使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

摘要

靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。

摘要

将细胞和治疗剂靶向递送至特定部位，有助于集中治疗效应并最大限度减少对非靶向部位的有害影响，从而惠及广泛的生物医学应用。磁性细胞靶向是一种高效、安全且直接的递送技术。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）具有可生物降解性和生物相容性，可被细胞通过内吞作用摄取，从而使细胞对磁场产生响应。其合成过程包括先制备磁铁矿（Fe₃O₄）纳米颗粒，随后通过高速乳化法形成聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）包被层。PLGA-磁铁矿SPION的直径约为120 nm，其中包括直径约10 nm的磁铁矿核心。当置于培养基中时，SPION可被细胞自然内吞，并以小簇形式储存在胞质内体中。这些颗粒为细胞提供了足够的磁性质量，使其能够在磁场中实现定向迁移。通过使多种细胞类型对磁场产生响应，可实现多种细胞分选与靶向应用。此外，SPION还具有其他多种生物医学应用，包括作为医学成像的对比剂、靶向递送药物或基因、诊断检测，以及在肿瘤治疗或组织焊接中产生局部热疗。

引言

将细胞靶向递送并捕获至体内的特定部位，是多种生物医学应用所期望实现的目标。已有研究提出，通过磁共振成像（MRI）引导的聚焦超声将神经干细胞递送至大脑，可能成为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤和脑卒中的一种治疗方案¹。间充质干细胞因其天然的肿瘤趋向性，正在被研究用于向肿瘤递送抗肿瘤药物^2,3。心脏干细胞已被递送至心脏，作为心肌梗死的潜在治疗方法^4,5。此外，已开发出带有CD34抗体的血管支架，用于捕获循环中的祖细胞⁶。尽管这些细胞靶向策略前景广阔，但仍存在一些局限性，包括细胞特异性不足、细胞滞留效果不稳定以及脱靶递送等问题。

本方法的总体目标是实现对细胞的磁导向靶向，以应用于多种细胞递送和分选场景。磁靶向技术可将特定细胞精确递送至目标部位，同时最大限度地减少脱靶效应⁷。通过植入式或体外装置产生的磁场，可安全地引导体内磁标记细胞的定向移动⁸。大量研究致力于将磁导向靶向技术用于干细胞向受损组织的靶向递送，以改善组织再生效果，这些组织包括心脏^9-14、视网膜¹⁵、肺¹⁶、皮肤¹⁷、脊髓^18,19、骨²⁰、肝²¹和肌肉^22,23。

磁靶向细胞技术也被广泛研究用于实现可植入心血管器械的内皮化。均匀且完整的内皮层可在器械与循环血液成分之间形成屏障，从而减轻血栓形成和炎症反应。内皮细胞可在植入前直接递送至器械表面，或在植入后通过血管系统进行递送。在这两种情况下，均利用磁场将细胞捕获并固定在器械表面，以抵抗循环血液所产生的剪切应力。为此目的，已研制并测试了磁性血管支架^24-27和血管移植物²⁸。

磁性细胞靶向需要一种用磁性载体颗粒标记细胞的策略。这些颗粒可通过抗体或配体/受体对结合到细胞表面，也可通过内吞作用进入细胞内部。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）具有可生物降解、生物相容性良好等特性，并可被多种细胞类型有效内吞²⁹。这些颗粒能使细胞对磁场产生响应，并在体内随时间自然降解。SPION为体外培养细胞的磁性标记提供了一种简便且安全的方法，适用于多种磁性靶向与分选应用。本文提供了一种制备具有磁铁矿（Fe₃O₄）核心和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）包壳结构的SPION的方法。此外，还提供了一种在细胞培养中使用SPION标记细胞的方法。

