许多哺乳动物细胞通过力学趋向性（durotaxis）优先向更坚硬的基质或底物迁移。本实验方案的目的是提供一种简单 体外 通过整合具有特定刚性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底并与玻璃盖玻片连接，可用于研究和调控细胞力学趋性行为的系统。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
不同组织类型的细胞外基质在组成和机械特性上具有高度变异性。这种结缔组织间质的多样性显著影响细胞行为，从而调控细胞增殖、分化、黏附信号传导和定向迁移等生理与病理过程。在此背景下，某些细胞类型向更坚硬或更不易变形的基质底物迁移的固有特性被称为“硬度趋向性”（durotaxis）。该现象在胚胎发育、伤口修复以及癌细胞侵袭过程中发挥重要作用。本文介绍一种简便的实验方法用于研究硬度趋向性， 体外 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底。所描述的硬度趋性实验腔室的制备，可在相对柔软的PDMS凝胶与刚性玻璃盖玻片之间形成一个刚度界面。在本示例中，我们利用这些硬度趋性腔室证明了cdc42/Rac1 GTP酶激活蛋白cdGAP在人U2OS骨肉瘤细胞力学感知及硬度趋性调控中的作用。该检测方法可轻松适用于其他细胞类型，或结合其他目标蛋白的敲低，以探究它们在力学信号传导和硬度趋性中的各自功能。
引言
细胞外基质（ECM）由多种结构蛋白和交联蛋白（包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白）组成。尽管已明确ECM为细胞组织提供重要的结构支持，但越来越多的证据表明，细胞会主动响应其ECM环境中发生的物理变化，从而调控多种细胞过程，如细胞存活、分化和迁移。例如，ECM刚度的差异可引导间充质干细胞向不同谱系分化：较软的基底（约1 kPa）促进成神经细胞谱系分化，而较硬的基底（约25 kPa）则促进成骨分化1。类似地，间质基质刚度的增加已被证明可促进乳腺上皮细胞的肿瘤发生及其向周围组织的侵袭2,3。
这种机械信号传导活动一个特别有趣的方面是导致一种称为“硬度趋向性”的过程，即细胞倾向于向更坚硬的基质迁移4,5。细胞通过整合素受体与细胞外基质（ECM）结合，持续感知其胞外环境的物理特性。这反过来会促进多种结构蛋白和信号蛋白在其胞质结构域聚集，从而驱动形成被称为黏着斑或局灶性接触的黏附结构6,7。 由于整合素本身不具有酶活性，信号通过这些辅助蛋白从细胞外基质传递，以协调细胞对其变化环境的响应8。因此，鉴定和表征参与调控机械信号传导和硬度趋向性的关键蛋白，是当前研究的重要方向。
已开发出多种模型系统用于研究硬度趋向性 体外，但大多数研究采用了胶原蛋白包被的聚丙烯酰胺基质4然而，聚丙烯酰胺基底的制备在技术上具有挑战性，且这些实验中使用的胶原蛋白必须通过化学交联固定于基底上9聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底已被证明具有与聚丙烯酰胺基底相当的力学性能10然而，PDMS基底仅需按一定比例混合基础剂与交联剂即可制备，且可直接包被细胞外基质蛋白，无需化学交联，因此PDMS成为研究基底刚度对细胞行为影响的更简便工具。本文中，我们描述了一种简易的刚度趋化室的制备方法，其中将柔软的PDMS基底与刚性玻璃盖玻片集成。
如下所述的实验方法为研究细胞对基质硬度的趋向性（durotaxis）提供了一种快速且简便的方法。在本研究中，我们采用了人源U2OS骨肉瘤细胞，并结合siRNA介导的cdGAP基因敲低，以探讨这种黏着斑蛋白在durotaxis过程中的作用11。值得注意的是，该实验方案可轻松根据具体研究需求进行调整。其他类型的细胞可替代U2OS细胞，且可对任意蛋白进行敲低或过表达，以评估其对细胞在durotaxis过程中行为的影响。此外，该方案还可进一步优化，引入荧光标记蛋白，以便利用荧光漂白恢复技术（FRAP）或荧光共振能量转移技术（FRET）分析其动态变化与行为特征。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 刚度趋化室的制备
