介绍了一种从芽殖酵母中进行染色体表面铺展的方法。该方法源自Loidl和Klein先前描述的方法。此外，我们还展示了一种对铺展的染色体进行免疫染色的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的细胞核体积较小，限制了光学显微镜在分析染色质结合蛋白亚核分布中的应用。通过酵母细胞核的表面铺展技术，可使染色质展开，同时保留结合的蛋白质。该方法通过平衡DNA结合蛋白的固定与去污剂处理，实现有效铺展。本方法在 Josef Loidl 和 Franz Klein 所述方法1,2的基础上略作修改，已被用于表征有丝分裂细胞周期各个阶段多种染色质结合蛋白的定位，尤其适用于研究减数分裂染色体结构，如减数分裂重组体（recombinosomes）和联会复合体（synaptonemal complex）。我们还描述了一种无需使用Lipsol的改进方案，Lipsol是一种原方法中推荐但目前已不再商业供应的专有去污剂。此外，本文还介绍了一种与染色体铺展法兼容的免疫染色流程。
引言
芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae在研究生物过程的分子机制（包括调控染色体功能的蛋白质）方面具有诸多优势。尽管芽殖酵母在遗传学、分子生物学和生物化学研究中具有公认的优势，但其细胞核体积微小，使得对核内蛋白质分布的细胞学研究变得复杂。典型的酵母细胞核直径小于1微米，仅比可见光的分辨率极限高出约5倍。因此，通过传统的免疫染色或使用绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白标签所获得的核蛋白分布信息十分有限。一种用于表征蛋白质亚核分布的有效方法是染色体表面铺展技术。该方法包括去除细胞壁、破坏细胞膜和核膜，并使细胞核内的不溶性成分沉降到显微镜载玻片表面。这些不溶性成分包括核基质和染色体。除了可去除可溶性核内容物（从而增强对染色质结合蛋白的检测能力）外，染色体铺展技术还能显著解压缩染色体，使铺展后的细胞核直径达到约3至5 µm（二倍体减数分裂核）或2至3 µm（二倍体有丝分裂核）。这种解压缩使得原本在完整细胞核中较难或无法分辨的核亚结构得以被检测。
染色体铺展技术的一个明显缺陷是，铺展过程可能会部分或完全破坏目标结构。尤其值得关注的是，与染色体结合的特定蛋白质可能在铺展过程中丢失。在解读实验数据时，应始终注意这一潜在问题。一个对铺展过程敏感的蛋白质实例是β-微管蛋白。在某些条件下，主要由微管蛋白构成的纺锤体可在铺展过程中得以保留3。观察纺锤体通常有助于对目标细胞核进行分期。然而，要可视化微管蛋白需要使用高浓度的固定剂；而在下文所述的标准条件下，纺锤体会丢失。此实例说明，在分析一种此前未被表征的蛋白质分布时，调整固定剂浓度以评估该蛋白质对此类变化的敏感性至关重要。尽管需关注铺展条件对染色体结构的影响，但铺展法在多种研究背景下已展现出其实用性和强大功能，广泛适用于有丝分裂细胞尤其是减数分裂细胞的表征研究4-7。
已广泛使用两种染色体铺展方法。第一种方法由 Dresser 和 Giroux8 开发，避免使用去垢剂，经 DNA 特异性染料 DAPI 染色后，可获得染色体形态相对保存良好的铺展样本。然而，该方法较难掌握，且在同一张载玻片的不同区域之间，铺展细胞核的质量差异显著。这一问题可能会影响定量分析，因为此类分析通常需要从一张载玻片上成像大量未经选择的细胞核，以避免数据采集偏差。第二种染色体铺展方法由 Loidl 和 Klein1 建立，其原理是通过多聚甲醛固定与去垢剂溶液引起的裂解及染色质去压缩之间实现平衡。若操作得当，该方法相较于 Dresser 和 Giroux 方法具有更高的可重复性，且区域间变异较小。本演示重点介绍 Loidl 和 Klein 方法的一种改良版本，因其具有较高的可靠性与操作简便性。
染色体铺展操作并不复杂且耗时较短；一天内可制备多达100张用于免疫染色的载玻片。此外，制备好的染色体铺展样本可在冷冻条件下长期保存数年，因此实验室可以建立冷冻染色体铺展样本库，以便在出现新的生物学问题或获得新的染色试剂时使用。
染色体铺展法最常与免疫染色和宽场荧光显微镜结合使用，但也可用于制备适用于超分辨率光学显微技术（如受激辐射损耗（STED）显微镜）的载玻片。
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方案
