采用膜片钳与活细胞荧光显微技术监测新分离的多囊肾上皮细胞功能特性

摘要

在肾小管上皮细胞中表达的离子通道在多囊肾病的病理过程中起着重要作用。本文介绍了用于对从啮齿类动物肾脏新鲜分离的囊性上皮组织进行膜片钳分析和细胞内钙水平测定的实验方案。

摘要

多囊肾病过程中囊肿的启动与扩张是一个复杂的过程，其特征是肾小管上皮细胞增殖异常、管腔内液体积聚以及细胞外基质形成异常。离子通道活性和细胞内钙信号是决定肾小管上皮功能的关键生理参数。我们建立了一种适用于实时观察离子通道活性的方法，结合膜片钳技术，可同步记录从肾脏囊肿中新鲜分离的上皮单层细胞内的Ca²⁺水平。本研究采用PCK大鼠——一种常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）的遗传模型——进行离子通道和钙离子流动的离体（ex vivo）分析。本文详细描述了从PCK大鼠或正常的Sprague Dawley（SD）大鼠中分离囊性上皮单层和非扩张小管的逐步操作流程，并用于监测单通道活性及细胞内Ca²⁺动态变化。该方法无需酶消化处理，可在新鲜分离的上皮单层天然状态下进行分析。此外，该技术对细胞内钙变化高度敏感，可获得高分辨率图像以实现精确测量。最后，所分离的囊性上皮组织还可进一步用于抗体或染料染色、原代细胞培养建立，以及多种生物化学检测的样品纯化。

引言

离子通道在多种生理功能中发挥重要作用，包括细胞生长和分化。常染色体显性遗传和隐性遗传多囊肾病（ADPKD 和 ARPKD， respectively）是以肾小管上皮细胞来源的充满液体的肾囊肿形成为特征的遗传性疾病。ADPKD 由编码多囊蛋白1和2的 PKD1 或 PKD2 基因突变引起，这些膜蛋白参与调控细胞增殖和分化。PKD2 本身或与 PKD1 形成复合物时，也作为可通透 Ca²⁺ 的阳离子通道发挥作用¹。编码纤维囊性蛋白（一种与小管形成和/或上皮细胞极性维持相关的纤毛相关受体样蛋白）的 PKHD1 基因突变是 ARPKD 的遗传基础²。囊肿生长是一个复杂的过程，伴随细胞增殖紊乱^3,4、血管生成⁵以及小管细胞去分化和极性丧失^6-8。

囊性上皮中重吸收功能缺陷和分泌增强导致管腔内液体积聚及囊肿扩张^9,10。在多囊肾病（PKD）发生过程中，流体依赖性[Ca²⁺]_i 信号传导受损也与囊肿形成相关^11-15。

此处，我们介绍一种适用于单通道活性和细胞内 Ca 的膜片钳测量方法²⁺ PCK 大鼠分离的囊性上皮单层中的水平。我们已成功应用该方法表征上皮钠通道活性⁺

方案

以下所述实验方案已获威斯康星医学院和休斯顿德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。图1展示了组织分离与处理流程的主要步骤。简言之，采用PCK或SD大鼠的肾脏，从健康非扩张的小管或囊肿中手工分离集合管的上皮单层。本研究使用了4至16周龄PCK大鼠的肾脏^10,13。

1. 肾囊肿及连接小管（CNT）/集合管（CD）节段的分离

1. 使用异氟烷（5%诱导，1.5%至2.5%维持）/医用级O₂或其他经批准的方法对实验动物进行麻醉。必须持续监测动物以确保麻醉深度足够。通过稳定的呼吸频率和脚趾夹捏反应来确认麻醉效果适当。
2. 行剖腹手术，并通过腹主动脉用磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注肾脏¹⁷。
   1. 准备一根聚乙烯导管（PE50）并将其连接至装有PBS的注射泵。沿腹白线切开皮肤和腹壁，然后横向穿过腹部做一横切口，用棉签移开腹腔内脏器 以暴露降主动脉及其分支的肠系膜动脉和腹腔动脉。在后续操作中用温盐水润湿内脏器官，防止其干燥。
   2. 在肠系膜动脉和腹腔动脉周围放置一根结扎线（#1），在膈肌下方的主动脉周围放置另一根结扎线（#2）（暂不打结）。用细镊子钝性分离主动脉腹侧支（a. abdominalis），并在左肾动脉下方约3 mm....