- 准备一块6孔组织培养板时，先用50 ml锥形管对天平去皮。在50 ml管中称取约10 g PDMS基础溶液（该溶液黏度较高）。
- 对于90:1的基质（刚度约为1 kPa），将管中PDMS基础溶液的质量除以90，以确定所需交联剂溶液的正确用量。将计算出的PDMS交联剂溶液加入同一管中。
示例：10 g / 90 = 0.11 g。向PDMS基础溶液中加入0.11 g PDMS交联剂溶液。
注意：基础溶液和交联剂溶液均由PDMS试剂盒提供。 - 在室温下使用小刮刀剧烈搅拌PDMS基础溶液与交联剂的混合物5分钟。此时混合物中会含有大量气泡。
- 将PDMS基质在台式离心机中以50 × g离心5分钟（室温），以去除气泡。若5分钟后仍有气泡残留，可再次离心。
- 用移液器将1 ml 90:1 PDMS基质加入每孔经组织培养处理的6孔板中。此时可用21 G 针头刺破残留气泡以消除之。让PDMS在孔内自然铺展30分钟。
- 将12 mm直径、#1厚度的玻璃盖玻片在蒸馏水中煮沸5分钟，重复两次，之后将盖玻片保存于蒸馏水中。
- 将一片干燥的盖玻片轻轻接触其一侧边缘进入PDMS溶液，然后缓慢放入6孔板的每个孔中。当盖玻片沉降时，PDMS会逐渐覆盖其边缘，但不会完全覆盖整个盖玻片。固化后将在PDMS与玻璃之间形成界面（见图1A、B）。
- 将培养板置于70 °C烘箱中孵育16小时，使PDMS固化（硬化）。随后将培养板放入细胞培养超净台中，进行10分钟紫外灭菌。
注意：最好在使用前数日内制备培养板。然而，若将培养板用Parafilm封口且不加任何缓冲液，可在4 °C保存长达2周，而不会出现明显质量下降。
2. 细胞铺板
注意：若研究 siRNA 介导的基因敲低效应，应根据试剂生产商的说明书或针对所选细胞类型的优化方案进行基因敲低操作。
- 在37 °C条件下，用不含钙和镁的PBS配制的10 µg/ml纤维连接蛋白溶液1 ml包被每个硬度趋化室，孵育1小时。或者，也可在分析前一天将PDMS置于含10 µg/ml纤维连接蛋白的PBS中，4 °C孵育16小时。确保整个表面完全浸没于纤维连接蛋白的PBS溶液中。
- 制备热变性的1% BSA。称取0.5 g BSA，溶于50 ml PBS中。使用0.22 µm滤器过滤除菌，并在80 °C加热12分钟。
注意：请在细胞接种前一天制备此溶液，并于4 °C保存。 - 吸除纤维连接蛋白溶液，用PBS洗涤3次。每孔加入1 ml PBS配制的热变性BSA溶液，室温孵育30分钟。
- 在硬度趋化室用热变性BSA封闭的同时，对所选细胞进行胰酶消化并计数。
- 将1 × 105个细胞以2 ml体积接种至硬度趋化室的每个孔中，使用适合所选细胞类型的培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育4小时，使其在基质上贴附并铺展。
注意：U2OS细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并补充2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠以及10 I.U./ml青霉素和10 µg/ml链霉素。
注意：本示例中使用的细胞数量已针对U2OS细胞优化，其他细胞类型可能需要进行优化。该密度可为细胞提供足够的迁移空间，同时避免与其他细胞发生显著相互作用。
3. 活细胞成像
- 使用倒置显微镜进行活细胞成像，采用10倍物镜的相差模式。显微镜应配备封闭式加湿环境培养箱，以便在长时间成像过程中控制温度为37 °C并维持5% CO2。
- 细胞铺展约3.5小时后，将培养板放入显微镜培养箱中。让样品在培养箱中平衡30分钟。
- 如有条件，设置显微镜的自动多点采集程序。聚焦于90:1 PDMS与玻璃盖玻片的界面处，并选择成像点，围绕每个硬度梯度腔室的界面均匀分布，平均每腔室40个点。每隔10分钟拍摄一次细胞图像，持续最长16小时。
注意：感兴趣区域将呈现为两条线，外侧线对应盖玻片边缘，内侧线对应PDMS与盖玻片之间的实际界面。见图1B。
4. 数据分析
- 生成一个电子表格，如 表1.
