本文展示了蛋白质功能化的平面玻璃支持脂双层的制备、蛋白质在脂双层内的流动性测定以及蛋白质密度的测量方法。同时概述了构建低噪声全内反射显微镜的路线图，该显微镜能够以高时空分辨率对脂双层中单个荧光染料分子进行可视化观察。
本文内容
摘要
摘要
在短短十年间，单分子显微技术已从仅由具备深厚光学与激光物理背景的物理学家所涉足的封闭领域，发展为如今受到各类生命科学家广泛关注的学科 1因为单分子成像具有揭示蛋白质行为的独特潜力 原位 在活细胞中以超越可见光衍射极限的前所未有分辨率揭示细胞结构组织 2玻璃支撑的平面脂双层（SLBs）是一种有效工具，可将原本悬浮生长的细胞紧密地固定在玻璃载片附近，从而能够在低噪声的全内反射照明模式下对其进行清晰成像。 3,4它们在研究蛋白质动力学方面非常有用，可用于分析细胞膜相关事件，如细胞间接触形成、内吞作用、外排作用以及免疫识别等。本文介绍了如何以可重复的方式制备高流动性的蛋白质功能化支持性脂双层（SLB），如何测定蛋白质在其中的流动性，以及如何利用单分子检测技术测量蛋白质密度。同时展示了如何构建成本效益高的具备全内反射荧光（TIRF）照明功能的单分子显微成像系统，并介绍了该系统在实验中的操作方法。
引言
了解膜蛋白发挥其细胞功能的机制通常是一项具有挑战性的任务，因为它们的作用模式常常由低亲和力相互作用决定，而这些相互作用难以通过传统的生物化学方法进行检测和评估。此外，膜蛋白可能在特定的膜区域高度富集5,6，或形成动态的高级结构，这些结构原则上可能改变其生物学活性7。
因此，非侵入性的激光辅助单分子荧光显微技术已成为在复杂细胞环境中研究蛋白质行为的首选方法。对于发生在质膜上的生物化学过程而言，这一点尤为适用，因为这些过程原则上可以在噪声降低的全内反射（TIRF）模式下进行监测。在此模式中，样品的照明被限制在靠近玻璃表面、厚度不超过200 nm的薄层区域内，从而显著减少细胞背景信号，并由于隐逝波激发光的特性，大幅提高荧光信号强度8,9。在实现单分子检测的高空间和时间分辨率时，这两个方面均至关重要。
平面支持性脂双层（SLB）不仅适用于全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，当其被适当配体功能化后，还可直接用于研究免疫细胞或其他细胞中发生的细胞间识别的分子动力学。此外，SLB也可简便地用于将运动性高或本身不贴壁的细胞固定在接近载玻片的位置，使其能够在TIRF照明下成像，这在进行单分子追踪或基于单分子的超分辨率成像实验时尤为理想。为实现此目的，需将蛋白质加载至高度流动性的SLB上。所用脂质的一个内在优势在于完全不存在蛋白质的非特异性结合。此外，SLB可被视为二维液体，具有自我修复的固有特性，能够在一定程度上补偿玻璃基底上的不规则结构。本文提供了一步一步的实验方案，用于制备负载目标蛋白质的高度流动性双层膜。 平面支持性脂双层（SLB）的制备方法如下所述，其主要成分为1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC，占90–99%），以及合成且功能化的脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-sn-甘油-3-{[N(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸]琥珀酰}镍盐（DGS NTA-Ni）含量较低（1–10%）。POPC 含有一条饱和脂肪酸链和一条单不饱和脂肪酸链，即使在室温下也能形成高流动性的脂双层。DGS NTA-Ni 通过其头部基团与多聚组氨酸尾部结合，可作为任意多聚组氨酸标签蛋白的锚定分子。图1).
