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一种用于功能研究的3D人体肺组织模型 结核分枝杆菌 感染

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DOI：

10.3791/53084

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2015年10月5日

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1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Department of Medicine, Karolinska Institute

本文内容

摘要

人类结核感染是一个复杂的过程，难以建立模型 体外在此，我们描述了一种新型的三维人类肺组织模型，该模型可重现感染过程中发生的动态变化，包括免疫细胞迁移以及在生理环境中的早期肉芽肿形成。

摘要

结核病（TB）仍对全球人类健康构成重大威胁，亟需建立一种成本效益高且可靠的模型，以帮助我们理解该疾病的发病机制，并推动新治疗方案的发现。. 体外 单层细胞培养或共培养体系缺乏三维（3D）环境及组织层面的响应。本文中，我们介绍一种创新的 体外 一种人类肺组织模型，有望成为研究感染过程中复杂事件的有效工具 结核分枝杆菌 (M. tuberculosis）。该3D组织模型由组织特异性的上皮细胞和成纤维细胞组成，这些细胞培养在多孔膜上方的胶原基质中。暴露于空气后，上皮细胞在顶端侧形成多层结构并分泌黏液。通过引入感染的人原代巨噬细胞 M. tuberculosis 在该组织模型中，我们已证实免疫细胞会迁移至感染组织并形成结核病（TB）肉芽肿的早期阶段。这些结构重现了人类结核病的一个显著特征——肉芽肿，而这一特征在目前广泛使用的实验动物模型中通常不存在或不常见。这种类器官培养方法实现了三维可视化以及可靠的定量分析，为主宿细胞与病原体相互作用在时空动态方面的特征提供了关键信息。综上所述，肺组织模型为结核病研究提供了一个具有生理相关性的组织微环境。因此，该肺组织模型在基础机制研究和应用研究方面均具有潜在价值。尤为重要的是，该模型允许添加或操控特定细胞类型，从而拓展其在多种肺部感染性疾病建模中的应用范围。

引言

在人类中，对感染的反应、组织炎症、细胞募集、组织重塑以及组织稳态的调节是涉及多种细胞类型的复杂过程。因此，这些过程最适合在局部组织微环境中进行研究。以往，这类研究主要依赖实验动物模型。然而，常用的实验动物存在诸多局限性，因其对病原体的反应往往与人类不同，且疾病进程也存在差异。 1人类 体外 肺组织模型具有研究人类肺部特异性免疫反应的潜力。

人类结核病感染（TB）主要是一种影响肺部的疾病。Mycobacterium tuberculosis（M. tuberculosis）是结核病的致病因子，通过气溶胶 droplets 进入肺部，并被运送至肺泡腔，在此作为先天免疫应答的一部分，细菌被肺树突状细胞和肺泡巨噬细胞吞噬2,3。病原体被吞噬后，会被包裹在吞噬体中，理想情况下，吞噬细胞可由此中和并杀灭病原体。据估计，高达50%的M. tuberculosis暴露个体能够通过先天免疫应答清除感染4。其他感染结局包括后期通过适应性免疫系统清除病原体、潜伏性感染，或在最严重的情况下发展为慢性活动性结核病5。

此前尚未有 体外 用于人类结核病研究的组织模型。人类巨噬细胞或其他外周血细胞的单细胞培养常被使用 6,7该方法的缺点在于无法反映暴露于肺组织中不同细胞类型协同作用的动态过程 M. tuberculosis因此，有必要开发一种 体外 模型以开展结核病的功能与机制研究。基于细胞的 体外 本文所述的人类肺组织模型最初由我们研究团队建立，用于树突状细胞功能的研究 8我们已将该方法改进用于结核病的研究。

本文介绍的人肺组织模型包含组织特异性的上皮细胞和成纤维细胞8。这些细胞在Transwell小室中培养于多孔膜表面的胶原基质上，可形成类似于正常人肺组织的结构（图1）。当暴露于空气时，细胞开始在顶端侧分泌黏液8。通过将感染了M. tuberculosis的人原代巨噬细胞植入该模型，我们观察到免疫细胞在组织中的迁移过程以及结核病早期肉芽肿的形成9。这是首个用于结核病研究的人体组织模型，为研究肺部结核病及其他肺部疾病的先天免疫应答提供了有前景的工具。迄今为止，我们在该模型中仅使用了单核细胞和巨噬细胞作为免疫细胞，但可通过引入其他相关细胞类型来提高模型的复杂性。

