一种用于体外评估细胞力传感与硬度趋向性的简化系统 In Vitro

摘要

许多哺乳动物细胞通过力学趋向性（durotaxis）优先向更坚硬的基质或底物迁移。本实验方案的目的是提供一种简单 体外 通过整合具有特定刚性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底并与玻璃盖玻片连接，可用于研究和调控细胞力学趋性行为的系统。

摘要

不同组织类型的细胞外基质在组成和机械特性上具有高度变异性。这种结缔组织间质的多样性显著影响细胞行为，从而调控细胞增殖、分化、黏附信号传导和定向迁移等生理与病理过程。在此背景下，某些细胞类型向更坚硬或更不易变形的基质底物迁移的固有特性被称为“硬度趋向性”（durotaxis）。该现象在胚胎发育、伤口修复以及癌细胞侵袭过程中发挥重要作用。本文介绍一种简便的实验方法用于研究硬度趋向性， 体外 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底。所描述的硬度趋性实验腔室的制备，可在相对柔软的PDMS凝胶与刚性玻璃盖玻片之间形成一个刚度界面。在本示例中，我们利用这些硬度趋性腔室证明了cdc42/Rac1 GTP酶激活蛋白cdGAP在人U2OS骨肉瘤细胞力学感知及硬度趋性调控中的作用。该检测方法可轻松适用于其他细胞类型，或结合其他目标蛋白的敲低，以探究它们在力学信号传导和硬度趋性中的各自功能。

引言

细胞外基质（ECM）由多种结构蛋白和交联蛋白（包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白）组成。尽管已明确ECM为细胞组织提供重要的结构支持，但越来越多的证据表明，细胞会主动响应其ECM环境中发生的物理变化，从而调控多种细胞过程，如细胞存活、分化和迁移。例如，ECM刚度的差异可引导间充质干细胞向不同谱系分化：较软的基底（约1 kPa）促进成神经细胞谱系分化，而较硬的基底（约25 kPa）则促进成骨分化¹。类似地，间质基质刚度的增加已被证明可促进乳腺上皮细胞的肿瘤发生及其向周围组织的侵袭^2,3。

这种机械信号传导活动一个特别有趣的方面是导致一种称为“硬度趋向性”的过程，即细胞倾向于向更坚硬的基质迁移^4,5。细胞通过整合素受体与细胞外基质（ECM）结合，持续感知其胞外环境的物理特性。这反过来会促进多种结构蛋白和信号蛋白在其胞质结构域聚集，从而驱动形成被称为黏着斑或局灶性接触的黏附结构^6,7。 由于整合素本身不具有酶活性，信号通过这些辅助蛋白从细胞外基质传递，以协调细胞对其变化环境的响应⁸。因此，鉴定和表征参与调控机械信号传导和硬度趋向性的关键蛋白，是当前研究的重要方向。

已开发出多种模型系统用于研究硬度趋向性 体外，但大多数研究采用了胶原蛋白包被的聚丙烯酰胺基质^4....

方案

1. 刚度趋化室的制备

1. 准备一块6孔组织培养板时，先用50 ml锥形管对天平去皮。在50 ml管中称取约10 g PDMS基础溶液（该溶液黏度较高）。
2. 对于90:1的基质（刚度约为1 kPa），将管中PDMS基础溶液的质量除以90，以确定所需交联剂溶液的正确用量。将计算出的PDMS交联剂溶液加入同一管中。
   示例：10 g / 90 = 0.11 g。向PDMS基础溶液中加入0.11 g PDMS交联剂溶液。
   注意：基础溶液和交联剂溶液均由PDMS试剂盒提供。
3. 在室温下使用小刮刀剧烈搅拌PDMS基础溶液与交联剂的混合物5分钟。此时混合物中会含有大量气泡。
4. 将PDMS基质在台式离心机中以50 × g离心5分钟（室温），以去除气泡。若5分钟后仍有气泡残留，可再次离心。
5. 用移液器将1 ml 90:1 PDMS基质加入每孔经组织培养处理的6孔板中。此时可用21 G 针头刺破残留气泡以消除之。让PDMS在孔内自然铺展30分钟。
6. 将12 mm直径、#1厚度的玻璃盖玻片在蒸馏水中煮沸5分钟，重复两次，之后将盖玻片保存于蒸馏水中。
7. 将一片干燥的盖玻片轻轻接触其一侧边缘进入PDMS溶液，然后缓慢放入6孔板的每个孔中。当盖玻片沉降时，PDMS会逐渐覆盖其边缘，但不会完全覆盖整个盖玻片。固化后将在PDMS与玻璃之间形成界面（见图1A、B）。<....

结果

硬度趋性实验装置的示意图见图1A。将柔软的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底（PDMS基础液与交联剂溶液按90:1比例混合）铺于6孔板中，然后将玻璃盖玻片置于PDMS之上，PDMS部分覆盖盖玻片的上表面，从而在两种不同刚度的基底之间形成界面。柔软PDMS基底的刚度约为1 kPa，与脑组织的典型刚度相当，而玻璃的刚度约为1–2 GPa¹。PDMS与玻璃之间界面的相差图像由图1B中的白色箭头指示。星号标记了两个对照RNAi细胞向较硬基底迁移的情况。可见的锯齿状边缘（黑色箭头）对应于盖玻片的边缘。

为了量化数据，应按照表1创建一个 Microsoft Excel 电子表格。应统计穿越事件的次数，并将其填入相应的列中。部分生成的视频无法用于量化分析。如果聚二甲基硅氧烷（PDMS）中存在气泡，干扰了细胞的运动，或细胞密度过高导致发生碰撞，从而显著影响细胞的运动方向性，则该视频应排除在量化分析之外。还应监测细胞分裂情况，因为细胞分裂也会明显影响细胞的运动行为。

讨论

本文介绍了一种研究迁移细胞中硬度趋向性（durotaxis）的简单检测方法。该检测方法的主要优势在于使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备硬度趋向性腔室的过程简便。通过调节PDMS基础溶液与交联剂的比例，可轻松调控基底的刚度，从而在实验中研究不同刚度条件下的细胞行为。然而，该系统的一个潜在局限性在于，细胞仅经历单一的基底刚度变化，而无法像更复杂的系统那样暴露于连续的刚度梯度环境中⁴。重要的是，与聚丙烯酰胺基底不同，细胞外基质（ECM）组分无需化学交联至PDMS上。事实上，通过特异性抗纤维连接蛋白（fibronectin）抗体染色测定发现，PDMS表面与玻璃表面的纤维连接蛋白包被程度大致相当¹¹。由于先前的研究表明，细胞在PDMS或聚丙烯酰胺基底上的行为相似，因此使用PDMS基底为研究细胞力学转导提供了一个更为简便的模型系统^10,12。

制备PDMS基底时最重要的步骤是确保基础剂和交联剂溶液充分混合。如果混合不充分，则基底在加热处理后将无法完全固化，导致盖玻片过度陷入PDMS中，或在成像过程中在PDMS内发生漂移。如果离心.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷 (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒
#1 盖玻片 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6 孔板	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-CI
丙酮酸钠	Fisher Scientific	BP356-100
青霉素/链霉素	Cellgro	30-002-CI
纤连蛋白	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon 管	Celltreat	229456
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
U2OS 细胞	ATCC	HTB-96