重要的是，显微镜硬件必须包含若干外围设备，如下所述。根据所提供的信息以及光学和激光物理的基本知识，任何生物学家都应该能够搭建单分子成像系统。样品激发最好在倒置显微镜上以全内反射（TIRF）模式进行，因为该方式可减少由细胞自发荧光引起的杂散光和过高背景信号9。为此，需要特殊的TIRF兼容物镜（见下文）和激光照明。某些实验需要在毫秒量级的时间内进行并快速连续操作。为了节省照明时间或避免因重复照明导致的不必要漂白，通常可将发射光分入两个或多个光谱通道。这使得可以同时读取两个或多个发射谱图，在进行涉及荧光共振能量转移（FRET）的实验时，这一点尤为重要。在此情况下，单次激发光脉冲产生的发射信号可同时来自FRET供体和FRET受体（作为敏化发射）。相机应在激发时间内以足够低的背景捕获足够多的光子，以实现对单个荧光分子的可视化。计算机软件必须能够同步控制激发光源的开关与图像采集。以下及图2中提供了全面概述：
具备TIRF功能的物镜：对于基于物镜的全内反射荧光（TIRF）照明，使用标准玻璃载玻片（n=1.515）时，物镜的数值孔径（NA）必须等于或大于1.49。放大倍数可在60倍至150倍之间。该物镜应具备色差校正能力，以便在对不同荧光染料成像时实现共焦性。
激光器：近年来，可用的激光器选项数量显著增加。现代可电子调制的连续波二极管激光器成本效益高，且能够以前所未有的频率和速度运行。更昂贵的气体离子激光器在激光束质量方面表现优异，但需要外部快门（见下文）以及通常较为复杂的（水冷）冷却系统。
激发快门：声光调制器（AOM）可实现快速连续的开关切换10。为了实现严密的关闭，建议将AOM与机械快门结合使用。这样可以避免AOM因持续光照而产生过度加热，同时消除AOM在关闭状态下的漏光现象。
透镜用于扩束激光，并将其聚焦到物镜的后焦平面。这样，激发光以平行光束的形式离开物镜（图3），这是实现样品全内反射荧光（TIRF）照明所必需的。将焦点在物镜后焦平面内从中心移向边缘，会改变光束离开物镜的角度，但不会改变样品上激光光斑的位置（图3），因为光斑位置取决于整体光束几何结构。当入射角达到临界角时，即可实现TIRF照明，该角度可通过一组充当潜望镜作用的反射镜调节，从而在物镜焦平面内移动激光的焦点。透镜应具备消色差校正功能，可使用两个或三个透镜组合。三透镜系统由两个透镜组成望远镜结构，用于扩展激光束（从而扩大样品上的照明区域），第三个透镜则将扩束后的光束聚焦至物镜的后焦平面（图4）。望远镜和聚焦这两种功能也可仅通过两个透镜的组合实现（见图4）。
反射镜的反射率应至少达到95%，以避免激光损失。每次调节光束时，通常使用一对反射镜，因为这种配置足以精确调节激光束的任意角度和位置。
二向色镜叠加装置可反射和透射不同特定波长的光，用于叠加或分离两束激光的光束。
多色滤光片 比二向色滤光片更复杂，其作用是反射入射的激发光，并透射来自样本的发射光。它们被放置在物镜和显微镜管镜之间的滤光片盒中。
清洁滤光片：根据所用激光器的类型，在激光束离开激光器后，应立即在光路中放置具有窄透射带宽的激光清洁滤光片。
陷波滤光片旨在有效吸收具有窄带宽的激光，同时透射所有其他波长的光。它们被放置在发射光路中，以滤除任何杂散的激光激发光。然而，陷波滤光片仅在入射角为0°时起作用。如果陷波滤光片的带宽非常陡峭，不同入射角的光可能不再被有效反射。准直激光的阻挡不受影响，但后向散射光可能无法被有效阻止进入相机。
电动滤光轮 配备适当的滤光片轮后，可轻松安装到激发光路和发射光路中，便于在不同光强度之间进行简单切换（当配备中性密度滤光片时）或在不同荧光通道之间切换（当将其置于氙灯或汞弧灯前用于比率钙成像，或置于相机前以选择发射荧光团时）。
50:50 立方体分束器可用于将激光束分成两条独立的激发光路，也可在潜望镜前方将光束合并。
分光器（发射光路）： 为实现快速图像采集而无需进行任何物理滤光片更换，发射光被分拆为蓝移和红移两个通道。原则上，可通过使用二向色楔形镜或一组反射镜与二向色镜的组合，以波长依赖的方式将发射光束分离。需要两个发射滤光片来净化分离后的发射通道。