显示上皮组织形成示意图，包括胶原基质和感染的巨噬细胞整合。
图1. 肺组织模型的示意图。（A）该模型由人肺特异性上皮细胞、M. tuberculosis感染的原代巨噬细胞以及接种于Transwell滤膜上含胶原的成纤维细胞层中的红色染料标记的单核细胞组成。将该组织模型暴露于空气中可诱导上皮细胞产生细胞外基质蛋白、分泌黏液并形成分层结构。由此构建的三维组织模型是一种有效的工具，可用于在接近人体肺部环境的条件下研究M. tuberculosis感染。（B）组织模型制备过程中各步骤的代表性显微图像。（C）肺模型组织切片的完整结构。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

注意：本研究使用的免疫细胞来源于瑞典林雪平大学医院血库购买的健康匿名献血者的外周血。本方案适用于24 mm的6孔板小室。不建议直接适配其他孔板规格，因为组织模型在构建过程中会同时发生垂直和水平方向的收缩。

1. 材料、培养基的准备及细菌/细胞系的培养

  1. 细菌培养：
    1. 在 Middlebrook 7H9 培养基中培养携带 pFPV2 质粒的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）H37Rv 菌株，该菌株可组成型表达绿色荧光蛋白（GFP），培养基中添加 0.05% Tween-80、0.5% 甘油、卡那霉素（20 µg/ml），并补充 Middlebrook 白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶富集液（Middlebrook ADC 增补剂），于 37 °C、5% CO2 条件下培养 7–10 天。
      注意：所有涉及活体毒力型 M. tuberculosis 菌株的实验操作均须在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。
  2. 配制 1× Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）完全培养基（添加 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、10 mM HEPES、0.1 mM 非必需氨基酸以及 10% 热灭活胎牛血清（FBS））。同时配制不含抗生素的 DMEM 完全培养基。
  3. 配制 1× 最低必需培养基（MEM）完全培养基（含 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、10 mM HEPES、0.1 mM 非必需氨基酸以及 10% 热灭活胎牛血清（FBS））。
  4. 纤连蛋白/胶原蛋白包被培养瓶的制备（总体积 10 ml）：
    1. 取 8.8 ml 无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）加入洁净试管中，再加入 1 ml 牛血清白蛋白（1 mg/ml）、100 µl I 型牛胶原蛋白（3 mg/ml）和 100 µl 重组人纤连蛋白（1 mg/ml）。
    2. 将试管倒置 5 次以混匀溶液。每瓶 T-25 培养瓶加入 1 ml、T-75 培养瓶加入 2 ml 包被液，4 °C 过夜孵育。孵育结束后吸除包被液，将包被后的培养瓶置于室温保存。
      注意：收集的包被液可在 4 °C 保存，并可重复使用三次。若储存超过两周，液体可能变褐（晶体形成），此时必须弃用。
  5. 成纤维细胞培养：
    1. 在完全 DMEM 培养基中培养并维持 MRC-5 细胞系（一种来源于14周龄男性胎儿正常肺组织的人肺成纤维细胞系），培养条件为 37 °C、5% CO2。使用传代次数为 24–26 代的细胞，培养至细胞融合度达 70–80%。
      注意：传代次数 >30 的 MRC-5 细胞系易失去正常形态，不建议用于组织模型实验。
  6. 上皮细胞培养：
    1. 获取 16HBE14o-（16HBE）细胞，这是一种永生化的人支气管上皮细胞系，保留了正常人气道上皮细胞的分化形态与功能（该细胞系由美国加利福尼亚大学旧金山分校 Mt. Zion 癌症中心 Dieter Gruenert 博士惠赠10）。将 16HBE 细胞培养于纤连蛋白/胶原蛋白包被的培养瓶中，并在 37 °C、5% CO2 条件下用完全 MEM 培养基维持培养。
  7. 5× DMEM 的配制
    1. 将 13.4 g DMEM 干粉和 3.7 g 碳酸氢钠溶于 150 ml 无菌去离子水中，调节培养基 pH 至 7.3，定容至 200 ml，使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。将滤过的培养基收集于无菌容器中，室温保存备用。