注意：以下方案的某些步骤需要在洁净的通风橱中操作。此外，该方法需要使用配备10倍长工作距离物镜的酵母四分体解剖显微镜来监测原生质球的形成。显微镜应提前放置在通风橱内并调试完毕。将显微操作臂和培养皿架从显微镜上取下，并放置在远离工作区域的安全位置。
1. 原生质球的制备
- 在所需条件下培养酵母。每个样品使用约 2 × 108 个细胞，例如 4 ml OD600 为 1.4（即 5 × 107 个细胞/ml）的培养液。尽管在某些情况下应立即处理样品，但在大多数应用中，细胞分装后可在冰上保存长达 8 小时再进行处理。
- 将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，在临床离心机中以 5 档（2345 rpm/857.5 × g）离心 3 分钟，使细胞沉淀。
- 小心倾去上清液，避免损失细胞沉淀。用 1 ml ZK 缓冲液轻柔重悬细胞，然后加入 40 µl 1 M 二硫苏糖醇（DTT）。轻柔混匀后孵育 2 分钟。按前述方法再次离心收集细胞沉淀（见步骤 1.2）。
- 用 1 ml ZK 缓冲液重悬细胞沉淀。加入 5 µl 新鲜配制并充分混匀的 Zymolyase 100T 溶液。在 30 °C 孵育 20–30 分钟，以去除细胞壁并生成原生质球。
- 取 10 µl 细胞悬液滴加于显微镜载玻片上，在解剖显微镜下（无需盖玻片）观察，判断原生质球形成是否完全。细胞应呈现膨胀且圆形，而非略呈椭圆形，并在加入 20 µl 水后发生裂解。若细胞未发生裂解，需将样品放回 30 °C 继续孵育，并每隔 10 分钟重新检测，直至观察到明显的水诱导裂解。随后按前述方法离心收集细胞沉淀（见步骤 1.2）。
- 用 2.5 ml 冷 MES/山梨醇缓冲液轻柔重悬并洗涤细胞沉淀。按前述方法离心收集细胞沉淀（见步骤 1.2）。再用 300–400 µl 冷 MES/山梨醇缓冲液轻柔重悬细胞沉淀。此阶段细胞可在冰上保存数小时。
2. 染色体铺展
注意：用于染色体铺展的玻璃表面（载玻片或盖玻片）应提前准备。每张载玻片或盖玻片应依次浸入水中、乙醇（EtOH）中，然后晾干，并用镜头纸抛光。若染色体将铺展在盖玻片上，则需用透明胶带或橡胶水泥将盖玻片固定在载玻片上。 除非另有说明，后续实验步骤将适用于载玻片或盖玻片上的铺展操作
- 使用 P20 移液器，将 20 µl 细胞悬液移取到洁净载玻片的表面。
- 使用 P200 移液器，加入 40 µl 的 3% PFA/蔗糖溶液，并用手轻轻“旋转”载玻片使溶液充分混匀，直至条纹（Schlieren lines）消失。将载玻片置于显微镜下，确认细胞处于焦点位置。PFA 溶液应在使用当天于通风橱中新鲜配制。
注意：若目标蛋白此前尚未通过该方法检测过，建议额外制备使用含 2% 和 4% PFA 溶液的载玻片，以确定蛋白的保留是否对固定条件敏感。当需要可视化相关微管蛋白（tubulin microtubules）时，可使用 4% PFA/蔗糖溶液。较高浓度的固定剂缺点是染色体“铺展不足”，而 2% PFA 也倾向于导致染色体“铺展不足”。 - 使用 P200 移液器，加入 80 µl 的 1% Lipsol，像之前一样旋转混匀，同时启动计时器。若无 Lipsol，可用 80 µl 的 1% NP40 或 80 µl 去离子水（dH2O）替代（参见代表性结果，图 2）。
- 仔细观察细胞，并每 15 秒轻轻旋转载玻片一次。当约 80% 的细胞发生裂解（消失）时，停止计时，立即从显微镜上取下载玻片，加入 80 µl PFA/蔗糖溶液并旋转混匀。裂解应在启动计时器后 30 至 90 秒之间发生。
注意：若多个载玻片在相近时间发生裂解，则后续载玻片可省略显微镜监测，仅需精确计时从加入 Lipsol 到最终加入固定剂的时间间隔。但此简化方法仅在同一样本制备多个载玻片时可靠。当不同载玻片来自不同时间点或不同培养物的样本时，最好对每个样本的裂解过程进行显微镜监测。 - 将载玻片放置于洁净平整的表面上，使用洁净的一次性巴斯德移液器管壁，在液滴弯月面下方但高于载玻片表面的位置，将液体均匀铺展至整个无霜区域，i.e. 切勿用移液器“刮擦”载玻片表面。不同载玻片之间不得重复使用同一移液器，以防样本交叉污染。
- 将载玻片置于通风橱中过夜晾干。不溶性核组分将沉降并附着于载玻片表面。对于大规模实验，需提前规划干燥阶段的空间使用。
- 干燥后，最好在同一天内立即进入免疫染色步骤以获得最佳结果。然而，干燥后的蔗糖溶液会将铺展的染色体包裹在类似“蜂蜜”的基质中，允许样本冷冻保存：载玻片可转移至塑料玻片盒中，在 -20 °C 下长期保存数年。
3. 免疫染色
