使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

摘要

靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。

摘要

将细胞和治疗剂靶向递送至特定部位，有助于集中治疗效应并最大限度减少对非靶向部位的有害影响，从而惠及广泛的生物医学应用。磁性细胞靶向是一种高效、安全且直接的递送技术。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）具有可生物降解性和生物相容性，可被细胞通过内吞作用摄取，从而使细胞对磁场产生响应。其合成过程包括先制备磁铁矿（Fe₃O₄）纳米颗粒，随后通过高速乳化法形成聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）包被层。PLGA-磁铁矿SPION的直径约为120 nm，其中包括直径约10 nm的磁铁矿核心。当置于培养基中时，SPION可被细胞自然内吞，并以小簇形式储存在胞质内体中。这些颗粒为细胞提供了足够的磁性质量，使其能够在磁场中实现定向迁移。通过使多种细胞类型对磁场产生响应，可实现多种细胞分选与靶向应用。此外，SPION还具有其他多种生物医学应用，包括作为医学成像的对比剂、靶向递送药物或基因、诊断检测，以及在肿瘤治疗或组织焊接中产生局部热疗。

引言

将细胞靶向递送并捕获至体内的特定部位，是多种生物医学应用所期望实现的目标。已有研究提出，通过磁共振成像（MRI）引导的聚焦超声将神经干细胞递送至大脑，可能成为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤和脑卒中的一种治疗方案¹。间充质干细胞因其天然的肿瘤趋向性，正在被研究用于向肿瘤递送抗肿瘤药物^2,3。心脏干细胞已被递送至心脏，作为心肌梗死的潜在治疗方法^4,5。此外，已开发出带有CD34抗体的血管支架，用于捕获循环中的祖细胞⁶。尽管这些细胞靶向策略前景广阔，但仍存在一些局限性，包括细胞特异性不足、细胞滞留效果不稳定以及脱靶递送等问题。

本方法的总体目标是实现对细胞的磁导向靶向，以应用于多种细胞递送和分选场景。磁靶向技术可将特定细胞精确递送至目标部位，同时最大限度地减少脱靶效应⁷。通过植入式或体外装置产生的磁场，可安全地引导体内磁标记细胞的定向移动⁸。大量研究致力于将磁导向靶向技术用于干细胞向受损组织的靶向递送，以改善组织再生效果，这些组织包括心脏^9-14、视网膜¹⁵、肺¹⁶、皮肤¹⁷、脊髓^18,19、骨²⁰、肝²¹和肌肉^22,23。

方案

1. 磁铁矿凝胶的合成

1. 使用浓盐酸清洗所有玻璃器皿，随后用去离子水冲洗，再用乙醇冲洗。室温下过夜干燥，最好置于干燥烘箱中。
   警告！盐酸有害——请佩戴个人防护装备并在通风橱中操作；乙醇有害——请佩戴个人防护装备。
2. 使用 Dreschel 瓶对 500 ml 去离子 H₂O₂ 通过轻柔地通入 N₂₂ 气体处理30分钟。
3. 在化学通风橱内搭建磁铁矿合成装置。
   1. 将一个500 ml三颈圆底烧瓶置于等温加热套中 用夹子和支架固定中心颈口。
   2. 在圆底烧瓶的一个侧颈中安装橡胶隔垫，另一个侧颈中安装带有橡胶隔垫的回流冷凝管。持续向回流冷凝管中通入冷水。
   3. 用连接氮气的针头刺穿圆底烧瓶的橡胶隔膜₂ 气体管线并用连接至通向鼓泡器的气体管线的针头刺穿回流冷凝管的橡胶隔垫（即， 烧瓶加水）以观察气体流出情况。
   4. 将桨叶式搅拌桨通过搅拌桨适配器安装至圆底烧瓶的中心颈口，再将桨叶搅拌桨的轴与固定在支架上的顶置式搅拌器相连。
4. 用 N₂ 吹扫圆底烧瓶₂ 气体并保留 N₂ 以低但可检测的流速流动的气体。
5. 从圆底烧瓶上取下回流冷凝管，加入 1.000 g 氯化铁(III)、0.6125 g 四水合氯化铁(II....

结果

由于在50 °C和1,000 rpm条件下搅拌氯化铁(III)和四水合氯化铁(II)的水溶液，所制备的磁铁矿纳米颗粒直径约为10 nm (图1)。这些结果表明磁铁矿纳米颗粒的成功合成。首次尝试合成时，必须通过取样验证磁铁矿纳米颗粒的尺寸和形貌。透射电子显微镜（TEM）是观察这些颗粒的首选方法。如果磁铁矿纳米颗粒的直径不接近10 nm，或形貌非球形，如图1所示，则应弃去该批次并重新进行合成。

使用高速乳化器将PLGA包覆在磁铁矿纳米颗粒表面，可制备出直径为120 nm的PLGA-磁铁矿超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）（图2）。这些结果表明PLGA-磁铁矿SPIONs的成功合成。首次尝试合成时，必须取少量批次样品验证PLGA-磁铁矿SPIONs的尺寸和形貌。扫描电子显微镜（SEM）是观察这些颗粒的首选方法。如果PLGA-磁铁矿SPIONs的直径未达到约120 nm或形貌非球形，如图2所示，则应弃去该批次并重新进行合成。尽管在某些应用中可能需要更大.......