2. 胶原包埋成纤维细胞的制备

  1. 将FBS和L-谷氨酰胺的冷冻分装样品在37 °C水浴中解冻。解冻后立即将样品置于冰上。将碳酸氢钠（71.2 mg/ml）和庆大霉素（50 mg/ml）置于4 °C保存。将50 ml离心管和10 ml无菌移液管预冷至4 °C。
    注意：除 5x DMEM 外，所有使用材料均在使用前置于冰上预冷，所有操作均在冰上进行。I 型牛胶原蛋白（1.1 mg/ml）必须保持低温，以防止胶原蛋白凝固。
  2. 准备成纤维细胞：
    1. 将胰蛋白酶在 37 °C 水浴中预热，并取足量与肺成纤维细胞（MRC-5）共同孵育 10 分钟，置于 5% CO₂ 培养箱中2 37 °C。加入1x DMEM完全培养基以中和胰蛋白酶。吸弃细胞悬液，于300 x g离心5分钟。吸弃上清液，将细胞重悬于2.3 x 105 细胞/ml，置于冰上直至使用。
  3. 配制预混液：
    1. 将以下成分加入标记为“预混液”的离心管中：395 µl 5倍浓缩DMEM，40 µl L-谷氨酰胺，120 µl NaHCO₃（71.2 mg/ml），440 µl 胎牛血清，5 µl 庆大霉素（50 mg/ml），总体积为1,000 µl；充分混匀预混液后置于冰上。
      注意：所列体积适用于一个24 mm的6孔培养插件。请根据所需培养插件的总数计算具体用量，但额外增加一份以确保充分，制备足量的预混液。
  4. 制备无细胞胶原混合物：
    1. 向每份培养物中加入1 ml无细胞胶原混合物。在冰上，按以下顺序向50 ml锥形管中加入：686 µl浓度为1.1 mg/ml的胶原蛋白、250 µl预混液和64 µl 1×完全DMEM，终体积为1,000 µl。充分混匀溶液，确保无气泡产生。操作需迅速，并将胶原混合物沿管壁加入，以避免产生气泡。
    2. 向置于6孔板中的插入式培养小室加入1 ml无细胞层混合物。插入式培养小室外的孔中不添加任何培养基。在37 °C培养箱中孵育30分钟。确保无细胞混合物完全覆盖整个插入式培养小室，且无气泡产生。
  5. 制备细胞胶原混合物：
    1. 在50 ml圆底离心管中，将细胞层各组分依次加入并置于冰上：2 ml 胶原蛋白、615 µl 预混液、58 µl 1x完全DMEM培养基和327 µl 肺成纤维细胞（MRC-5）悬液，终体积为3,000 µl。每孔培养需加入3 ml细胞-胶原混合液。
      关键步骤：在加入细胞悬液之前，务必仔细混合胶原蛋白与预混液。这一步骤可中和胶原蛋白的pH值，避免对成纤维细胞产生毒性作用。
    2. 将细胞层（3 ml）加至无细胞胶原层上方，置于37 °C培养箱中孵育2小时。操作需迅速，并将胶原加至管壁以避免产生气泡。
    3. 聚合完成后，在6孔板的底部（插入物下方）加入2 ml完全DMEM培养基，孵育24小时。
      注意：如果未发生聚合，请丢弃含有成纤维细胞-胶原基质的培养板插件并重新开始。最可能的原因是添加错误或上述试剂的体积不正确。

