传和环境因素的干扰，导致颅面畸形成为最常见的出生缺陷之一^1-9。尽管目前颅面异常的主要治疗手段仍是外科手术，但深入了解其发育基础对于创新未来疗法至关重要。因此，研究形态发生过程中细胞汇聚与延伸以及细胞整合的机制，可为颅面骨骼的形成提供新的见解¹。

颅神经嵴细胞迁移并定植于第一咽弓，随后形成成对的下颌突，延伸并发育为迈克尔软骨（Meckel’s cartilage），该结构预先构建了下颌骨的基本形态。迈克尔软骨的形态发生依赖于软骨细胞通过定向增殖、细胞极化和分化所实现的有序排列^1,10。然而，软骨细胞在迈克尔软骨生长与延伸过程中如何精确组织的机制 仍不明确。深入理解细胞动态行为 对于认识影响下颌骨大小的先天性畸形（如下颌骨发育不全表型）至关重要¹¹。

斑马鱼胚胎在详细研究麦克尔软骨形态发生方面具有诸多发育和遗传优势。其遗传可操作性强、胚胎透明， 离体 快速发育是其显著优势，使其非常适用于通过活体成像观察细胞运动与组织过程⁶使用谱系追踪工具，例如 sox10kaede 转基因系中，我们及其他研究者已阐明胚胎颅面骨骼的神经嵴起源^1,5. 使用 sox10ERT2-Cre 与 ubi:Zebrabow-M 转基因品系使得探索颅面发育过程中细胞运动的细节成为可能。Zebrabow-M 是一种转基因品系，通过泛素启动子驱动多种荧光蛋白的表达，每种荧光蛋白两侧均带有 Lox 位点⁸斑马鱼Zebrabow-M系统的默认荧光蛋白为红色（RFP）。在诱导Cre表达后，Zebrabow-M构建体会发生重组，细胞将表达多种荧光蛋白（RFP、CFP和YFP）的组合，从而在胚胎中产生多光谱荧光标记。重组事件发生后，所有由标记细胞分裂产生的子代细胞均被克隆性地标记，使得源自相邻不同前体细胞的细胞群体均可被克隆性识别。通过此种克隆细胞标记方法，可实现对细胞增殖与迁移过程的克隆分辨率追踪。图1和图2).

方案

所有实验程序均经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号为 #2010N000106，符合国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）指南的要求。

1. 试剂与材料准备

1. 配制 1 L 的 50X E3 胚胎培养基（见表 1），并配制 1 L 的 1X E3 胚胎培养基（见表 2）。
2. 通过将 30 mg PTU（N-苯基硫脲）加入 1 L 的 1X E3 培养基中来制备含 N-苯基硫脲（PTU）的 E3 胚胎培养基。搅拌过夜以确保 PTU 完全溶解。室温保存。
3. 配制蛋白酶溶液：将 150 µl 蛋白酶（0.5 mg/ml）用 15 ml 1X E3 稀释。此量足以用于一个培养皿。现配现用。
4. 配制甲基纤维素溶液。
   1. 通过将 75 ml 0.2% 三卡因溶液与 25 ml 1X E3 混合，制备 E3-三卡因溶液。将 3 g 甲基纤维素在 75 ml E3-三卡因溶液中煮沸。
   2. 用 E3-三卡因溶液定容至 100 ml 。最终的甲基纤维素溶液呈黏稠、不透明、微黄色。储存条件：室温避光保存。
5. 他莫昔芬储备液与诱导溶液的配制
   1. 将 4-羟基他莫昔芬溶于 100% 乙醇中，配制 5 mM 的他莫昔芬储备液。储备液保存于 -80 °C。
   2. 使用前将他莫昔芬用 1X E3 新鲜稀释至所需浓度，以获得诱导溶液。注意！使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。
6. 根据表 3配制 1 L 的 0.2% 三卡因溶液。
7. 准备共聚焦显微镜载玻片。将四片盖玻片（18 × 18）粘合在一起形成一个方块，然后将两个这样的方块放置在 24 × 60 的盖玻片上，间距 2 cm，以便将胚胎固定在中间位置。