空间滤波器：激发光束有时需要进行空间滤波，以去除由低质量激光束发射出的非平行光线。空间滤波器由一个双透镜望远镜系统构成，其中一个小的针孔被精确地放置在两个透镜的共同焦点位置。这样，来自激光束中非平行部分的杂散光便能被有效阻断。在建立基于全内反射荧光（TIRF）的显微镜系统时，必须满足此类条件。针孔越小，空间滤波效果越强，但将针孔精确对准焦点也越困难；同时，第一透镜的焦距越短，滤波效果也越显著。为了减少透镜像差带来的影响，建议使用高质量、无限远校正、低倍率（10× 或 20×）的显微物镜，而非简单的透镜。
潜望镜装置：需要一个潜望镜结构，以在物镜的后焦平面内移动聚焦的激光束，这是实现全内反射荧光（TIRF）成像的前提条件。该装置可由两片两英寸反射镜轻松搭建而成：第一片反射镜配备平移台用于调节位置，第二片反射镜则固定于支架上，用于将扩束并聚焦后的激发光束反射进入显微镜（图5）。
相机：背照式电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）通常用于单分子信号的记录，原因在于其具有高量子效率（高达95%）、高采集速度（高达30 MHz）以及相对较低的噪声。将温度冷却至-80 °C可降低热噪声，目前市面上多款EMCCD相机均支持该工作条件。EMCCD技术的一个局限性在于，相机噪声随相机增益和所捕获信号的强度呈线性增加。而科学级CMOS（sCMOS）相机则不存在此问题，其成本显著更低，并且由于sCMOS芯片的特殊架构，其运行速度也远快于EMCCD相机。然而，CMOS技术存在的一个问题是，图像采集在单分子水平上仍缺乏一定程度的定量读出能力，因为每个像素具有不同的检测灵敏度。原则上可通过像素归一化来补偿这一差异，但该过程绝非易事11。正因如此，我们目前仍不推荐将sCMOS相机用于单分子显微成像；但鉴于该技术的快速发展，sCMOS相机可能很快将成为首选设备。慢扫描CCD相机完全避免了放大相关的噪声和像素间差异，并且在所谓的“动力学”模式下运行时，可支持最快的采集速率。在此模式下，除感兴趣区域（ROI）外，整个相机芯片均被遮蔽，从而可将芯片本身用作存储装置。当ROI首次曝光后，所产生的电荷逐行转移至芯片的遮蔽区域，在此过程中图像免受进一步光照影响。一旦所有ROI行均完成向遮蔽区域的转移（在亚毫秒范围内），ROI本身即可进行下一次曝光。此循环持续进行，直至CCD芯片的所有像素行均被填充。随后，芯片以较慢速度读出，显著降低读出噪声。例如，在一块1000 × 1300像素的芯片上，可连续快速记录20个50×50像素的ROI。由于图像在读出前需在芯片上保留较长时间，因此必须确保高质量的遮蔽效果，并对相机进行充分冷却（例如使用液氮），以减少过度的热噪声。部分EMCCD相机也支持动力学模式。
软件：激光器、快门、声光调制器（AOM）和相机曝光的时序控制，以及正确的图像存储，是任何成功成像实验的关键组成部分。原则上，许多定义好的操作都可以使用相机配套的软件包进行编程。商业软件包支持大量硬件外设，只需较少的技术知识即可实现集成。
脉冲发生器、数据采集（DAQ）板卡（带模拟和数字输出通道）以及示波器：脉冲发生器是将触发脉冲转换为具有确定时间和电压脉冲的理想选择。通过这种方式，可对激光器的输出功率进行精确控制，并将其时间精度调节至毫秒到亚毫秒范围。带有模拟输出的DAQ板卡也可实现相同功能，并可通过PCI插槽轻松集成到计算机主板中。脉冲持续时间、幅度和频率可通过示波器进行验证。
封闭整个激发光路：为避免因空气对流导致激发光束轮廓波动，应将整个激发光路与其所在实验室环境隔离开。此措施在进行全内反射荧光显微镜（TIRF）实验时尤为重要。此外，该措施还能保护光学元件免受灰尘污染，并防止人眼暴露于激光辐射。封闭结构可使用黑色卡纸简易搭建，黑色卡纸可在美术用品商店购买。