3. 成纤维细胞-胶原基质的连续培养

  1. 使用干净的镊子小心提起插入物，用移液器吸去孔底部的培养基。在孔底部加入 2 ml 完全 DMEM，然后在插入物内加入 2 ml 完全 DMEM。避免在插入物下方引入气泡，因为这会阻碍内外腔室之间的营养物质扩散。使用微量移液器吸头去除气泡。
  2. 每隔两天更换一次培养基（插入物内部和下方），并继续培养约 5–7 天。从插入物中移除培养基时需小心操作。为避免接触成纤维细胞-胶原蛋白基质，可用干净的镊子轻轻倾斜插入物，并从插入物壁面处吸出培养基。
    关键步骤：胶原蛋白基质中的成纤维细胞应呈现伸长的表型，并重塑胶原蛋白，从而引起基质收缩。大约在 5–7 天后，基质收缩形成位于插入物中央的平台（直径为 10–14 mm）。收缩后的基质即可用于下一步实验。为了获得均匀的基质收缩，在接种前必须确保成纤维细胞与胶原蛋白充分混合（步骤 2.6.1）。

4. 免疫细胞接种（感染/未感染的单核-巨噬细胞混合物）

注意：以下实验步骤涉及毒力性分枝杆菌，因此必须在三级生物安全实验室（BSL-3）中进行。

  1. 原代单核细胞和巨噬细胞的制备：
    1. 使用已建立的方案从供体血液中分离外周血单核细胞。在构建组织模型的同一天分离单核细胞，并将其培养并分化为巨噬细胞约7天，随后用于结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染。
      注：这将确保在7天后同时获得巨噬细胞和收缩的成纤维细胞-胶原基质。同时分离新鲜的单核细胞，以便与感染的巨噬细胞共同加入。
  2. 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染巨噬细胞的制备
    1. 收集培养的细菌，用含0.05% Tween-80的1×PBS洗涤，重悬于不含抗生素的完全DMEM培养基中，通过截短的无菌27 G针头以分散细菌团块，并测定光密度。
      注：需预先在实验室中确定光密度对应的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌落形成单位（CFU）数值，以估算感染所需的细菌数量。
    2. 将巨噬细胞与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在感染复数（MOI）为10的条件下共孵育4小时。感染后，用1×PBS洗涤3次以去除细胞外细菌。使用以相同方式培养但未感染结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的巨噬细胞作为对照。
    3. 通过在37 °C下使用2 mM EDTA处理10分钟，使巨噬细胞从培养板上脱离，并将细胞重悬于不含抗生素的完全DMEM培养基中。
  3. 单核细胞的标记
    注：单核细胞的分离与标记可在BSL-2级生物安全柜中进行，随后转移至BSL-3级设施中进行后续操作。
    1. 根据制造商说明书，用终浓度为2 µM的PKH26红色染料对新制备的单核细胞（2 × 107 个细胞）染色5分钟。洗涤3次后，将细胞以1 × 107 个细胞/ml的密度重悬于不含抗生素的完全DMEM培养基中。
  4. 免疫细胞添加至成纤维细胞-胶原基质
    1. 成纤维细胞-胶原基质培养5–7天后，吸除内外室的培养基，并向外室加入1.5 ml新鲜的不含抗生素的完全DMEM培养基。
    2. 在50 µl完全DMEM培养基中，按MO:MQ（5:1）的比例制备标记的单核细胞-巨噬细胞（未感染/感染）混合液。对于50,000个巨噬细胞，取250,000个标记的单核细胞。
    3. 将50 µl MO:MQ混合液加入成纤维细胞-胶原基质中，在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。孵育后，沿插入物壁缓慢加入2 ml培养基，继续在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
      注：由于加入的细胞附着较松，加液时应缓慢并沿插入物壁轻柔加入。

5. 肺上皮细胞（16HBE）的接种

注意：以下步骤必须在BSL-3实验室中进行。

  1. 将肺上皮细胞（16HBE）接种于MO:MQ-成纤维细胞-胶原层的上方。操作时，先用胰蛋白酶处理（如2.2.1所述）从培养瓶中解离16HBE细胞，并以不含抗生素的DMEM重悬至浓度为4 × 106 个细胞/ml。
  2. 吸除插入式培养小室内外的培养基，然后在小室外侧培养孔底部加入1.5 ml含抗生素的完全DMEM培养基。
  3. 在免疫细胞-成纤维细胞胶原基质上方加入50 µl 16HBE细胞悬液。在生物安全柜中静置2分钟，随后于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。孵育结束后，轻柔地在插入式培养小室内加入2 ml含抗生素的完全DMEM培养基，并在37 °C继续培养3天。该培养步骤有助于组织模型中上皮细胞的增殖。
    注意：由于接种的细胞初始附着较松散，添加培养基时应缓慢轻柔，沿小室壁滑入，避免直接冲击细胞层。