方案

1. 磁铁矿凝胶的合成

1. 使用浓盐酸清洗所有玻璃器皿，随后用去离子水冲洗，再用乙醇冲洗。室温下过夜干燥，最好置于干燥烘箱中。
   警告！盐酸有害——请佩戴个人防护装备并在通风橱中操作；乙醇有害——请佩戴个人防护装备。
2. 使用 Dreschel 瓶对 500 ml 去离子 H₂O₂ 通过轻柔地通入 N₂₂ 气体处理30分钟。
3. 在化学通风橱内搭建磁铁矿合成装置。
   1. 将一个500 ml三颈圆底烧瓶置于等温加热套中 用夹子和支架固定中心颈口。
   2. 在圆底烧瓶的一个侧颈中安装橡胶隔垫，另一个侧颈中安装带有橡胶隔垫的回流冷凝管。持续向回流冷凝管中通入冷水。
   3. 用连接氮气的针头刺穿圆底烧瓶的橡胶隔膜₂ 气体管线并用连接至通向鼓泡器的气体管线的针头刺穿回流冷凝管的橡胶隔垫（即， 烧瓶加水）以观察气体流出情况。
   4. 将桨叶式搅拌桨通过搅拌桨适配器安装至圆底烧瓶的中心颈口，再将桨叶搅拌桨的轴与固定在支架上的顶置式搅拌器相连。
4. 用 N₂ 吹扫圆底烧瓶₂ 气体并保留 N₂ 以低但可检测的流速流动的气体。
5. 从圆底烧瓶上取下回流冷凝管，加入 1.000 g 氯化铁(III)、0.6125 g 四水合氯化铁(II) 和 50 ml 去除氧气的 H₂O.
   警告！氯化铁(III) 和四水合氯化铁(II) 有害——请佩戴个人防护装备。
6. 更换回流冷凝器，并在加热至 50 °C 的同时以 1,000 rpm 的速度搅拌。在此条件下搅拌可生成直径为 10 nm 的磁铁矿纳米颗粒。
7. 温度达到 50 °C 后，继续搅拌，通过圆底烧瓶的橡胶隔膜注入 10 ml 28% 氨水溶液。
   警告！氢氧化铵有害——请佩戴个人防护装备。
   注意：使用氢氧化铵溶液沉淀四氧化三铁，溶液应变为黑色。
8. 移除橡胶隔垫和N₂ 从圆底烧瓶的气体导管处加热至90 °C，以蒸除氨气，同时继续搅拌。
   注意：维持N的流动是可选的₂ 通过刺穿回流冷凝器的橡胶隔垫将物质注入圆底烧瓶，然而在此步骤中，磁铁矿氧化为磁赤铁矿的程度可忽略不计。
9. 当温度达到 90 °C 时，在持续搅拌下向圆底烧瓶中加入 1 ml 油酸。油酸用于包覆四氧化三铁纳米颗粒，形成四氧化三铁凝胶。
   注意！油酸有害——请佩戴个人防护装备。
10. 更换橡胶隔垫和 N₂ 将气体导管连接至圆底烧瓶，并移除回流冷凝器。
11. 关闭热源，以500 rpm转速搅拌2小时。
12. 将圆底烧瓶从等温加热套中取出，同时用强磁铁紧贴烧瓶底部以保留磁铁矿凝胶，倾倒出剩余液体。
    注意！请极度小心地操作强磁铁，以避免造成损坏或受伤。
13. 让磁性凝胶在室温下过夜风干（可选）。

2. 磁铁矿凝胶的纯化

1. 向圆底烧瓶中加入 40 ml 己烷以溶解磁铁矿凝胶
   注意！己烷有害——请佩戴个人防护装备，并在通风橱内操作。
2. 使用分液漏斗，加入 40 ml 脱气 H₂O，以去除磁铁矿溶液中的残留 H₂O。
   1. 缓慢将磁铁矿溶液倒入分液漏斗中的 H₂O 上，轻轻摇动两相液体 5 分钟。
   2. 排出并弃去下层水相部分。
   3. 缓慢向分液漏斗中加入 40 ml 脱气 H₂O，使其沉于磁铁矿溶液下方，然后如前轻轻摇动并排液。
   4. 重复操作，进行第三次洗涤。
3. 将磁铁矿溶液转移至锥形瓶中，加入数勺无水硫酸钠，并轻轻摇动，以去除磁铁矿溶液中任何残留的 H₂O。
4. 将磁铁矿溶液通过装有 1 µm 滤纸的漏斗过滤，以去除硫酸钠和残留 H₂O。
   注意：建议使用真空辅助过滤。
5. 将磁铁矿溶液转移至 50 ml 蒸发 瓶中，使用旋转蒸发仪在以下条件下蒸发己烷 2 小时：中等旋转速度、施加真空、蒸发 瓶置于 50 °C 水浴中，冷凝器内循环水温为 24 °C。
   注意：可选择在 PLGA 涂层 前储存磁铁矿凝胶。