为了测定SLB的流动性，需进行光漂白后荧光恢复（FRAP）测量12。进行FRAP实验时，建议使用两条激发光路（见图3）。第一条光路用于成像双层膜的荧光信号，可采用全内反射荧光（TIRF）配置，并以低光强进行。第二条光路应能够提供短暂但高强度的漂白脉冲，且应设置为非TIRF模式，使其沿物镜的光轴方向射出。可在激发光路中放置一个圆形光阑（见图8），以投射出边缘清晰、形状完美的圆形漂白区域。为了将该光阑成像至样品平面，其最佳位置应位于透镜3的焦平面处（见图3）。然而，由于该透镜的焦距较长，即使将光阑置于略微偏移的位置，也能生成足够高质量的光阑像。
完成成像实验后，必须对原始数据进行适当分析。本文提供了多个逐步操作方案，涵盖主要参数的调整（如照明功率和时间、TIRF角度）、数据采集与数据分析。
方案
1. 平面支持脂双层的制备与功能化
- 脂质的混合
- 为获得10% DGS NTA-Ni / 90% POPC的脂质组成，将45 mg POPC和6.9 mg DGS NTA-Ni溶解于250 ml圆底烧瓶中的氯仿中。保持氯仿体积较低（仅几毫升），以便在下一步中蒸发。若需制备1% DGS NTA-Ni / 99% POPC的脂质组成，则使用49.5 mg POPC和0.69 mg DGS NTA-Ni。
- 使用旋转蒸发仪缓慢去除氯仿——无需升高温度至室温以上。也可在通风橱中用惰性气体（如氮气或氩气）气流吹除。在此过程中持续转动烧瓶，使干燥的脂质均匀沉积在圆底烧瓶下半部分。
- 当大部分氯仿蒸发后，将烧瓶连接至真空泵过夜，以彻底去除残留氯仿。
注意：此步骤至关重要，可避免后续步骤中蛋白质和细胞受到有毒氯仿污染，并确保脂双层的流动性。
- 由干燥脂质制备小单层囊泡（SUVs）
注意：小单层囊泡（SUVs）直径在20 nm至100 nm之间，可通过水浴超声法轻松制备。脂质挤出法是另一种替代方法，可生成SUVs，且根据挤出所用滤膜的孔径大小，也可生成大单层囊泡（LUVs），其尺寸范围为100 nm至1,000 nm。然而，SUVs最适合用于形成支撑脂双层（SLB）。- 通过水浴超声法制备SUVs（视频中展示）：
- 对PBS进行脱气处理。将干燥的脂质混合物用10 ml脱气PBS悬浮于250 ml圆底烧瓶中。
- 向烧瓶中通入惰性气体（如氮气或氩气），用塞子密封，并用高压灭菌胶带封口。
- 将密封的烧瓶放入水浴超声仪中，以120至170 W功率超声处理脂质悬浮液，直至溶液变澄清。此过程需30至60分钟。
- 通过分光光度法监测囊泡形成进程：测定未稀释乳液相对于PBS在234 nm处的吸光度应保持稳定（作为脂质浓度的近似指标），而在550 nm处应显著下降（因较大颗粒减少导致光散射降低）。
- 为去除干扰连续SLB形成的较重的非单层囊泡，将囊泡悬浮液在25 °C下以150,000 × g离心1小时，随后在4 °C下以288,000 × g离心8小时，收集沉淀。
- 将上清液通过孔径为0.2 µm的注射器滤器过滤。
- 测定234 nm和550 nm处的光密度（OD），以监测囊泡制备物的澄清度及残留脂质量。
- 将囊泡在4 °C下置于氩气或氮气环境中保存。可选：囊泡悬浮液可用于双层膜制备，保存数月。
- 通过脂质挤出法制备SUVs：
- 简要步骤：将脂质悬浮液多次通过孔径为0.1 µm的滤膜。无论采用何种制备方法，均需将囊泡悬浮液离心两次（第一次：1小时，150,000 × g，25 °C；第二次：8小时，288,000 × g，4 °C），以沉淀较重的非单层囊泡。
注意：在4 °C下惰性气体环境中储存时，囊泡可用于双层膜制备达数月之久。
- 简要步骤：将脂质悬浮液多次通过孔径为0.1 µm的滤膜。无论采用何种制备方法，均需将囊泡悬浮液离心两次（第一次：1小时，150,000 × g，25 °C；第二次：8小时，288,000 × g，4 °C），以沉淀较重的非单层囊泡。
- 通过水浴超声法制备SUVs（视频中展示）：
- SLB的形成及蛋白负载
- 用浓硫酸与30%过氧化氢按3:1比例配制的混合液处理24 × 50 mm的#1.5玻璃载片，处理30分钟。
