微透析是神经科学研究中常用的一种技术，因此商用探针需求量很大。本文详细说明了一种探针组装方法，用于构建可靠、同心结构的定制微透析探针，成本低于10美元。
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摘要
摘要
微透析是神经科学研究中常用的一种技术。因此，市场上对用于监测脑脊液中生理、药理及病理变化的商用探针需求很大。然而，对于公共机构的研究团队而言，商用探针价格昂贵。本文详细阐述了一种探针组件的制备方法，可用于构建可靠、同心结构、定制化的微透析探针，成本低于10美元。该微透析探针采用截留分子量为30 kDa的聚砜膜制成。探针 体外 比较了不同分子量（范围为100–1,600 Da）及不同理化性质物质的回收率。该探针可产生 体外 葡萄糖、乳酸、乙酰胆碱和ATP等小分子化合物的回收率约为20%。 体外 分子量在1,000–1,600 Da之间的神经肽回收率为2%–6%。因此，尽管神经肽的分子量较高会降低 体外 回收率，对分子量较低范围（至多500 Da）的化合物进行透析并无显著影响 体外 回收率。本方法允许使用具有其他截留分子量和膜材料的透析膜。因此，这种定制探针组件具有足够的灵活性，可对较宽分子量范围内的物质进行透析。本文介绍一种交换长度为2 mm的微透析探针，适用于小鼠和大鼠脑区的微透析。然而，探针的尺寸可轻松调整，以适用于更长的交换长度，满足更大动物的使用需求。
引言
微透析是神经科学研究中常用的一种技术。在过去50年中，这种微创微透析技术不断改进，已成为一种成熟的用于监测细胞外空间中小分子量化合物局部浓度的方法。几乎所有间质组织液均可在自由活动的动物中进行研究。
加德姆在20世纪60年代引入了推拉技术。他对菲尔德伯格的方法进行了改进。 等 通过一根末端位于侧脑室的导管灌注筒箭毒碱，并通过另一根导管收集流出液1加德姆开发了推拉技术，该技术通过植入脑内不同区域的由两根同心钢针构成的套管，在灌注溶液的同时，持续移除从套管尖端周围神经元释放的神经递质。2遗憾的是，导管尖端周围组织受损限制了该方法的应用。作为该方法的进一步改进，Bito 及其同事引入了一种透析袋法，通过透析膜将收集的溶液与周围组织隔开。他们将透析囊植入狗颈部的皮下组织中。透析袋内的液体不含蛋白质，可于数周后用于离子和氨基酸的分析3随后出现的是透析探针（dialytrode），这是一种原始的微透析探针，最早由Delgado于1972年描述。4最后，Ungerstedt 及其同事改进了微透析探针的设计，使其体积更小，对组织的占位更少。5.
同心式微透析探针的行为类似于血液毛细血管。该系统持续灌注一种具有周围组织液离子成分但不含目标分析物的溶液。暴露于外部溶液或组织的透析膜为半透膜，允许物质顺着其浓度梯度被动扩散进入探针6。透析膜的通透性取决于多种因素，如化合物的分子量、形状、电荷和pH值。此外，膜材料的性质、膜的孔径大小以及流速也限制了通透性7。
图1 和 图2 展示了一种同心式微透析探针。灌流液通过入口管路进入金属套管，该套管包裹着熔融石英。在金属套管内部，液体沿熔融石英表面向下流动，并从其尖端流出。随后，灌流液在透析膜与聚四氟乙烯（PTFE）管路（如特氟龙）之间的空隙中向上流动。在此过程中，组织中的物质通过透析膜发生扩散。透析液通过与出口管路相连的PTFE管路离开探针，并可被收集。
与其它体内技术相比，微透析技术具有多项优势。探针构成了一种物理屏障，因此透析液中不含酶或细胞。因此，在分析前无需对洗脱液进行纯化，且分析物不会发生酶降解。分析物在管路中通过时可能发生氧化降解，但通常可通过在灌注液中添加抗氧化剂（例如抗坏血酸）加以防止。或者，通过用收集透析液的尖端替代出口管路，可有效抑制对神经肽等物质的氧化损伤8。透析液可直接用于几乎任何类型的分析方法，且可同时收集多种分析物。该系统可用于清醒动物，几乎所有的脑区均可被检测。此外，还可通过探针灌注药物（反向透析）。然而，微透析技术也存在局限性。其时间分辨率相对较低，无法实时反映神经递质的变化情况。由于该技术具有侵入性，探针植入会造成手术创伤，且此步骤需要麻醉，这些因素均可能影响神经递质的浓度7,9,10。
透析液中的化合物浓度仅占细胞外液实际化合物浓度的一小部分。为计算细胞外液中未知的化合物浓度，需采用相对 体外 恢复率必须进行计算。个体相对值的测定 体外 每个探针和每种化合物的回收率测定在开始实验前都是必要的 在 体内 实验。为此，将探针浸入含有目标分析物的溶液中，而灌流液则为不含该目标分析物的相同溶液。在测定透析液中化合物浓度后，需将这些数据与其在周围液体中的浓度进行比较。 体外 多种物质的回收率测定可同时进行9.
