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采用膜片钳与活细胞荧光显微技术监测新分离的多囊肾上皮细胞功能特性

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DOI：

10.3791/53035

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2015年9月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

本文内容

摘要

在肾小管上皮细胞中表达的离子通道在多囊肾病的病理过程中起着重要作用。本文介绍了用于对从啮齿类动物肾脏新鲜分离的囊性上皮组织进行膜片钳分析和细胞内钙水平测定的实验方案。

摘要

多囊肾病过程中囊肿的启动与扩张是一个复杂的过程，其特征是肾小管上皮细胞增殖异常、管腔内液体积聚以及细胞外基质形成异常。离子通道活性和细胞内钙信号是决定肾小管上皮功能的关键生理参数。我们建立了一种适用于实时观察离子通道活性的方法，结合膜片钳技术，可同步记录从肾脏囊肿中新鲜分离的上皮单层细胞内的Ca2+水平。本研究采用PCK大鼠——一种常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）的遗传模型——进行离子通道和钙离子流动的离体（ex vivo）分析。本文详细描述了从PCK大鼠或正常的Sprague Dawley（SD）大鼠中分离囊性上皮单层和非扩张小管的逐步操作流程，并用于监测单通道活性及细胞内Ca2+动态变化。该方法无需酶消化处理，可在新鲜分离的上皮单层天然状态下进行分析。此外，该技术对细胞内钙变化高度敏感，可获得高分辨率图像以实现精确测量。最后，所分离的囊性上皮组织还可进一步用于抗体或染料染色、原代细胞培养建立，以及多种生物化学检测的样品纯化。

引言

离子通道在多种生理功能中发挥重要作用，包括细胞生长和分化。常染色体显性遗传和隐性遗传多囊肾病（ADPKD 和 ARPKD， respectively）是以肾小管上皮细胞来源的充满液体的肾囊肿形成为特征的遗传性疾病。ADPKD 由编码多囊蛋白1和2的 PKD1 或 PKD2 基因突变引起，这些膜蛋白参与调控细胞增殖和分化。PKD2 本身或与 PKD1 形成复合物时，也作为可通透 Ca2+ 的阳离子通道发挥作用1。编码纤维囊性蛋白（一种与小管形成和/或上皮细胞极性维持相关的纤毛相关受体样蛋白）的 PKHD1 基因突变是 ARPKD 的遗传基础2。囊肿生长是一个复杂的过程，伴随细胞增殖紊乱3,4、血管生成5以及小管细胞去分化和极性丧失6-8。

囊性上皮中重吸收功能缺陷和分泌增强导致管腔内液体积聚及囊肿扩张9,10。在多囊肾病（PKD）发生过程中，流体依赖性[Ca2+]i 信号传导受损也与囊肿形成相关11-15。

此处，我们介绍一种适用于单通道活性和细胞内 Ca 的膜片钳测量方法2+ PCK 大鼠分离的囊性上皮单层中的水平。我们已成功应用该方法表征上皮钠通道活性+ 通道（ENaC）10 和 [Ca2+]i依赖于Ca²⁺的过程2+可渗透的TRPV4和嘌呤能信号级联13.

在这些研究中，我们使用了PCK大鼠，这是一种由PKHD1基因自发突变引起的常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）模型。PCK品系最初源自Sprague-Dawley（SD）大鼠16，因此SD大鼠可作为与PCK品系进行比较的合适对照。因此，SD大鼠的肾单位节段以及从相同PCK大鼠分离出的非扩张集合管均可作为囊性上皮实验中的两个不同对照组。

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方案

以下所述实验方案已获威斯康星医学院和休斯顿德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。图1展示了组织分离与处理流程的主要步骤。简言之，采用PCK或SD大鼠的肾脏，从健康非扩张的小管或囊肿中手工分离集合管的上皮单层。本研究使用了4至16周龄PCK大鼠的肾脏10,13。