6. 3D 肺模型的空气暴露

注意：在加入感染的巨噬细胞后第5天，组织模型将暴露于空气中，后续步骤必须在BSL-3实验室中进行。

  1. 吸去插入物内部和外部的培养基。
    注意：此步骤中可收集上清液用于检测分泌因子。离心、无菌过滤后，将上清液于 -70 °C 保存。
  2. 在外室中加入 1.8 ml 无抗生素的完全 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2 天。插入物内部不添加培养基。
    注意：对组织模型进行气液界面培养可促进复层上皮的形成和黏液分泌，从而增强组织强度，并在生理上更接近人体肺组织。

7. 3D 肺组织模型的收获与封片


注意：以下步骤必须在 BSL-3 实验室中进行。

  1. 在感染巨噬细胞植入后的第7天，组织模型已准备就绪，可以进行收获。完全移除组织模型中的培养基，用4%多聚甲醛在室温下避光固定30分钟。此步骤可杀死细菌，并固定组织和细胞形态，以便后续处理。
  2. 使用手术刀将膜从培养小室插入物上分离下来，将带有组织的膜转移至含有1×PBS的孔中。
  3. 用洁净的手术刀切除并去除组织模型的边缘部分，然后将组织模型切成大约四个相等的方形小块。取其中一块组织置于防脱玻片上。其余组织块储存于4 °C的1×PBS中。
  4. 将组织干燥5分钟，然后使用含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂及盖玻片进行封片。将玻片置于室温避光处静置，直至完全干燥。
    注意：组织的厚度在中心与边缘之间可能存在差异，导致盖玻片轻微倾斜。为避免此情况，可在盖玻片的角落放置垫片（例如Parafilm）。
  5. 用指甲油封闭盖玻片边缘，并使其干燥。将玻片浸入70%乙醇中，以确保其可安全带出BSL-3实验室。

8. 可视化、图像采集与定量三维分析

  1. 使用共聚焦显微镜系统观察组织切片，该系统配备发射波长分别为 488 nm（用于激发 GFP，绿色通道）、420 nm（用于 DAPI，蓝色通道）和 555 nm（用于 PKH26 标记的单核细胞，红色通道）的激光器。
  2. 以 512×512 分辨率采集三维图像，Z 轴堆栈覆盖至少 20 µm 厚度，堆栈间间距为 1 - 1.5 µm。采集 5-10 个不同视野，覆盖整个组织样本。
    注意：采用如 Nyqvist 配置等优化光学分辨率的设置（包括波长、激光功率/曝光时间、像素大小和缩放倍数）。避免像素欠饱和或过饱和。
  3. 使用三维图像处理软件分析共聚焦图像。为实现细胞簇的三维定量分析，建议按以下步骤进行以获得最佳分析结果。
  4. 打开三维图像处理软件并加载图像。测量图像中待分析对象的尺寸，例如细胞核、单个单核细胞和单个细菌的大小。这些观测值有助于定义或筛选目标对象。
  5. 使用显示调节工具，通过调整各通道的图像对比度、亮度和融合不透明度来优化体渲染效果。此步骤旨在最小化噪声对体渲染的干扰。
    注意：伽马校正可能导致图像失真，应避免使用。
  6. 选择红色通道（单核细胞）创建表面，并设定阈值（可自动或手动选择）。如有需要，可使用滤波器限制红色单核细胞的选择或排除背景信号。同样地，按照上述方法分别为绿色通道（M. tuberculosis）和蓝色通道（细胞核）创建表面。
  7. 将数据导出至 Microsoft Excel 文件。可选择导出特定参数或全部数据。与细胞聚集分析相关的参数包括体积、强度、对象数量、体素数量和球形度。
  8. 以合适的图像格式（推荐 TIFF 格式）保存并导出图像。
    注意：也可通过动画菜单生成动画，并保存为媒体文件。
  9. 使用“添加参数”选项保存各通道的分析设置，后续可通过“重建”功能调用。可利用批量处理工具同时分析多个文件。
    注意：所有需比较的图像必须以相同方式采集、处理和分析。例如，8 位图像（256 整数）不应与 12 位图像（4096 整数）进行比较。