- 将载玻片浸入 0.2% Photo-Flo 溶液中 30 秒以去除蜂蜜。将载玻片倾斜靠在纸巾边缘，以去除残留的 Photo-Flo。
- 将载玻片浸入 1× TBS 中洗涤 5 分钟。通过将载玻片倾斜靠在边缘上去除多余液体，但不要让其干燥。
- 将载玻片磨砂面向上放置，用移液器将 300 µl TBS/BSA 缓冲液加至载玻片无磨砂区域的表面。
- 在室温下的湿盒中孵育 15 分钟（可使用底部铺有吸水纸的大型塑料容器，上方放置带孔金属板或装有湿润纸巾的塑料载玻片盒）。
- 将载玻片短边轻轻接触纸巾并倾斜靠在适当支撑物（如试管架）上以沥干液体。切勿使表面干燥。
- 立即加入 80 µl 含适当稀释度一抗的 TBS/BSA 缓冲液。若抗体用量有限，可使用 40 µl 并加盖 22 × 22 mm 盖玻片。对于粗制兔血清，通常稀释倍数为 1/50 至 1/500。
注意：对新批次的抗体应进行滴定实验。选择能产生显著高于背景信号的最稀释浓度。为控制背景染色水平，应使用相应缺失突变株制备的细胞核，或用前免疫血清对平行载玻片进行染色作为对照。 - 将一块抛光的 22 × 50 mm 盖玻片覆盖在载玻片上，避免产生气泡。操作时用拇指和食指夹住盖玻片长边的一端，使其与载玻片呈 30° 角，将远离手指的短边先降低，使其落在靠近磨砂区一侧“液滴”边缘内侧的载玻片上，然后平稳缓慢地放下盖玻片直至手指接触台面，再松开。盖玻片一旦接触载玻片，不得再调整其位置。
注意：若染色体铺展是在固定的盖玻片上完成（而非直接在载玻片表面），则此样品盖玻片在整个染色和洗涤过程中均保持附着于载玻片。染色时需在样品盖玻片上方另加一个盖玻片以均匀分布抗体溶液，之后将其丢弃。 - 将载玻片放入密封的湿盒中，在 4 °C 下避光孵育过夜。
- 握住磨砂边缘，将载玻片转移至玻璃载玻片染色架中，并浸入含有 TBS 的染色缸内。
- 轻轻上下晃动载玻片以去除盖玻片，注意避免用力过大。将载玻片在 TBS 中浸泡洗涤两次，每次 10 分钟。从染色架中取出载玻片，用纸巾轻触边缘去除多余液体，切勿使表面干燥。
- 在避光条件下，立即加入 80 µl 含 1/1,000 稀释度荧光染料标记二抗的 TBS/BSA 缓冲液（或使用 40 µl 加 22 × 22 mm 盖玻片）。按前述方法加盖盖玻片，并在湿盒中 4 °C 避光孵育 2 小时。
- 按前述方法去除盖玻片，沥干载玻片，并在避光条件下静置 1 至 2 小时使其自然风干。干燥过程中仍按前述方式将载玻片倾斜靠在纸巾上。
注意：若染色体铺展是在固定盖玻片上完成，应在干燥前将盖玻片从载玻片上取下。随后盖玻片的干燥方式与前述载玻片步骤相同。 - 在避光条件下，加入约 30 µl 含 DAPI 的封片剂（分三次，每次 10 µl），然后小心地加盖盖玻片。若铺展样本位于盖玻片上，则将封片剂滴加于洁净载玻片上，再将盖玻片（染色体面向下）缓慢放下贴合。
- 仍在避光条件下，等待约 2 分钟使盖玻片完全贴合，然后用透明指甲油密封边缘。将载玻片放入平放式载玻片盒中保存。
注意：若用于 STED 显微镜观察，应使用 ProLong Gold 封片。取 30 µl 不含 DAPI 的 ProLong Gold 封片剂，避光过夜固化。无需使用指甲油密封。 - 使用 40 或 100× 物镜及适用于 DAPI 的滤光片组，通过宽场落射荧光显微镜观察样本。可选择将载玻片避光保存于 4 °C 数周。切勿冷冻。
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结果
分散的细胞核形态在很大程度上取决于染色体固定与去凝集之间的平衡。即使试剂配比适当，同一张载玻片的不同区域之间，或不同载玻片之间，染色体去凝集程度仍可能存在差异。因此，在对图像进行解释之前，应先评估载玻片特定区域中染色体铺展的质量。
“过度铺展”和“不足铺展”的影响可以通过针对减数分裂重组蛋白的抗体来展示。图1中，减数分裂细胞核经两种真核生物链交换蛋白Rad51和Dmc1的双重免疫荧光染色，并用DAPI对DNA进行复染。图1A展示了两个铺展效果理想的细胞核实例。图1B显示了一个铺展不足的细胞核示例，而图1C则展示了两个过度铺展的细胞核实例。请注意，与铺展适当的细胞核相比，无论是过度还是不足铺展的细胞核中，Rad51和Dmc1的信号焦点数量均较少。在铺展不足的细胞核中，由于样品不够平坦，部分焦点可能处于焦外；此外，表位可及性的降低也可能导致无法检测到所有焦点。同时，较小的铺展直径可能导致空间上邻近的结构无法分辨。而在过度铺展的细胞核中，蛋白质可能因固定...