1. 肾囊肿及连接小管（CNT）/集合管（CD）节段的分离

  1. 使用异氟烷（5%诱导，1.5%至2.5%维持）/医用级O2或其他经批准的方法对实验动物进行麻醉。必须持续监测动物以确保麻醉深度足够。通过稳定的呼吸频率和脚趾夹捏反应来确认麻醉效果适当。
  2. 行剖腹手术，并通过腹主动脉用磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注肾脏17。
    1. 准备一根聚乙烯导管（PE50）并将其连接至装有PBS的注射泵。沿腹白线切开皮肤和腹壁，然后横向穿过腹部做一横切口，用棉签移开腹腔内脏器 以暴露降主动脉及其分支的肠系膜动脉和腹腔动脉。在后续操作中用温盐水润湿内脏器官，防止其干燥。
    2. 在肠系膜动脉和腹腔动脉周围放置一根结扎线（#1），在膈肌下方的主动脉周围放置另一根结扎线（#2）（暂不打结）。用细镊子钝性分离主动脉腹侧支（a. abdominalis），并在左肾动脉下方约3 mm处（#3）及髂动脉分叉上方（#4）各放置两根结扎线。
    3. 结扎#4号结扎线，并在左肾动脉与#3号结扎线之间的主动脉上安放血管夹。在血管夹与#4号结扎线之间做一切口插入导管，并用#3号结扎线牢固固定导管。
    4. 松开血管夹，观察导管内是否有搏动性血流以确认导管位置正确。以6 ml/min的速度开始灌注，结扎#1和#2号结扎线，并切断左肾静脉。继续冲洗1–2分钟，直至器官完全变苍白。
    5. 用剪刀切断肾血管、输尿管及周围结缔组织和脂肪组织以取出肾脏。随后在肾包膜上做一小撕裂口，剥离并去除肾包膜。将肾脏置于冰冻PBS中。通过胸腔切开术确认动物安乐死。
  3. 准备涂有聚-L-赖氨酸的5 × 5 mm盖玻片小片。用玻璃刀在盖玻片上切割，并在每片上滴加约20 µl的0.01%无菌过滤聚-L-赖氨酸溶液。准备生理盐水及两对钟表匠镊子用于解剖。
  4. 用剃刀刀片沿额状面将肾脏切成约1–2 mm厚的切片。取其中一片置于体视显微镜下。组织分离应在冰冻生理盐水中进行。
  5. 在体视显微镜下定位呈圆形腔隙的囊肿（图2A）；其囊壁常含有明显的增生血管网络。用尖头镊子尽可能薄地剥离囊肿的内层上皮，以获得单层区域。将其贴附至涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上。聚-L-赖氨酸的黏性表面可使研究人员牢固地将囊肿内层固定在玻片上。将囊肿顶端朝上放置，以便微吸管操作（图2B）。
  6. 使用PCK或SD大鼠肾脏中央切片（含肾乳头）以分离未扩张的连接小管/集合管远端（CNT/CCD）节段18–21。
    注意：乳头组织比皮质更坚韧，通过用镊子夹住乳头小管束并沿径向撕裂，可将切片分离成薄片。单个肾小管可见，可被拉出并置于盖玻片上。
  7. 通过分支结构、比近端小管更高的透明度以及大而明显的细胞来识别CNT/CCD节段（图2C）。将附着有肾小管的盖玻片置于配备有微操作器的显微镜下，该微操作器适用于驱动微吸管。使用尖锐的微吸管切开肾小管，并将其边缘固定在玻片上，使顶端表面暴露可及（图2D）。