3. 用PLGA壳包覆四氧化三铁纳米颗粒

1. 将3.60 g PLGA（75/25混合物）溶于240 ml乙酸乙酯中，配制成1.5%（m/v）的溶液。注意：乙酸乙酯有害——请佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作。
2. 使用磁力搅拌器将25.00 g Pluronic F-127溶于500 ml脱气H₂O中，配制成5.0%（m/v）的溶液。
   注：Pluronic F-127是一种非离子型两亲性嵌段共聚物，可作为生物相容性表面活性剂。它有助于在步骤3.3.2中稳定油包水乳液。
3. 使用微型刮勺将磁铁矿凝胶分装至六个已称重的玻璃小瓶中，每份0.040 g。对每份样品分别进行以下包衣和洗涤操作。
   注：分装成小份是为了确保操作高效及磁性倾析顺利进行，从而在步骤4冷冻干燥前最大限度提高纯度和产率，并减少降解。
   1. 将一份0.040 g磁铁矿凝胶和40 ml PLGA溶液加入一个塑料烧杯中，在超声清洗仪中超声处理10分钟。
   2. 向塑料烧杯中加入80 ml Pluronic溶液，并立即在最高转速下用实验室搅拌器乳化7分钟，使PLGA在磁铁矿纳米颗粒表面形成油包水乳液包衣。
   3. 立即将SPION溶液稀释于1 L去离子H₂O中，并在化学通风橱中超声处理1小时，以蒸发乙酸乙酯。
   4. 将强磁铁置于SPION溶液旁，轻轻搅拌，使棕褐色SPION在磁铁处聚集。
      注：可能需要间歇搅拌数小时，直至溶液变为乳白色，表明大部分SPION已被收集。
   5. 在保留烧杯中SPION的同时，用磁铁固定SPION，倾去上层水相溶液。
   6. 按以下步骤对SPION洗涤三次。
      1. 将SPION悬浮于1 L去离子H₂O中。
      2. 对SPION溶液超声处理20分钟。
      3. 将强磁铁置于SPION溶液旁，轻轻搅拌，使棕褐色SPION在磁铁处聚集。可能需要间歇搅拌数小时，直至溶液变澄清，表明大部分SPION已被收集。
      4. 在保留烧杯中SPION的同时，用磁铁固定SPION，倾去上层水相溶液。
4. 将由六份磁铁矿凝胶样品合成的SPION收集至一个已称重的玻璃小瓶中，制成水相悬浮液。必要时可选择通过磁性方式去除多余水分。

4. SPIONs的冷冻干燥

1. 将SPION溶液冷冻。
2. 在冻干机中将SPION溶液过夜冻干。
3. 称量冻干后的SPION。冻干SPION可保存于-20 °C，直至用于细胞标记。
   注意：在-20 °C保存可显著降低降解速率，延长保存期限。

5. 使用SPION标记细胞

1. 将一份 SPION 悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为 40 mg/ml，超声处理 30 分钟。
2. 将 SPION 溶液以每毫升细胞培养基 5 µl 的浓度加入接近汇合的细胞培养瓶中。通过轻轻摇动培养瓶以确保分布均匀。
3. 在 37 °C 下孵育细胞 16 小时。
4. 轻柔吸除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。
5. 收集磁标记的细胞，并用于实验。
6. 未使用的 SPION 溶液可在 4 °C 下保存，应在数月内使用完毕。每次使用前需超声处理 30 分钟。

结果

由于在50 °C、1,000 rpm条件下搅拌氯化铁(III)和四水合氯化铁(II)的水溶液，所制备的磁铁矿纳米颗粒直径约为10 nm （图1）。这些结果表明磁铁矿纳米颗粒的成功合成。首次尝试合成时，必须取少量样品验证磁铁矿纳米颗粒的尺寸和形貌。透射电子显微镜（TEM）是观察这些颗粒的首选方法。如果磁铁矿纳米颗粒的直径不接近10 nm，或形貌非球形，如图1所示，则应弃去该批次并重新进行合成。

使用高速乳化器将PLGA包覆在磁铁矿纳米颗粒上，可得到直径为120 nm的PLGA-磁铁矿超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）（图2）。这些结果表明PLGA-磁铁矿SPIONs的成功合成。首次尝试合成时，必须取少量批次样品验证PLGA-磁铁矿SPIONs的尺寸和形貌。扫描电子显微镜（SEM）是观察这些颗粒的首选方法。如果PLGA-磁铁矿SPIONs的直径未达到约120 nm或形貌非球形，如图2所示，则应弃去该批次并重新进行合成。尽管在某些应用中可能需要更...