结果

多项研究已表明ENaC可能参与囊肿形成过程，这些研究观察到在多囊肾病（PKD）进展中表皮生长因子（EGF）信号通路受损^22-25，以及在常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）小鼠模型和组织培养中存在异常的钠离子重吸收^26-28。例如，Veizis et al. 发现，在非同源性ARPKD小鼠模型BPK中，集合管细胞的氨氯吡脒敏感性Na⁺吸收降低²⁹。我们近期研究表明，囊肿中钠离子和水的重吸收功能受损是加剧囊肿形成的重要因素¹⁰。具体而言，我们采用电生理学和免疫组织化学分析发现，囊肿的钠离子重吸收能力减弱。药理学实验进一步证明，选择性阻断ENaC会显著加重囊肿进展¹⁰。

我们进一步研究了ENaC阻断剂苯扎米尔（benzamil）给药对囊壁中通道活性的影响。4周龄的PCK大鼠自由饮用对照溶剂或含苯扎米尔（15 mg/ml）的饮水。经12周处理后，按照上述方案对动物进行后续操作。对来自对照组和苯扎米尔处理组的囊性单层细胞进行膜片钳实验。

讨论

本文介绍了常规膜片钳技术与表层荧光钙成像技术在源自一种常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）小鼠遗传模型的囊性上皮单层细胞中的应用。该实验方案包括三个步骤，其中最需关注的是囊肿的分离（方案部分的步骤1.5）以及电生理学研究。这些关键操作步骤需要大量的训练与耐心，读者不应因初期困难而感到沮丧。

首先，应特别关注囊肿单层的分离过程。该制备步骤需要熟练的手工操作技术，并会显著影响后续工作，因为样本的厚度及其在玻片上均匀附着的情况对细胞的可见性至关重要。分离得到的囊肿壁在样本不同部位的厚度可能不一，建议重点关注体积较大、单层区域较宽的囊肿，以便于操作。为便于清洁样本并暴露单层结构，应在体视显微镜下使用镊子剥离周围的组织。需要强调的是，该技术要求使用高质量的体视显微镜，其应具备较大的景深以及可在较宽范围内调节放大倍数的能力，以适应解剖过程中不同尺寸的样本。该方法的另一局限性在于，诸如膜片钳和钙成像等复杂技术需要操作人员具备相关方法的经验。我们建议可先在集合管细胞培养模型上积累初步经验，例如 commercially available 的皮质 M1 细胞和髓质 IMCD 细胞，这些细胞能够形成与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fura-2 AM	Life Technologies	F-14185
Fluo-8	AAT Bioquest	21091
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P4707
泊洛沙姆酸	Sigma-Aldrich	F-68	溶液
摇床	Boekel Scientific	260350
光源	Sutter Instrument Co	Lambda XL	带集成快门/滤光轮驱动器
中性密度滤光片	Nikon		ND4, ND8
物镜	Nikon	SFluo	40/1.3 DIC WD 0.22   油
相机	Andor Technologies	Zyla sCMOS
Nikon  显微镜（倒置）	Nikon	Nikon Eclipse TE2000-S
盖玻片	Thermo Scientific	6661B52
金刚石刻线笔	Fisher Scientific	22268912
图像采集软件	Nikon	Nikon NIS-Elements
图像分析软件	ImageJ	http://imagej.nih.gov/	ND Utility 插件支持导入尼康仪器原生 .nd2 格式图像
记录/灌流室	Warner Instruments	RC-26
膜片钳放大器	Molecular Devices	MultiClamp 700B
数据采集系统	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® 系统
低通滤波器	Warner Instruments	LPF-8	8极贝塞尔滤波器
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B150F-4
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown 型微电极拉制仪
微电极抛光仪	Narishige	MF-830	日本
电动显微操作器	Sutter Instrument Co	MP-225
倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti
微振动隔离台	TMC		配备法拉第笼
多通道阀灌流系统	AutoMake Scientific	Valve Bank II
记录/灌流室	Warner Instruments	RC-26
软件	Molecular Devices	pClamp 10 . 2
温度可控手术台	MCW core		用于啮齿类动物
双目体视显微镜	Nikon	SMZ745
基于注射泵的灌流系统	Harvard Apparatus
聚乙烯导管	Sigma-Aldrich	PE50
异氟烷麻醉	http://www.vetequip.com/	911103
其他基本试剂	Sigma-Aldrich