结果

一种用于研究人类结核病的3D肺组织模型可有效用于研究结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染中的宿主-病原体相互作用。图1概述了该方法的基本步骤、各步骤的代表性显微图像以及组织切片的整体显微结构。该模型包含多种人类肺组织组分，包括肺成纤维细胞、支气管上皮细胞以及嵌入3D组织环境中的原代单核细胞/巨噬细胞。除了整合人类肺组织的组分外，该模型还模拟了生理条件，如上皮的分层结构和黏液分泌。

以肺组织模型监测结核感染的应用实例展示如下 图2用于可视化 M. tuberculosis-免疫细胞迁移与相互作用，我们引入了感染的巨噬细胞 M. tuberculosis 表达GFP（绿色）的细胞与新分离的PKH26标记单核细胞（红色）共同加入组织模型（蓝色，DAPI染色细胞核）。在加入后的第7天 M. tuberculosis-感染细胞加入组织模型后，共聚焦显微镜显示红色单核细胞在感染部位（绿色）聚集图2），可模拟人类结核病的特征性病变 9.

用于三维可视化的系列代表性图像 M. tuberculosis感染组织模型及细胞簇的定量分析如图所示 图33D 可视化使用户能够灵活地交互、观察和量化 3D 图像中的多个特征。从顶端、旋转和侧向视角可以观察到绿色细菌与红色单核细胞簇的空间分布，如图所示。 图3B，这揭示了单核细胞在该部位的聚集现象 M. tuberculosis 簇 在未感染的组织中未观察到 (图3A）。我们对单核细胞簇的大小和数量进行了定量分析，发现细胞簇的大小（体积）有所增加（p<0.001），而单个单核细胞的数量减少（p<0.01）在 M. tuberculosis 与未感染的组织模型相比，感染组织（图3C和3D）。该数据验证了我们此前关于早期肉芽肿形成的发现 M. tuberculosis 在二维组织切片分析的肺组织模型中观察到的感染 9.

我们的数据表明，该组织模型为研究宿主细胞与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）之间复杂的通讯网络提供了天然的三维环境。我们还发现，三维可视化和定量分析是研究该组织模型特征的更优工具（图3）。对细胞簇（例如肉芽肿）的定量分析通常涉及多个细胞层，而三维定量分析能够完整地捕捉这些结构。此外，在该模型中对单个细胞或细菌的精确空间和时间特征进行可视化，可在指定实验室中开展活体成像、迁移和追踪研究。

Fluorescence microscopy showing GFP bacteria, PKH26 monocytes, DAPI nuclei with merged images.
图2. 组织模型中单核细胞在毒力菌周围聚集 M. tuberculosis 未感染和感染的代表性共聚焦图像 M. tuberculosis 感染组织模型被展示。绿色面板（结核分枝杆菌-GFP), 红色（PKH26标记的单核细胞）、蓝色（DAPI染色的细胞核）及合并通道显示了与未感染组织相比，单核细胞在感染组织中的募集情况。比例尺 - 100 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