讨论

与任何纳米颗粒合成方案一样，反应物化学品的纯度对于获得高质量且细胞毒性最小的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）至关重要。因此，必须购买高纯度的试剂，包括油酸（≥99%）、氯化亚铁四水合物（≥99.99%）、氯化铁（≥99.99%）、乙酸乙酯（HPLC级，≥99.9%）、正己烷（HPLC级，≥97.0%）、氨水（≥99.99%）和硫酸钠（≥99.0%）。尤其重要的是购买高纯度、高质量的PLGA，这类材料可能相对昂贵。此外，所有玻璃器皿在使用前必须用盐酸、去离子水和乙醇彻底清洗，并完全干燥。

同样，本方案中的纯化和洗涤步骤至关重要，以确保最终获得的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）具有高质量并表现出最小的细胞毒性。在用PLGA包覆之前，必须尽可能去除磁铁矿凝胶中的氢氧化铵、水和正己烷。因此，本方案的大部分步骤都致力于确保磁铁矿凝胶的纯度。随后，PLGA-磁铁矿SPIONs必须去除乙酸乙酯、泊洛沙姆（Pluronic）和过量的PLGA。最终的SPION洗涤步骤是整个方案中最耗时的部分，但必须完成以确保高纯度。具体而言，在每次洗涤过程中通过磁性收集颗粒可能非常耗时。搅拌溶液可显著加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨水溶液，28% NH₃3 在 H2O, ≥99.99% 痕量金属基准	Sigma-Aldrich	338818-100ML	有害试剂——请佩戴个人防护装备
500 ml 洗气瓶	Ace Glass	5516-16
乙酸乙酯，CHROMASOLVR Plus，用于高效液相色谱，99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	有害试剂——请佩戴个人防护装备
50 ml 蒸发瓶，24/40 接口	Sigma-Aldrich	Z515558	适用于旋转蒸发仪
滤纸，直径3 cm，1号规格	Fisher	09-805P	适用于玻璃过滤漏斗
1 L 玻璃烧杯	Fisher	FB-101-1000	用于洗涤SPIONs
玻璃滤器漏斗，真空软管接头，适配24/40，30 mL	Fisher	K954100-0344
玻璃瓶盖	Fisher	03-391-46	适用于玻璃小瓶使用
2 ml 玻璃小瓶	Fisher	03-391-44	用于收集磁铁矿凝胶 &和 SPIONs
正己烷，CHROMASOLVR，用于高效液相色谱 ≥97.0%（气相色谱）	Sigma-Aldrich	34859-1L	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758	有害试剂——请佩戴个人防护装备 &并在通风橱中操作
四水合氯化亚铁 ≥99.99% 痕量金属基体	Sigma-Aldrich	380024-5G	有害试剂——请佩戴个人防护装备
无水氯化铁，粉末 ≥99.99% 痕量金属基准	Sigma-Aldrich	451649-1G	有害试剂——请佩戴个人防护装备
Isomantle 加热器，500 mL	沃特全球	EM0500/CEX1
实验室混匀仪	Silverson	L5M-A
冻干机	Labconco	7670520
微型刮勺	Fisher	21-401-25A	用于转移磁铁矿凝胶
NdFeB 磁铁，1 英寸 × 1 英寸 × 1 英寸	奇妙的磁铁	C1000H-M	强磁体，需小心操作
油酸， ≥99%（气相色谱）	Sigma-Aldrich	O1008-5G	置于冷冻器中保存；有害试剂——佩戴个人防护装备
顶置式搅拌器	IKA	2572201
顶置式搅拌器夹具	IKA	2664000	适用于 overhead 搅拌器使用
overhead 搅拌器 H 型支架	IKA	1412000	适用于 overhead 搅拌器使用
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-023
250 ml 塑料烧杯	Fisher	02-591-28
PLGA PURASORB PDLG（75/25 混合）	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502A 也可使用；储存于冷冻柜中
Pluronic F-127 粉末，BioReagent，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE可扩展刀片式搅拌桨，8 mm直径	SciQuip	SP4018
PTFE 反应釜适配器，适用于 24/40 接口，8 mm 直径搅拌桨	Monmouth Scientific	PTFE 反应釜适配器 A480	适用于PTFE可扩展刀片桨叶
循环冷却器	Clarkson	696613	适用于旋转蒸发仪使用
回流冷凝管，适配24/40，250 mm	Ace Glass	5997-133
旋转蒸发仪	克拉克森	216949
橡胶隔垫，适用于 24/40	Ace Glass	9096-56
带塞分液漏斗，250 ml	Fisher	10-438E
ACS级试剂硫酸钠， ≥99.0%，无水，颗粒状	Sigma-Aldrich	239313-500G
三颈圆底烧瓶，倾斜式，24/40 磨口接头，500 ml	Ace Glass	6948-16
超声波清洗机用带孔托盘	Fisher	15-335-20A	适用于超声波清洗器
超声波清洗机，2.8 L	Fisher	15-335-20
真空控制器	Clarkson	216639	用于旋转蒸发仪（可选）
真空泵	Clarkson	219959	适用于旋转蒸发仪使用