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讨论
铺展细胞核的形态在很大程度上取决于固定与裂解/去污剂处理之间的平衡。如上所述，为保留不同的细胞结构，需使用不同浓度的多聚甲醛（PFA）。对于大多数蛋白质而言，3% PFA 最为适宜；然而，若要保留纺锤体结构，则需使用 4% PFA。即使使用相同的试剂组合，裂解处理相对于固定的时机也会影响铺展细胞核的质量。为获得最一致的结果，应通过光学显微镜直接观察裂解过程，对每个原生质体样品的裂解时间进行标准化。有经验的观察者可见，圆形的原生质体在裂解前会因膨胀而变暗；裂解后，细胞残余物则呈现为悬浮的“鬼影”状结构。通过实验优化的试剂浓度与样品间裂解时间的标准化相结合，可稳定地获得铺展良好的细胞核。
用于观察染色体铺展的荧光染料和显微镜的选择取决于目标结构。通常情况下，铺展的细胞核非常薄（约200 nm或更薄），且可溶性蛋白在操作过程中已被去除。因此，共聚焦显微镜或全内反射荧光显微镜（TIRF）所提供的减少离焦荧光的优势在此类样本中作用有限。事实上，如果手动调焦发现多个焦平面均有染色信号，则表明细胞核铺展不足。尽管可使用任何与显微镜兼容的荧光染料进行染色，但较短波长的荧光染料可提高空间分辨率。例如...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为 GM50936，授予 DKB。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蜗牛酶（Zymolyase） | US Biological | Z1004 | 用含2%葡萄糖的50 mM Tris（pH 7.5）配制20 mg/mL溶液。每次实验前新鲜配制，4°C保存至使用。 |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | 已不再商业供应 | 用去离子水配制1% (v/v) 溶液。置于冰上保存。 |
| NP-40 | USB | 19628 | 用去离子水配制1% (v/v) 溶液。置于冰上保存。 |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| 载玻片 | Corning | 2948-75x25 | |
| 标准盖玻片 | Fisher | 12-544-E 或 12-540-B | |
| 高分辨率盖玻片 | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 溶液 | Kodak | P-7417 | 用去离子水配制0.2% (v/v) 溶液。 |
| TBS 缓冲液 | 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，24.7 mM Tris，pH 8 | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A2153 | 用TBS缓冲液配制1% (w/v) 溶液。4°C可保存一个月。 |
| 一抗 | |||
| Alexa Fluor 488 驴抗兔 | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) 抗体 | |||
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ProLong Gold 封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| 塑料载玻片盒 | Fisher | 03-448-1 | 将已干燥铺展的载玻片置于盒内插槽中，于-20°C保存。也可用作湿盒。 |
| 纸板载玻片盒 | Fisher | 12-587-10 | 用于方便地运输染色或封片后的载玻片，或于4°C保存。 |
| 柯普林瓶（Coplin jar） | Fisher | 08-816 | 用作载玻片的洗涤容器。 |
参考文献
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
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- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
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