Monocyte distribution analysis; 3D microscopy; optical sectioning; apical, rotational, lateral views.
图3. 组织模型的三维可视化与定量分析提供了有用的信息。 整个组织模型三维可视化的代表性图像 (A) 未感染组织， （B） 感染了 M. tuberculosis 通过使用蔡司LSM700共聚焦显微镜进行光学切片，并利用Imaris图像处理软件（版本7.6.8）进行定量分析。这些图像以20倍放大倍数采集，包含14个z轴层叠，覆盖组织厚度为 19.5 µm 与 1.5 µm 间隔，从而可以从顶端、旋转水平、旋转垂直和侧向视图进行观察（A 和 B）。 (C) 单核细胞簇的定量分析揭示增强的（p<0.0001）早期肉芽肿簇的大小 M. tuberculosis 感染与无感染相比。 (D) 单核细胞数量的定量结果显示下降（p<0.01），表明感染组织中的簇集数量多于未感染组织。绿色 –M. tuberculosis-GFP，红色 – PKH26标记的单核细胞，蓝色 – 细胞核，比例尺 – 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在感染部位募集并形成有序的细胞簇是人类结核病的特征11。这些被称为结核性肉芽肿的动态结构主要由免疫细胞（巨噬细胞、单核细胞、T细胞和B细胞）以及围绕M. tuberculosis的多核巨细胞组成。长期以来，人们认为肉芽肿的作用是将感染局限化，阻止细菌的局部扩散。然而，最近的研究表明，肉芽肿的形成对结核分枝杆菌早期的存活、增殖和播散至关重要12。新研究的一个策略是鉴定能够有效作为靶点的分子或通路，以抑制肉芽肿形成和/或结核病播散过程中的细胞迁移。

针对结核病（TB）的新研究存在一个局限性，即缺乏能够模拟人类结核病的模型。目前最常用的实验动物在感染结核分枝杆菌（M. tuberculosis）后无法形成真正的肉芽肿，因此不适合用于结核病研究13-16。非人灵长类动物的结核病表现与人类最为相似17，但由于操作成本高昂及伦理问题，通常不作为首选。人类结核病是一种复杂的免疫学过程，难以在体外（in vitro）建立模型。单层细胞培养或共培养体系缺乏三维环境和组织层面的反应。因此，我们开发了一种创新性的肺组织模型，该模型基于人源原代免疫细胞和人肺特异性细胞系8,9。该模型展现出人类肺组织的典型特征，包括含有均匀分布巨噬细胞的上皮层、细胞外基质的形成、分层的上皮结构以及黏液分泌9。

三维人类肺组织模型相较于传统模型具有多项优势 体外 单培养或共培养接种于组织培养板或Transwell小室。首先，人肺特异性细胞（成纤维细胞和上皮细胞）通常未被包含在 体外 单培养或共培养。其次，免疫细胞与肺特异性细胞被嵌入一种三维生理环境（富含胶原蛋白的细胞外基质）中。细胞对刺激/感染的反应以及细胞的迁移行为（例如肉芽肿的形成）在二维与三维环境之间存在显著差异。此外，所述方法可实现三维可视化及可靠的三维定量分析，从而提供有关细胞空间分布与复杂细胞间相互作用的关键信息。

模型组织中的实验性感染 M. tuberculosis 导致巨噬细胞在感染部位聚集，类似于早期结核病肉芽肿（图2和图3）。我们最近证明，那些在分泌毒力因子ESAT-6能力方面存在缺陷的突变菌株 Mycobacterium bovis 缺乏ESAT-6的BCG未能诱导单核细胞聚集（无早期肉芽肿形成），与毒力菌株相反 M. tuberculosis 9这些数据与从上述观察中得出的结果一致 Mycobacterium marinum感染的斑马鱼胚胎，其透明特性可实现对肉芽肿形成的优雅活体成像 12由于目前尚无结核病的金标准模型，我们利用结核病患者手术切除的组织活检样本对该方法进行验证。 9. 我们的 体外 组织模型与结核病患者的肺和淋巴结活检样本具有多个相似特征，包括巨噬细胞在肉芽肿中的聚集现象，以及胞内和胞外均存在细菌。 18 以及坏死的诱导 11.

尽管所述模型与人类结核病具有生理相关性，并且相较于其他模型具有多种优势 体外 模型存在一些局限性。例如，在已鉴定出的20多种人类胶原蛋白中，该模型仅包含Ⅰ型胶原以模拟细胞外基质。然而，Ⅰ型胶原本身是细胞外基质产物的复杂混合物，也是人体中最丰富的胶原类型。此外，我们已证实该组织模型中的上皮细胞和成纤维细胞可产生Ⅳ型胶原以及多种细胞外基质蛋白，如原弹性蛋白（tropoelastin）、波形蛋白（vimentin）和层粘连蛋白（laminin），表明新胶原的合成能力 8目前，该肺组织模型除了肺特异性细胞外，仅包含单核细胞和巨噬细胞，缺乏已知存在于肉芽肿中的中性粒细胞和淋巴细胞。值得注意的是，该模型并不限制引入其他免疫细胞，可用于探索这些细胞如何参与人类结核病复杂的细胞相互作用。在该模型中，已尝试植入原代肺泡巨噬细胞、皮肤特异性细胞以及肺癌细胞。由于我们的目标是使用更接近人类结核病的模型，尚未尝试引入小鼠细胞。