2. 单通道膜片钳电生理学

  1. 用灌流液填充膜片钳记录槽，并将带有分离组织的盖玻片芯片转移至记录槽中。确保膜片钳微电极的阻抗为7-10 MΩ，以保证可靠的细胞贴附式（on-cell）记录测量。
  2. 对于细胞贴附式记录，将放大器增益比设置为20倍，并通过八极贝塞尔滤波器对电流信号进行300 Hz的低通滤波。用于监测ENaC通道时，使用如下（单位为mM）的灌流液：150 NaCl，1 CaCl₂2，2 MgCl2，10 HEPES（pH 7.4）；移液管：140 LiCl，2 MgCl2 和10 HEPES（pH 7.4）。
  3. 进行细胞贴附模式下的常规膜片钳实验10. 选择上皮单层中的一个细胞，将移液管靠近细胞的顶膜。通过施加轻柔的负压，在移液管与细胞膜之间形成高阻封接。当形成千兆欧姆级的高阻封接后，应启动零泄漏记录方案，并在保持电位下开始监测目标通道的活性。
  4. 保存吉欧姆封接的无间隙单通道电流数据，以供后续分析。使用通常随膜片钳装置提供的软件包分析通道事件18. 将通道活性计算为 NPo 其中 N 表示膜片中活性通道的数量， Po 通道的平均开放概率。
    注意：用于膜片钳实验的分离囊肿或小管最多使用30分钟。

3. 上皮细胞内钙离子浓度的比率式落射荧光测定

  1. 使用溶解于DMSO中的5 mM Fura-2AM。将储备液分装至各500 µl锥形管中（每管约10 µl）。避光并保存于-20 ˚C冰箱中，可保存长达六个月。
  2. 将分离的囊肿和剖开的小管在PSS（单位：mM，含145 NaCl、4.5 KCl、2 MgCl2、2 CaCl2 和10 HEPES，pH 7.35）中孵育30–40分钟，PSS中含5 µM Fura-2 AM染料和0.05% Pluronic酸以助于分散乙酰氧基甲酯。操作时，将组织置于含有染料加载混合液的3.5 cm培养皿中，避光，并在室温下置于慢速摇床上孵育。
  3. 孵育后，将含Fura-2 AM的溶液更换为新鲜PSS，将组织置于显微镜下，以进行后续的落射荧光成像。
  4. 开启配备滤光轮的CCD相机和稳定光源（单色器系统）（每个滤光片位置可设置独立的衰减水平，每次调用滤光片时选择相应衰减）。
  5. 先在明场下找到组织，切换至荧光信号检测模式，并利用中性密度滤光片和光源功率调节光照强度，避免信号饱和。
  6. 以340/380 nm波长进行比例激发，监测组织样本中Fura-2 AM的荧光信号，激发频率为0.125 Hz或更高。使用40×/NA 1.3或类似规格的物镜，以获得适当的图像分辨率。
  7. 将图像序列导入图像处理与分析软件。确保将通道拆分，并采用多通道灰度模式（hyperstack grayscale mode）。选择多个感兴趣区域（单个囊肿细胞或囊性组织的特定区域），在所选数据分析软件中分别计算各通道（340 nm和380 nm）的强度值，并从每个数据点中扣除背景强度值。
  8. 对每个时间点，计算Fura-2 AM在340 nm与380 nm通道的荧光强度比值。绘制各区域Ca2+瞬变的散点图或折线图，并计算均值与标准误（mean/SE）。

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结果

多项研究已表明ENaC可能参与囊肿形成过程，这些研究观察到在多囊肾病（PKD）进展中表皮生长因子（EGF）信号通路受损22-25，以及在常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）小鼠模型和组织培养中存在异常的钠离子重吸收26-28。例如，Veizis et al. 发现，在非同源性ARPKD小鼠模型BPK中，集合管细胞的氨氯吡脒敏感性Na+吸收降低29。我们近期研究表明，囊肿中钠离子和水的重吸收功能受损是加剧囊肿形成的重要因素10。具体而言，我们采用电生理学和免疫组织化学分析发现，囊肿的钠离子重吸收能力减弱。药理学实验进一步证明，选择性阻断ENaC会显著加重囊肿进展10。