许多神经科学研究团队使用微透析技术来研究特定脑区细胞外空间中的神经递质和代谢物。因此，商用探针在神经科学研究领域需求量很大。商用探针的一大优势在于其高度的功能可靠性。针对商用探针的实验装置已得到充分建立，并已被验证可用于多种已知神经递质和代谢物的检测。然而，市售微透析设备价格昂贵，且在应用上灵活性较低11。本文详细展示了一种微透析探针的组装方法，该探针可针对不同应用进行调整，且制造成本低于10美元。这种自制探针是一种同心式微透析探针，已在多个脑区的研究中经过测试验证8。
体外实验中，比较了不同分子量（100–1,600 Da）及不同理化性质物质的探针回收率。体外回收率测定包括分子量低于 200 Da 的葡萄糖、乳酸和乙酰胆碱，分子量约为 500 Da 的 ATP，以及分子量超过 1,000 Da 的神经肽血管紧张素 II、P 物质和生长抑素。
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方案
1. 准备聚四氟乙烯管
- 将聚四氟乙烯（PTFE）管剪成2.5 cm长的片段。使用带刻度的纸张估算其物理尺寸。（见图3a）
- 将一端以斜角剪切，以便连接出口管路。（见图3a）
- 使用砂纸打磨聚四氟乙烯（PTFE）管表面，使其粗糙，以利于环氧胶粘附。
2. 准备熔融石英
- 将熔融石英切割成2.25 cm的片段。（见图3a）
3. 将熔融石英插入聚四氟乙烯管中
- 将30 G的套管插入中空PTFE纤维中，在距平端1 cm处刺穿。弯曲PTFE管以简化操作。（见图3b）
- 使用套管作为引导，将熔融石英插入PTFE管中。（见图3c）
- 轻柔地取出套管，并固定熔融石英。（见图3d）
- 熔融石英应在平端处伸出5 mm。（见图3e）
- 在穿刺部位使用氰基丙烯酸酯胶水将熔融石英粘牢，并静置过夜使其完全固化。（见图3e）
4. 准备环氧树脂胶（双组分胶）
- 用细针将30份黄色固化剂加入70份黑色环氧胶中，并轻轻混合。混合后可直接使用。
5. 应用膜（所有后续步骤必须在显微镜下进行，并使用刻度纸估算物理尺寸）
- 小心地将聚砜膜拉过熔融石英，然后将膜拉入聚四氟乙烯（PTFE）管中，并使用锋利的手术刀将膜调整至5.5 mm。（见图3f）
- 使用细头笔在膜上标记一点，以确定从膜末端起2 mm的交换长度。
- 使用细针辅助，在膜尖端涂抹少量环氧胶以覆盖尖部。（见图3g）
- 使用步骤5.3中相同的细针，用环氧胶封闭透析膜与PTFE纤维之间的连接处。（见图3g）
- 在膜上从尖端至标记点处充分涂抹环氧胶，以确保2 mm的交换长度。静置过夜使其完全固化。（见图3g）在确定交换长度前，膜的长度为5.5 mm；涂抹环氧胶后，仅有2 mm的膜可用于扩散。
6. 安装金属套筒
- 使用弯钳将25 G针头切割成1 cm长的金属套管段。
- 将1 cm长的金属套管（25 G）套在熔融石英管的剩余部分上。该金属套管后续可用于连接进样管路与微透析探针。（见图3h）
- 用剩余的环氧胶密封金属套管与PTFE管之间的接头，并静置至少24小时使其完全固化。（见图3i）
- 在探针分叉处周围涂抹热熔胶，以实现额外的固定和稳定。
注意：探针的进样通道内部体积为0.045 µl，出样通道内部体积为2.5 µl。因此，当流速为1 µl/min时，在连接进样管后约需2.5分钟才能开始收集透析液。根据本方案，探针组装流程所制备的微透析探针可靠性可达95%。
7. 性能评估 体外 回收实验
- 将截留分子量为30 kDa、交换长度为2 mm的探针分别浸入含有1 mM葡萄糖和1 mM乳酸的aCSF储备液中；在另一项实验中，将其浸入含有100 nM ATP和100 nM乙酰胆碱的脑脊液中。
- 用aCSF对探针进行灌注，设置流速为1 µl/min，并在室温（22 °C）下进行实验。让探针在储备液中平衡1小时，之后每30分钟收集一次样品，收集后于-80 °C保存直至检测。
- 计算体外回收率时，将透析液中分析物的浓度与储备液中已知的分析物浓度进行比较。结果以透析液中物质浓度占储备液浓度的百分比表示。
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结果
同心式定制微透析探针由聚砜膜构成，其分子截留量为30 kDa。探针组件如图3所示。
它表现出一种 体外 小分子能量代谢物葡萄糖（180.16 Da）和乳酸（112.06 Da）的回收率分别为19.10 ± 1.2%和21.2 ± 1.6%。对于分子量为181.66 Da的带正电荷的乙酰胆碱，其表现出 体外 回收率为 22.6 ± 1.4%。分子量为 551.62 Da 并带有三个带负电荷的磷酸基团的 ATP 给出了 体外 恢复到相似程度（22.4 ± 0.7%）。 体外 小分子回收率如图所示 图 4A.
分子量大于1,000 Da的神经肽表现出较低的 体外 与较小分子相比的回收率<500 道尔顿）（参见 图 4B）。在所测试的神经肽中，血管紧张素II（1,046.18 Da）是由8个氨基酸组成的最小肽。它表现出 体外