总之，该肺组织模型对基础机制研究和应用研究均具有重要意义。肺模型的潜在应用包括先天免疫研究，探讨宿主防御的机制方面，如吞噬体成熟、自噬、细胞因子、趋化因子和抗菌肽的产生，以及对不同类型细胞的功能特性进行表征。引人注目的是， 体外 组织模型可对一种或多种细胞类型进行操控，并提供与肺部相关的组织微环境，不仅适用于结核病研究，也适用于多种影响肺部的传染性和非传染性疾病的研究。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢林雪平大学健康科学学院显微技术核心设施，为本研究提供了先进的成像系统使用权限；感谢林雪平大学临床与实验医学系荣休科学家Karl-Eric Magnusson提供Imaris 3D/4D图像处理软件（Bitplane，瑞士）的使用权限；同时感谢S. Braian在肺部模型示意图绘制方面提供的帮助。本研究获得瑞典研究理事会（动物实验替代方案项目，编号2012-1951）和瑞典研究理事会（编号2012-3349）对M.L.的资助，以及瑞典战略研究基金会对S.B.的资助。S.B.还获得卡罗林斯卡学院、瑞典研究理事会、瑞典国际发展合作署（Sida）、瑞典民防应急署（MSB）和瑞典心脏肺脏基金会（HLF）的科研经费支持。M.S.获得卡罗林斯卡学院和斯德哥尔摩郡议会的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养小室BD Falcon353092
6 孔培养板BD Falcon353046
MRC-5 细胞，肺成纤维细胞ATCC#CCL-171
16HBE 细胞，肺上皮细胞由美国加利福尼亚大学旧金山分校扎克伯格旧金山总医院癌症中心 Dieter Gruenert 博士惠赠 
5 倍浓度 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（5 x DMEM）Gibco12800-082由粉末配制，但加水量减少至原来的五分之一。调节 pH 至 7.3，并使用 0.2 µm 滤膜过滤。
含葡萄糖的 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（1x DMEM）Gibco41965-039
含 Earle’s 盐的最低必需培养基（1x MEM）SigmaM4655
非必需氨基酸溶液（100x）Life Technologies11140-035
L-谷氨酰胺（200 mM，100x）Gibco25030-024
丙酮酸钠Life Technologies11360-039
NaHCO₃（71.2 mg/ml）实验室自制
热灭活胎牛血清（FBS）Gibco10270-10656 °C 水浴 30 分钟进行热灭活
庆大霉素（50 mg/ml）Gibco15750-060
1 M Hepes 缓冲液Gibco15630-056
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）Gibco15140-122
LymphoprepAxis-Shield7801
超纯 0.5 M EDTAGibco15575
经 PA 处理的牛胶原蛋白（500 ml）Organogenesis200-055
纯化牛胶原蛋白溶液（100 ml）Advanced biomatrix5005-B
细胞外基质蛋白，纤连蛋白（1 mg）BD354008
原代人单核细胞/巨噬细胞从人全血或血沉棕黄层中分离获得。
PKH26 红色荧光细胞连接试剂SigmaMINI26
表达绿色荧光蛋白的结核分枝杆菌 H37Rv将野生型 M. tuberculosis H37Rv 转化为携带 pFPV2 质粒，该质粒可组成型表达 GFP。
Middlebrook 7H9 培养基 Difco271310
BBL Middlebrook ADC 增补剂BBL211887
吐温-80
甘油
硫酸卡那霉素 B（20 µg/ml）SigmaB5264
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36935
胰蛋白酶-EDTA
牛血清白蛋白
多聚甲醛
DAPI
LSM700 共聚焦显微镜Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D 图像处理软件，版本 7.6.8Bitplane AG

参考文献

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