2. 胚胎制备

1. 转基因品系。
   注：Zebrabow-M 由 Alex Schier 实验室慷慨惠赠。
2. sox10: ERT2-Cre
   注：使用标准分子克隆方法及商业化获得的重组克隆技术，构建靶向载体 pDestTol2-sox10:ERT2-Cre。
   1. 在 LR 反应中，将包含 7.2 Kb sox10 启动子的 5’ 入门克隆（pENTR5’-sox10p）、Gateway 中间克隆（pME-ERT2-Cre）和 3’ 入门克隆（pENTR3’-polyA）与晶状体目的载体 pDestTol2-α-crystallin:YFP 进行重组。
   2. 纯化构建体 pDestTol2-sox10:ERT2-Cre。在单细胞期，将纯化的构建体（100 ng/µl）与 Tol2 转座酶 mRNA（50 ng/µl）共注射至野生型胚胎（F0）中。
   3. 通过 F1 代胚胎中强烈的黄色荧光筛选具有生殖系传递能力的 F0 成年 founder 鱼。
3. sox10: ERT2-Cre;Zebrabow-M
   1. 将 Zebrabow-M 品系（2.1.1）与 sox10:ERT2-Cre 转基因品系进行杂交。
   2. 挑选表现出强烈且广泛性 RFP 表达以及 YFP 晶状体标记的胚胎，并将其培育至成年。

3. 胚胎收集

1. 在第1天下午5点至6点之间，设置多对sox10:ERT2-Cre;Zebrabow-M转基因斑马鱼进行交配。
2. 次日早晨移除隔离板，并于中午左右收集受精卵。
3. 将受精卵转移至培养皿中，并加入15 ml 蛋白酶溶液以去除卵膜。
4. 孵育胚胎1至5分钟 ，直至约60%的胚胎完成去膜。通过倾倒去除蛋白酶溶液以终止反应，并用新鲜E3培养基清洗胚胎3–4次。
5. 将去膜后的胚胎在室温下于E3培养基中过夜孵育，使其发育至10体节阶段。每窝孵育50–60枚胚胎，以避免发育速度差异。

4. 治疗

1. 在明场显微镜下检查胚胎的发育阶段，确保其处于10个体节阶段。
2. 使用配备红色荧光蛋白（RFP）滤光片的荧光显微镜，挑选出红色荧光强烈的胚胎。
3. 向培养皿中加入10 µM羟基他莫昔芬溶液，诱导Cre重组酶活性，并将分离的胚胎在28.5 °C条件下孵育3小时。
4. 倾去他莫昔芬溶液，并用E3溶液多次清洗胚胎。
   警告！他莫昔芬溶液必须弃置于专用的生物废弃物容器中。
5. 将胚胎在28.5 °C条件下过夜孵育。
6. 当胚胎发育至约28–29个体节阶段（受精后约24小时），此后将胚胎在E3-PTU溶液中于28.5 °C继续孵育。
   注：此处使用PTU是为了抑制胚胎发育过程中黑色素细胞的形成。该处理对于避免自体荧光黑色素细胞对荧光信号造成干扰是必要的。
7. 将胚胎在28.5 °C条件下孵育

5. 胚胎筛选

1. 为了观察完全发育的颅面结构，选择受精后4天的胚胎，根据红色信号强度和视网膜中Cre表达标记阳性（黄色）进行筛选。
2. 用E3/0.015%三卡因溶液麻醉胚胎。轻轻触碰胚胎时，若未观察到主动运动或鳍部活动，则表明麻醉成功。

6. 在甲基纤维素中固定胚胎

1. 将选定的用于成像的胚胎转移至含有甲基纤维素液滴的培养皿中，并用甲基纤维素轻轻包埋胚胎。
2. 在洁净的共聚焦载玻片上滴加一滴新鲜甲基纤维素，使用微加载吸头将胚胎置于液滴中。将胚胎背侧朝上放置，注意避免直接接触胚胎。
3. 用25 × 25盖玻片覆盖已固定的胚胎，如有必要，可通过移动盖玻片来调整胚胎位置。
4. 胚胎现已准备好进行成像。