注意：由于该混合液具有强腐蚀性，操作时需格外小心，例如穿戴实验服和护目镜，如视频所示！ - 用洗瓶中的去离子水（ddH2O）冲洗玻璃载片，并将其置于聚四氟乙烯（Teflon）支架上，干燥10至30分钟。
- 取下8孔或16孔腔室的底部玻璃片，在底部涂上环氧树脂胶，然后小心地将一块洁净干燥的玻璃载片放置于涂胶的腔室底部。让胶水固化约10分钟，并清除底部多余的胶。
注意：也可使用牙科用双组分硅胶印模膏在玻璃载片与腔室之间实现紧密密封，该材料在10至30分钟内固化。这种密封强度虽不及环氧树脂胶，但足以承受常规物理应力。实验结束后可轻松从腔室上移除，腔室可重复用于后续实验。 - 向8孔（或16孔）腔室（按上述方法制备）的每个孔中加入120 µl（或60 µl）经PBS稀释10倍的脂质悬浮液，静置20分钟以形成双层膜。随后用15 ml PBS小心冲洗双层膜两次。一旦双层膜形成，必须始终将其浸没在缓冲液中，不得暴露于空气中。
- 将每个孔加满PBS，然后移除330 µl（8孔板）或165 µl（16孔板），使孔中剩余350 µl（或175 µl）。向每孔加入50 µl（或25 µl）含His标签蛋白的混合液（用PBS稀释），最终体积为400 µl或200 µl，在避光条件下室温孵育60分钟。可通过调整此孵育步骤中的蛋白浓度来调节表面蛋白密度。
- 用15 ml PBS将每个孔冲洗两次。
注意：通常情况下，SLB在负载蛋白后不超过6小时应完成实验。在此期间，光漂白后的荧光恢复率可达95%，且未检测到与双层膜结合的蛋白损失。实验前应确定蛋白密度（见下文）。 - 可选步骤：为检测蛋白在含DGS NTA-Ni的SLB上的非特异性结合，可用含300 mM咪唑的PBS洗涤SLB一次，蛋白应完全脱落。
- 用浓硫酸与30%过氧化氢按3:1比例配制的混合液处理24 × 50 mm的#1.5玻璃载片，处理30分钟。
2. 显微镜设置
- 如需构建能够检测单个荧光染料荧光的显微镜系统，请参阅引言中所述的建议。
3. 功率测量
注意：荧光团容易因过量的激发光而饱和。这会加速光漂白，且不会进一步增加发射光，因此应避免这种情况。为了优化样品照明，应在样本处直接测量激发光功率密度。此类测量还可为后续实验提供参考依据。此外，在评估成像系统中光损失位置时，了解输入与输出激光功率之间的比例关系非常有帮助。
- 将激发光束移至直立位置，使其以90度角离开物镜° 角度。
- 将功率计探头置于光束上方，测量光束功率（=P），并记录结果。
- 使用潜望镜将光束转向TIRF位置，并对完整的均匀荧光双层膜进行成像。为避免荧光漂白和CCD信号饱和，需在激发光路中插入光学密度（OD）为2至3的中性密度（ND）滤光片。
- 测量整个照明区域的积分计数（= I总计）。同时，测量照明区域的大小（= A总计）。测量积分计数（= I中心最大照明中心光斑的光密度以及光斑的大小（= A）中心).
- 在照明区域外或不进行样品照明的情况下，测量每个像素的背景信号（=B）。
- 从第3步测得的结果中减去背景信号。具体方法是：将所关注区域（整个照明区域或中心光斑）的像素数量乘以每个像素的背景计数。（=I总计 - A总计 .B 和 I中心 - A中心 . B)。
- 将中心斑点的积分并经背景校正后的信号除以整个照明区域的积分并经背景校正后的信号。
注意：该结果表示位于中心光斑内的总功率所占比例（= (I中心 - A中心 .B) / (I总计 - A总计 B) 将此结果与步骤2中测得的功率P相乘，得到照射中心光斑的光功率。 - 确定斑点A的大小中心 在 µm²。为此，将相机像素尺寸除以 µm 除以物镜的放大倍数，将结果取平方作为 µm² 每像素
- 也可将微米尺载玻片置于显微镜下，通过图像中测量像素尺寸，并将该结果的平方作为每个像素所代表的面积。将此值乘以中心光斑内包含的像素数量，得到照明光斑的面积。
- 将照射中心光斑的功率 P 除以中心光斑的面积 A中心µm² 计算单位面积的光照强度 µm2一个示例如下所示 图6.