讨论

与任何纳米颗粒合成方案一样，反应物化学品的纯度对于获得高质量且细胞毒性最小的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）至关重要。因此，必须购买高纯度的试剂，包括油酸（≥99%）、氯化亚铁四水合物（≥99.99%）、氯化铁（≥99.99%）、乙酸乙酯（HPLC级，≥99.9%）、正己烷（HPLC级，≥97.0%）、氨水（≥99.99%）和硫酸钠（≥99.0%）。尤其重要的是购买高纯度、高质量的PLGA，这类材料可能相对昂贵。此外，所有玻璃器皿在使用前必须用盐酸、去离子水和乙醇彻底清洗，并完全干燥。

同样，本方案中的纯化和洗涤步骤至关重要，以确保最终获得的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）具有高质量并表现出最小的细胞毒性。在用PLGA包覆之前，必须尽可能去除磁铁矿凝胶中的氢氧化铵、水和正己烷。因此，本方案的大部分步骤都致力于确保磁铁矿凝胶的纯度。随后，PLGA-磁铁矿SPIONs必须去除乙酸乙酯、泊洛沙姆（Pluronic）和过量的PLGA。最终的SPION洗涤步骤是整个方案中最耗时的部分，但必须完成以确保高纯度。具体而言，在每次洗涤过程中通过磁性收集颗粒可能非常耗时。搅拌溶液可显著加.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨水溶液，28% NH₃3 在 H2O, ≥99.99% 痕量金属基准	Sigma-Aldrich	338818-100ML	有害试剂——请佩戴个人防护装备
500 ml 洗气瓶	Ace Glass	5516-16
乙酸乙酯，CHROMASOLVR Plus，用于高效液相色谱，99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	有害试剂——请佩戴个人防护装备
50 ml 蒸发瓶，24/40 接口	Sigma-Aldrich	Z515558	适用于旋转蒸发仪
滤纸，直径3 cm，1号规格	Fisher	09-805P	适用于玻璃过滤漏斗
1 L 玻璃烧杯	Fisher	FB-101-1000	用于洗涤SPIONs
玻璃滤器漏斗，真空软管接头，适配24/40，30 mL	Fisher	K954100-0344
玻璃瓶盖	Fisher	03-391-46	适用于玻璃小瓶使用
2 ml 玻璃小瓶	Fisher	03-391-44	用于收集磁铁矿凝胶 &和 SPIONs
正己烷，CHROMASOLVR，用于高效液相色谱 ≥97.0%（气相色谱）	Sigma-Aldrich	34859-1L	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
四水合氯化亚铁 ≥99.99% 痕量金属基体	Sigma-Aldrich	380024-5G	有害试剂——请佩戴个人防护装备
无水氯化铁，粉末 ≥99.99% 痕量金属基准	Sigma-Aldrich	451649-1G	有害试剂——请佩戴个人防护装备
Isomantle 加热器，500 mL	沃特全球	EM0500/CEX1
实验室混匀仪	Silverson	L5M-A
冻干机	Labconco	7670520
微型刮勺	Fisher	21-401-25A	用于转移磁铁矿凝胶
NdFeB 磁铁，1 英寸 × 1 英寸 × 1 英寸	奇妙的磁铁	C1000H-M	强磁体，需小心操作
油酸， ≥99%（气相色谱）	Sigma-Aldrich	O1008-5G	置于冷冻器中保存；有害试剂——佩戴个人防护装备
顶置式搅拌器	IKA	2572201
顶置式搅拌器夹具	IKA	2664000	适用于 overhead 搅拌器使用
overhead 搅拌器 H 型支架	IKA	1412000	适用于 overhead 搅拌器使用
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-023
250 ml 塑料烧杯	Fisher	02-591-28
PLGA PURASORB PDLG（75/25 混合）	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502A 也可使用；储存于冷冻柜中
Pluronic F-127 粉末，BioReagent，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE可扩展刀片式搅拌桨，8 mm直径	SciQuip	SP4018
PTFE 反应釜适配器，适用于 24/40 接口，8 mm 直径搅拌桨	Monmouth Scientific	PTFE 反应釜适配器 A480	适用于PTFE可扩展刀片桨叶
循环冷却器	Clarkson	696613	适用于旋转蒸发仪使用
回流冷凝管，适配24/40，250 mm	Ace Glass	5997-133
旋转蒸发仪	克拉克森	216949
橡胶隔垫，适用于 24/40	Ace Glass	9096-56
带塞分液漏斗，250 ml	Fisher	10-438E
ACS级试剂硫酸钠， ≥99.0%，无水，颗粒状	Sigma-Aldrich	239313-500G
三颈圆底烧瓶，倾斜式，24/40 磨口接头，500 ml	Ace Glass	6948-16
超声波清洗机用带孔托盘	Fisher	15-335-20A	适用于超声波清洗器
超声波清洗机，2.8 L	Fisher	15-335-20
真空控制器	Clarkson	216639	用于旋转蒸发仪（可选）
真空泵	Clarkson	219959	适用于旋转蒸发仪使用