我们进一步研究了ENaC阻断剂苯扎米尔（benzamil）给药对囊壁中通道活性的影响。4周龄的PCK大鼠自由饮用对照溶剂或含苯扎米尔（15 mg/ml）的饮水。经12周处理后，按照上述方案对动物进行后续操作。对来自对照组和苯扎米尔处理组的囊性单层细胞进行膜片钳实验。

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讨论

本文介绍了常规膜片钳技术与表层荧光钙成像技术在源自一种常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）小鼠遗传模型的囊性上皮单层细胞中的应用。该实验方案包括三个步骤，其中最需关注的是囊肿的分离（方案部分的步骤1.5）以及电生理学研究。这些关键操作步骤需要大量的训练与耐心，读者不应因初期困难而感到沮丧。

首先，应特别关注囊肿单层的分离过程。该制备步骤需要熟练的手工操作技术，并会显著影响后续工作，因为样本的厚度及其在玻片上均匀附着的情况对细胞的可见性至关重要。分离得到的囊肿壁在样本不同部位的厚度可能不一，建议重点关注体积较大、单层区域较宽的囊肿，以便于操作。为便于清洁样本并暴露单层结构，应在体视显微镜下使用镊子剥离周围的组织。需要强调的是，该技术要求使用高质量的体视显微镜，其应具备较大的景深以及可在较宽范围内调节放大倍数的能力，以适应解剖过程中不同尺寸的样本。该方法的另一局限性在于，诸如膜片钳和钙成像等复杂技术需要操作人员具备相关方法的经验。我们建议可先在集合管细胞培养模型上积累初步经验，例如 commercially available 的皮质 M1 细胞和髓质 IMCD 细胞，这些细胞能够形成与...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Glen Slocum（威斯康星医学院）和 Colleen A. Lavin（尼康仪器公司）在显微镜实验中提供的出色技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目包括 R01 HL108880（资助 AS）、R01 DK095029（资助 OPo）和 K99 HL116603（资助 TSP），美国肾脏基金会项目 IG1724（资助 TSP），美国心脏协会项目 13GRNT16220002（资助 OPo），以及美国肾脏病学会 Ben J. Lipps 研究奖学金（资助 DVI）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP4707
泊洛沙姆酸Sigma-AldrichF-68 溶液
摇床Boekel Scientific260350
光源Sutter Instrument CoLambda XL带集成快门/滤光轮驱动器
中性密度滤光片NikonND4, ND8
物镜NikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22   油
相机Andor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  显微镜（倒置）NikonNikon Eclipse TE2000-S
盖玻片Thermo Scientific6661B52
金刚石刻线笔Fisher Scientific22268912
图像采集软件NikonNikon NIS-Elements 
图像分析软件ImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility 插件支持导入尼康仪器原生 .nd2 格式图像
记录/灌流室Warner InstrumentsRC-26
膜片钳放大器Molecular DevicesMultiClamp 700B
数据采集系统Molecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® 系统
低通滤波器Warner InstrumentsLPF-88极贝塞尔滤波器
硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instruments1B150F-4
微电极拉制仪Sutter Instrument CoP-97Flaming/Brown 型微电极拉制仪
微电极抛光仪NarishigeMF-830日本
电动显微操作器Sutter Instrument CoMP-225
倒置显微镜NikonEclipse Ti
微振动隔离台TMC配备法拉第笼
多通道阀灌流系统AutoMake ScientificValve Bank II
记录/灌流室Warner InstrumentsRC-26
软件Molecular DevicespClamp 10 . 2
温度可控手术台 MCW core用于啮齿类动物
双目体视显微镜NikonSMZ745
基于注射泵的灌流系统Harvard Apparatus
聚乙烯导管Sigma-AldrichPE50
异氟烷麻醉http://www.vetequip.com/911103
其他基本试剂Sigma-Aldrich

参考文献

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