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讨论
图3展示了一个典型的探针组件示例。管路（外径1.6 mm；内径350 µm）、熔融石英管（外径105 µm；内径40 µm）和透析膜（外径245 µm；内径210 µm）的内外径尺寸必须严格符合要求。同时，透析膜与熔融石英管之间应保持105 µm的间隙，透析膜与管路之间也应保持105 µm的间隙。如果这些尺寸存在偏差，探针内部压力可能升高，导致透析膜泄漏。
本文介绍了一种交换长度为 2 mm 的微透析探针，适用于小鼠脑区的微透析。然而，其尺寸可轻松调整，以适用于更大动物中更长交换长度的应用。
组装的某些部分可以替换。例如，不必使用聚四氟乙烯（PTFE）管路，也可使用外径和内径尺寸相同的聚乙烯管路。仅在使用聚四氟乙烯管路时才需要对管路进行粗糙化处理。透析膜也可以更换。目前的探针组件使用截留分子量为30 kDa的透析膜，但任何其他具有相同尺寸的透析膜也可使用。因此，我们自行设计的探针组件具有很高的灵活性，可对分子量范围广泛的物质进行透析；透析膜的截留分子量越高，能够透析的物质的分子量也越高。
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
作者感谢 G. Barka（德国弗里德里希斯多夫 SunChrom GmbH 公司）提供的支持及环氧胶。此外，作者感谢德国巴特洪堡弗雷斯尼乌斯医疗公司（Fresenius Medical Care）提供 Capillary Haemodiafilter FXCorDiax。本研究经费由法兰克福歌德大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 环氧树脂胶 | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| 熔融石英内径 40 µm，外径 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | 货号：6.040105 | |
| 聚砜膜（血液透析滤器 FX Cor Diax 600） | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | 目录号：F00001593 | |
| 氰基丙烯酸酯胶（Pattex® 塑料强力胶） | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| 特氟龙管 1.6 × 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | 货号：969-195.219 | |
| 手术刀（Feather® 外科刀片 No. 10） | pfm medical ag, cologne, Germany | 货号：07310 | |
| 显微镜 | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G × 11"（0.3 × 25 mm）套管 Sterican ® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 目录号：9324500 | |
| 25 G × 11/2"（0.5 × 40 mm）套管 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 目录号：9186166 | |
| 细头笔（Stabilo point 88 细头 0.4） | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | 货号：88/36 | |
| 热熔胶 （ULTRA Power 胶棒 × 11 mm） | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | 货号：4007841046910 | |
| 砂纸 P60 230 × 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | 目录编号：2608605397 |
参考文献
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
- Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
- Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
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