- 统计每段生成视频中从PDMS表面到玻璃表面以及反向穿越的事件次数。将穿越事件的数量记录在电子表格相应的列中。
注：交叉事件定义为细胞核在任一方向上穿过聚二甲基硅氧烷（PDMS）与玻璃之间的边界。 - 为量化多次跨越行为，需统计细胞跨越界面的次数。该数值应记录在Excel表格中与细胞在视频结束时所在底物相对应的列中。对视频中所有跨越界面的细胞重复上述分析。排除在成像过程中迁出视野的细胞。
注意：实验开始时还需通过细胞计数验证，确保细胞在纤维连接蛋白包被的PDMS和玻璃盖玻片表面具有相同的黏附能力。 - 计算从PDMS迁移至玻璃表面的细胞百分比（即， 经历硬质趋向性）。将从软基质向硬基质的跨越事件数与最终停留在硬基质上的多次跨越事件数相加，再除以总的跨越事件数。
- 通过将多次穿越的次数除以穿越总次数来计算多次穿越的百分比。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
硬度趋性实验装置的示意图见图1A。将柔软的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底（PDMS基础液与交联剂溶液按90:1比例混合）铺于6孔板中，然后将玻璃盖玻片置于PDMS之上，PDMS部分覆盖盖玻片的上表面，从而在两种不同刚度的基底之间形成界面。柔软PDMS基底的刚度约为1 kPa，与脑组织的典型刚度相当，而玻璃的刚度约为1–2 GPa1。PDMS与玻璃之间界面的相差图像由图1B中的白色箭头指示。星号标记了两个对照RNAi细胞向较硬基底迁移的情况。可见的锯齿状边缘（黑色箭头）对应于盖玻片的边缘。
为了量化数据，应按照表1创建一个 Microsoft Excel 电子表格。应统计穿越事件的次数，并将其填入相应的列中。部分生成的视频无法用于量化分析。如果聚二甲基硅氧烷（PDMS）中存在气泡，干扰了细胞的运动，或细胞密度过高导致发生碰撞，从而显著影响细胞的运动方向性，则该视频应排除在量化分析之外。还应监测细胞分裂情况，因为细胞分裂也会明显影响细胞的运动行为。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种研究迁移细胞中硬度趋向性（durotaxis）的简单检测方法。该检测方法的主要优势在于使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备硬度趋向性腔室的过程简便。通过调节PDMS基础溶液与交联剂的比例，可轻松调控基底的刚度，从而在实验中研究不同刚度条件下的细胞行为。然而，该系统的一个潜在局限性在于，细胞仅经历单一的基底刚度变化，而无法像更复杂的系统那样暴露于连续的刚度梯度环境中4。重要的是，与聚丙烯酰胺基底不同，细胞外基质（ECM）组分无需化学交联至PDMS上。事实上，通过特异性抗纤维连接蛋白（fibronectin）抗体染色测定发现，PDMS表面与玻璃表面的纤维连接蛋白包被程度大致相当11。由于先前的研究表明，细胞在PDMS或聚丙烯酰胺基底上的行为相似，因此使用PDMS基底为研究细胞力学转导提供了一个更为简便的模型系统10,12。
制备PDMS基底时最重要的步骤是确保基础剂和交联剂溶液充分混合。如果混合不充分，则基底在加热处理后将无法完全固化，导致盖玻片过度陷入PDMS中，或在成像过程中在PDMS内发生漂移。如果离心...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM47607、CA163296 以及美国国家科学基金会（NSF）1334493 项目资助，资助对象为 CET。我们感谢 Turner 实验室成员对本文稿的审阅。本报告中展示的所有数据均已获得 Wormer et al. 201411 的许可并予以复现。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒 |
| #1 盖玻片 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6 孔板 | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro | 25-005-CI | |
| 丙酮酸钠 | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| 青霉素/链霉素 | Cellgro | 30-002-CI | |
| 纤连蛋白 | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon 管 | Celltreat | 229456 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| U2OS 细胞 | ATCC | HTB-96 |
参考文献
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
