为评估细胞Mechanosensing和Durotaxis简化系统体外

摘要

许多哺乳动物细胞优先通过硬性向更坚硬的基质或基质迁移。该方案的目标是提供一个简单的体外系统，该系统可用于通过掺入具有确定刚度的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 底物来研究和纵细胞双向性行为，并与玻璃盖玻片连接。

摘要

细胞外基质的成分和机械性能是组织类型之间高度可变。此结缔组织基质多样性大大影响细胞的行为，以调节正常和病理过程，包括细胞增殖，分化，粘附信令和定向迁移。在这方面，某些细胞类型的固有能力，以移向称为durotaxis较硬的，或更少的标准矩阵衬底。这种现象扮演胚胎发育，伤口修复和肿瘤细胞入侵期间起重要作用。这里，我们描述一个简单的试验来研究durotaxis， 在体外，用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基板。的描述durotaxis腔室准备创建相对软的PDMS凝胶和刚性玻璃盖玻片之间的刚性的接口。在提供的例子中，我们已经使用了这些durotaxis室展示为CDC42作用/ Rac1的GTP酶激活prote在，cdGAP，在mechanosensing和人类U2OS骨肉瘤细胞durotaxis调节。该测定是易于适应其它类型的细胞和/或利益的其他蛋白质的敲低，探讨在mechanosignaling和durotaxis各自的作用。

引言

细胞外基质（ECM）是由结构和交联蛋白，包括胶原蛋白，纤连蛋白和层粘连蛋白的一系列复杂的。虽然它是公认的对ECM提供了细胞组织重要的结构支承，有越来越多的证据表明，细胞积极应对物理变化在其细胞外基质环境来调节多种细胞过程，包括细胞存活，分化和细胞迁移。例如，在ECM的刚性差异能驱动间充质干细胞向不同谱系，具有柔软基材（〜1千帕）促进神经谱系而僵硬（〜25千帕）衬底促进成骨分化^1。同样地，增加间质基质刚性已经显示出促进乳腺上皮细胞肿瘤的发生和侵袭到周围组织^2,3。

这mechanosign的一个特别有趣的方面阿玲活性导致称为durotaxis，其中细胞优先迁移朝着更刚性基板^4,5的处理。细胞不断通过整联蛋白受体感知它们的胞外环境的物理特性结合到ECM。这，反过来，促使许多结构性和信号蛋白的积累到其胞质结构域，以驱动被称为粘着斑或局灶性触点^6,7-粘合剂结构的形成。 自整联没有固有的酶活性，信号是从ECM中继通过这些辅助蛋白来协调细胞的反应其变化的环境^8。因此，参与调节mechanosignaling和durotaxis关键蛋白质的鉴定和表征是调查的一个重要领域。

各种模型系统已被开发，研究durotaxis 体外 ，但最有利用胶原包被的聚丙烯酰胺基质^4....

方案

1.准备Durotaxis商会

1. 为了制备1 6-孔组织培养板，去皮用50毫升锥形管中的平衡。称取约10克，在50毫升试管中的PDMS碱溶液中（该溶液是非常粘稠）。
2. 对于90:1的衬底（符合性〜1千帕），通过90分在管与PDMS碱溶液的测定重量来确定的交联剂溶液所需的正确的金额。与PDMS交联剂溶液的计算量添加到同一管中。
   例如:10克/ 90 = 0.11克。添加0.11克PDMS交联剂溶液与PDMS碱溶液。
   注意:基地和交联剂溶液在试剂盒的PDMS都提供。
3. 大力5分钟在RT使用小刮勺混合PDMS基/交联剂混合物。在这个阶段，混合物将含有大量气泡。
4. 离心机在台式离心机5分钟的PDMS衬底在50×g离心在RT以除去泡泡糖BLES。在5分钟，离心后重新如果仍有气泡。
5. 吸管1毫升90:1的PDMS衬底进入组织培养的每孔处理的6孔板中。存在于PDMS任何残留的气泡可以在本阶段通过使用21g的针弹出它们被消除。允许PDMS散布在井30分钟。
6. 煮沸12个毫米的玻璃＃1盖玻片在蒸馏水中5分钟。重复两次，并存储在蒸馏水盖玻片。
7. 放置一个，干燥盖玻片进入组织培养板的各孔中，轻轻触摸盖玻片一侧插入的PDMS溶液然后删除盖玻片上的PDMS。作为盖玻片沉降，与PDMS将开始侵占过盖玻片边缘，但不会完全覆盖它。这将产生固化后的PDMS和玻璃之间的界面（见图1A

结果

所述durotaxis室的示意图示于图1A。软PDMS衬底（90:1的混合物的PDMS碱与交联剂溶液）被铺在6孔皿，玻璃盖玻片放置在PDMS，然后部分地覆盖盖玻片的上表面的顶部上，从而产生一个接口不同的顺应的两个基板之间。软PDMS基板的刚性是〜1千帕，这与脑组织的典型合规性，而玻璃的刚性是大约1-2 GPA ^1。所述PDMS和玻璃之间的界面的相衬图像显示由白色箭头在图1B。星号表示两个控制RNA干扰细胞对硬的基体迁移。的参差不齐的边缘，该边缘可以看出（黑色箭头）对应于盖玻片的边缘。

量化数据，Microsoft Excel电子表格应生成如表1中</ STRONG>。交叉事件的数量应计入并组织相应的列。一些产生的电影不能被用于定量。电影可以从量化省略，如果有在PDMS中的气泡，与一个细胞进展干扰，或者如果将细胞过于密集，导致碰撞，可以大幅度地影响细胞方向性。细胞分裂还应进行监测，因为这也可以公开影响细胞的运动。 <.......

讨论

在此我们描述了一个简单的实验来研究durotaxis在细胞迁移。此法的主要优势是易于使用准备PDMS中durotaxis室的。基片的刚性可以通过改变碱的PDMS溶液的比率交联剂，以允许在测定中的各种刚性的研究很容易被操纵。然而，该系统中的一个潜在的限制是，细胞仅暴露于基板的刚性的单一变化，而 ​​不是经历由更复杂的系统⁴提供一个刚性梯度。重要的是，不象聚丙烯酰胺基质中，ECM组分不必是化学交联至PDMS。的确，纤连蛋白涂层近似等于上都PDMS和玻璃表面，如通过使用特定于纤维连接蛋白¹¹抗体染色来确定。由于以前的研究表明，细胞具有相同的行为在任PDMS或聚丙烯酰胺基质，采用Ò˚FPDMS基板提供了一个更容易的模型来研究机械传导细胞^10,12。

在的PDMS衬底的制备中最重要的步骤是确保在基座和交联剂溶液充分混合。如果他们没有充分混合足够的话，基板不会完全经热处理固化。这将导致在盖玻片下沉太远进入PDMS或成像期间盖玻片漂流在PDMS中。如果离心分离力过高，基体和交联剂溶液可以分离在管。这可以通过减小离心速度或通过使用真.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	道康宁	3097358-1004	Sylgard 184 有机硅弹性体套件
#1 盖玻片 12 毫米	Fisher Scientific	12-545-82
6 孔板	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-CI
钠丙酮酸	Fisher Scientific	BP356-100
青霉素/链霉素	Cellgro	30-002-CI
纤连蛋白	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
猎鹰管	Celltreat	229456
胎牛血清	亚特兰大生物制剂	S11150
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
U2OS 细胞	ATCC	HTB-96