- 非TIRF照明下测得的功率密度值通常低于TIRF照明中的功率密度值 13，这也取决于激光光全反射时的确切角度。为了获得全内反射荧光（TIRF）照明条件下的光强密度，需对直径为0.1的校准荧光微珠进行成像µm 直径在非TIRF和TIRF模式下均保持一致。通过TIRF与非TIRF模式测得的微球荧光强度比值即为转换因子 C，这使得能够将测得的功率密度值转换为TIRF照明条件下的有效值（公式1）。
功率密度 全内反射荧光显微镜 = C • 功率密度 非TIRF （公式 1）
其中 C = 珠子强度 TIRF / 珠粒强度 非TIRF
4. 密度测量
- 测定位于双层膜上的单个荧光分子的平均信号。对于此目的而言，负载荧光肽的双层膜结合MHC分子是理想选择，因为蛋白质与标记物的化学计量比恰好为1。如有必要，可先漂白视野中双层膜上所有标记物，然后等待荧光恢复以观察单个荧光分子。
- 连续快速采集图像（例如采用流式采集模式），并在多个帧中监测单个分子的运动情况。更多详细信息请参见图7。
- 在双层膜内标记中心照明区域作为感兴趣区域（ROI）。测量该ROI内的照明功率密度变异程度（其与荧光强度成正比），理想情况下应小于15%。
- 仅在该ROI内测定单分子和整体荧光信号。积分一个足够大的ROI信号，以捕获单个发射源点扩散函数的99%或更多信号。当使用像素大小为 16–20 µm（见相机制造商规格说明）、物镜放大倍数为100倍、数值孔径等于或大于1.45的成像系统时，可选取一个7×7像素的区域，将强度峰值置于该正方形的中心。
- 为测定背景信号，积分一个不含荧光信号的相邻7×7像素区域的计数值。从单分子信号中减去背景信号，以获得经背景校正的单分子荧光值。仅选择在后续帧中仍可见的信号进行分析。
- 重复步骤4.2五十次至数百次。对背景校正后的信号取平均值。如需要，可将单分子荧光强度值绘制成直方图。可选：利用开源软件包（如ImageJ）中的合适插件，或使用商业软件（如Metamorph、Molecular Devices）处理数据。有经验的用户也可使用Matlab或类似软件自行编写分析程序。
- 在激发光路中插入一个密度为2或更高的中性密度滤光片，拍摄含有相同荧光标记蛋白的荧光双层膜图像。记录与单分子强度测量所用相同的ROI内的平均像素强度。记录整体荧光测量时的曝光时间。在无照明条件下测量同一位置，用于背景扣除。
- 为确定双层膜内的蛋白质密度，将步骤4中测得的经背景校正的整体荧光平均像素强度乘以每平方微米的像素数（例如41.5），再乘以100（若使用光密度为2的中性密度滤光片）或1000（若使用光密度为3的中性密度滤光片），再乘以步骤2中使用的曝光时间，然后除以步骤3中确定的平均单分子信号、步骤2中使用的曝光时间以及每个蛋白质所含的荧光分子数量。
5. 测试双层膜的完整性
- 制备荧光双层膜，并如上所述将其放置在显微镜载物台上。
- 调节焦距，在TIRF模式下拍摄双层膜的图像。在非TIRF模式下施加短暂但强烈的漂白脉冲，以消除小圆盘形ROI区域内的荧光。
- 漂白后立即在低强度TIRF模式下拍摄双层膜图像，随后每隔5到10秒拍摄一次，以监测荧光恢复的速度。
- 移动至双层膜上的另一区域，重复步骤2和3。在漂白脉冲后5 min 再次以低强度TIRF模式拍摄图像。测定漂白区域内的强度Ipost bleach，并与实验开始前未漂白时的强度I0进行比较（此时应无漂白发生），按以下公式计算不可移动组分（IF）：
不可移动组分 IF (%) = (I0 - Ipost bleach) / (I0 – 背景) × 100，
其中背景 = 在无激发光照射条件下测得的ROI内强度
IF 应小于10%（理想情况下小于5%）。
结果
单分子荧光显微镜系统的结构在图2中进行了相当详细的说明。各个部件，如光学元件和其他硬件组件，在引言部分已有解释。光学激发光路中用于产生全内反射荧光（TIRF）和非TIRF照明的路径在图3至图5中展示并加以说明。请注意位于第一对转像棱镜前的50:50分束器，该分束器置于一个可微米调节的平移台上（图5）。该分束器将用于成像的TIRF光束（以绿色表示）与用于漂白或局部孔径限定的光介导样品激活的非TIRF光束（以红色表示）叠加（如图3所示）。合并后的光路（图5中以橙色表示）经由第二对转像棱镜反射进入倒置显微镜的后端口。如图4所解释并如图2所示，使用两个或三个凸透镜可展宽激光束的光束轮廓，并将激光束聚焦到物镜的后焦平面，从而产生两束准直光束，分别用于TIRF和非TIRF方式照射样品。