7. 荧光显微镜分析

1. 使用20倍干镜物镜（数值孔径0.75；针孔大小2.0 µm）对胚胎进行聚焦。
2. 按下显微镜上的L100按钮，并在软件中选择通道。
3. 选择共聚焦设置按钮，点击“自动”，然后在关闭窗口前选择以下通道：Ch1：CFP，Ch2：GFP，Ch3：RFP或mCherry。
4. 在点击“解除联锁”按钮之前，先打开Ch2和Ch3通道。点击“播放”开始扫描。
5. 对目标结构进行聚焦时，建议先以每秒½帧和高电压（HV）150开始，然后根据需要调整参数，直至获得理想的图像质量。RFP信号通常比其他颜色更亮，因此需相应调整HV值。改变Z轴位置以找到YFP和RFP双阳性细胞。
6. 参数设定完成后，采集胚胎图像。将图像以共聚焦成像软件格式和TIFF格式保存，用于各分通道的图像处理。
7. 接下来进行CFP成像时，关闭Ch2和Ch3通道，打开Ch1通道。在不改变聚焦区域的前提下，参照步骤5重新调整参数。
   注意：由于蓝色通道存在背景信号，CFP检测可能较为困难，可通过调整针孔大小来克服。较大的针孔尺寸有助于降低信号/背景噪声比，从而提高荧光检测效率。然而，较大的针孔会减弱共聚焦效果，影响图像质量。因此，必须仔细调整参数，以获得理想的图像质量和信号强度。
8. 采集图像后，以两种格式（共聚焦软件格式和TIFF格式）保存，用于后续图像处理。随后可使用常见的图像处理软件对图像进行图层合并及色彩设置优化，具体方法可参考Pan及其同事的描述⁸。

结果

通过整体 alcian blue 染色对软骨进行传统可视化，对于观察 Meckel 软骨的发育过程具有重要价值，并常用于显示最终的细胞排列结构¹²（图 1A）。为了进一步分析软骨细胞在发育过程中的动态变化，利用 sox10:Kaede 转基因品系进行谱系示踪，使我们能够在活体胚胎中研究细胞迁移、汇聚与延伸过程^2,12（图 1B）。然而，颅面骨骼结构中软骨细胞的组织方式仍不清楚。通过活体成像，Zebrabow-M 转基因品系能够揭示介导 Meckel 软骨延伸与生长的软骨细胞嵌合与拉长过程（图 1C-G）。

在本实验方案中，ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre 胚胎在体节发育至10对时用他莫昔芬处理，并在发育过程中不同时间点（从3 dpf到5 dpf）观察下颌软骨细胞。为清晰显示Meckel软骨，避免额筛板和背侧神经颅的干扰，以下颌腹面观为最佳视角。稳定维持并遗传的...

讨论

如上所述，阿利新蓝染色与光转换转基因品系相互补充，可明确定义软骨和骨骼发育的复杂过程。然而，器官发生过程中活细胞的迁移与排列长期以来仅被假说推测并间接证实，从未实现直接可视化。通过将Zebrabow-M转基因品系与软骨特异性Cre工具联用，可同时实时观察骨骼和软骨形成过程中所有这些不同的生物学事件。该技术使得在诸如小颌畸形为显著特征之一的罗宾序列征等条件下，能够在细胞和器官水平上研究下颌生长缺陷。在软骨细胞生长过程中，细胞增殖、延伸或嵌入过程的任何失败均可被有效可视化。

颜色多样性优化

通过滴定4-羟基他莫昔芬的浓度来优化Cre表达水平，可在不导致胚胎致死的情况下控制重组程度和颜色多样性。雌激素对正常视网膜发育至关重要，因此较高剂量的他莫昔芬（>25µM）可引起视网膜退化、高死亡率（约60%至80%）、颅面畸形及发育迟缓。此外，4-羟基他莫昔芬以乙醇稀释，而乙醇本身在胚胎发育过程中具有毒性¹³。因此，确定最佳浓度和暴露时间以获得良好的重组效率同时限制胚胎毒性至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶	Roche Life Sciences	10165921001	配制 500 μl 储存液，浓度为 50 mg/ml
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M0262
PTU（N-苯基硫脲）	Sigma-Aldrich	P7619
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521
4-羟基他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T176
24 × 60 盖玻片	Fisher Scientific	12-548-5P
18 × 18 盖玻片	Fisher Scientific	12-540A
25 × 25 盖玻片	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA 克隆试剂盒	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			由 Geoffrey Burns 实验室惠赠
明场显微镜
荧光显微镜
共聚焦显微镜
图像处理软件