用于计算样品上光功率密度的测量光强值示例如图6所示。需从被激光照射区域及中心成像区域测得的光强中扣除的平均背景信号，通过视野中未被激光束照射的区域确定（此处为7089计数）。经背景校正后，照射区域（1684计数）和中心区域（4830计数）的平均光强分别乘以相应区域面积，得到积分光强（照射区域为1.471 × 108计数，中心区域为3.424 × 107计数）。中心区域与照射区域的积分光强之比即为照射到中心区域的总功率所占比例（0.23 或 23%）。如视频所示，总功率需在非全内反射荧光（TIRF）照明模式下，使用功率计在物镜处测定。在本示例中，总功率被调节至5 mW，因此中心区域的光功率为5 mW × 0.23 = 1.15 mW。由于在本示例中41.5像素对应1 µm2，中心区域面积为7089像素 / 41.5像素/µm2 = 170.8 µm2。将照射到中心区域的光功率（1.15 mW）除以该面积（170.8 µm2），可得中心区域的平均功率密度为0.7 kW/cm2。
图7展示了连续快速采集的单个荧光分子图像及其相应的强度结果（每秒100帧，即时间间隔为10毫秒）。为进行强度定量，选取一个7×7（=49）像素的矩形区域覆盖荧光信号，计算其平均信号值。此外，在单分子信号附近选取另一个7×7像素的矩形区域，用于测定背景平均信号。将扣除背景后的平均信号乘以该区域内的像素数量（=49），得到单分子信号（以粗体标出）。
一个典型的荧光漂白后恢复（FRAP）实验用于评估与支持性脂双层（SLB）结合的荧光标记蛋白的流动性，如图8所示。注意在图8A中，使用了一束较宽且低强度的成像光反复扫描，而在零秒时间点仅使用一次更窄、由孔径定义的高强度光束，以快速淬灭荧光染料。图中黄色圆圈区域内经背景扣除后的平均荧光强度，已通过漂白前的初始平均强度值进行归一化处理，其结果在图8B中随时间变化绘制，以记录荧光恢复的速度和程度。如图所示，在荧光染料被淬灭后75秒内，超过90%（以绿色线表示）的初始双层荧光强度得以恢复。因此，该SLB中嵌入的蛋白仅有不到10%为不可移动状态。
图1. SLB系统的示意图。(A) SLB由POPC（90–99%）和合成脂质DGS NTA-Ni（1–10%）组成。当清洁的玻璃表面与含有相应脂质的小单层囊泡（SUV）接触时，SLB可自发形成。(B) 形成后，这些SLB可方便地结合可溶性蛋白，这些蛋白在其C端或N端带有一个含12个组氨酸的标签（12H，例如共刺激分子B7-1和黏附分子ICAM-1），或结合带有两个各含6个组氨酸标签的蛋白二聚体（2×6H，例如αβMHC II类分子二聚体）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 激发与发射光路的示意图。 气体离子激光器（例如 Ar+ 或 Kr+）可通过声光调制器实现快速开关。目前，激光二极管已可在多种波长下获得，并且由于其可在微秒量级上进行电子调制，因此成为一种极佳的替代选择。需注意的是，激光光束可通过两个（二向色）反射镜进行调节，并利用简单的分束器进行分束与合束，从而形成两条或多条光路。在此示例中，使用了一条TIRF成像光路（用于监测事件）和一条漂白光路（用于以孔径定义的方式漂白荧光染料或光激活笼锁分子）。两条激发光路可通过额外的快门独立控制。潜望镜结构可用于在物镜的后焦平面内移动聚焦的激光光束，从而在样品上实现全内反射荧光（TIRF）照明。荧光图像可在使用超灵敏相机（例如 EM-CCD 或科学级 CMOS 相机）采集前，通过发射分束器进行光谱分离。请点击此处查看此图的放大版本。
图 3. 通过在物镜的后焦面内平移聚焦光束来调节 TIRF 照明。 如图所示，通过移动光束（使用潜望镜式反射镜装置），将激光束的焦点从物镜后焦面的中心位置移向边缘。结果导致出射物镜的光束以倾斜照明方式传播，直至达到发生全内反射的临界角。在玻璃-介质界面处，全反射的发生位置即产生渐逝场。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 将激光束聚焦至物镜后焦平面的简易光学系统。 为展宽激光束并将其聚焦至 TIRF 物镜的后焦平面，需使用三片或两片透镜。相较于三透镜系统，双透镜系统的透镜相关误差更少，可能更适用于生成 TIRF 成像光束。然而，在需要实现特定激光束展宽并获得边缘清晰照明光斑的情况下（例如采用光激活或光漂白技术的研究），三透镜系统可能更为合适。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 荧光显微镜后端光路的标注照片。 如图 2中已概述，可轻松引入两束激发光，一束用于TIRF模式（以绿色表示），另一束用于非TIRF模式（以红色表示）。通过使用50:50分束器（BS）将两束光叠加。在各自的光路中放置凸透镜（L1 和 L2），以将光束聚焦到物镜的后焦平面（图中未显示）。由两个反射镜（M1 和 M2）组成的潜望镜系统将两束光引导通过显微镜的入射端口。第一个反射镜（M1）可通过平移台（TS）移动（通过旋转如图所示的千分尺螺丝），从而将其中一束光调整至TIRF位置。一旦建立TIRF条件，第二束光（用于光漂白或光激活，此处以红色表示）便可独立于TIRF光束进行调节，使其以非TIRF模式离开物镜。请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 测量照明光斑中心区域内的光功率。 如图所示，选择适当的感兴趣区域，分别代表背景、整个照明区域（IA）以及中心区域（CA），后续事件将在中心区域记录。从IA和CA记录的数值中减去背景值，并通过将校正后的平均强度乘以各区域内包含的像素数量，得到积分强度。将CA的积分强度除以IA的积分强度，得到照射到CA的光束功率比例（本示例中为23%）。将总光束功率（此处为5 mW）乘以照射到CA的比例（此处为0.23），即可确定照射到CA的光功率。为确定中心区域的面积，将像素数量（此处为7089像素）乘以像素与面积的换算系数（此处为1/41.5 µm2 pixel-1）。为获得照射到CA的激发光的平均功率密度，将光功率（此处为1.15 mW）除以CA的面积（此处为170.8 µm2）。请点击此处查看此图的放大版本。
图7. 单分子信号的定量分析。 (A) SLB上单个荧光分子的时间过程。在信号周围放置一个7×7像素大小的兴趣区域（roi，黄色），用于定量分析。背景值由邻近的7×7像素兴趣区域（绿色）确定。(B) 列出经定量分析得到的平均像素强度。为确定单分子信号，需将信号值（黄色roi）减去背景值（绿色roi），再乘以49。(C) 一个荧光分子的单分子强度随时间变化的曲线图。注意，90毫秒的时间点被省略，因为此时荧光分子正处于漂白过程中。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8. 利用光漂白后荧光恢复（FRAP）分析确定支持脂双层（SLB）的完整性。（A） 对携带 IEk/MCC-Alexa Fluor 647 的脂双层进行 FRAP 实验。图中显示了实验中每第10帧的图像。（B） 展示于（A）中的实验的 FRAP 定量分析结果。数值表示（A）中黄色 ROI 区域内的平均荧光强度（I）除以光漂白前的初始强度（Io）。红色数据点对应于（A）中所示的图像，绿色线条表示原始荧光强度恢复至0.9倍的水平。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
单分子显微技术为研究蛋白质在其天然细胞环境中的行为提供了独特的机会。因此，分子成像技术正日益受到广大科学界的关注，然而许多生命科学研究人员仍对初期所需的技术投入和专业知识望而却步。自行搭建成像系统的主要优势在于，它能够根据使用者的特定需求进行便捷的调整和优化。
如文中所述，若需要快速且精确地对荧光团和配体进行光漂白（或光激活），例如在进行荧光漂白恢复（FRAP）或配体解笼实验时14，可在现有的全内反射荧光（TIRF）光路基础上，轻松引入非TIRF激发光路。引入发射光路分光器后，可同时记录至少两个，某些情况下甚至多达四个荧光通道。这些扩展应用的可能性实际上仅受限于研究者的想象力。
例如，在发射光路中集成电动发射滤光轮，可实现最多十个不同荧光通道之间的快速切换。当将两个电动发射滤光轮（每个配备10个滤光片位）串联使用时，最多可读取18个荧光通道。通过整合氙灯或汞灯激发光源，全内反射荧光（TIRF）成像可进一步结合钙离子动员检测和干涉反射显微镜（IRM）技术。IRM是用于观察细胞与玻璃表面或支撑脂双层（SLB）之间贴附程度的首选方法，因此在解读基于TIRF的成像数据时可提供关键信息。利用简单的二向色镜并引入405 nm的附加激光，扩展激发光束，即可开展光激活定位显微镜（PALM）或随机光学重建显微镜（STORM）实验，这两种均为超越可见光衍射极限的超分辨率成像技术，其定位精度可达衍射极限以下15,16。
然而，实验成功不仅仅取决于合适的硬件设备。为了充分利用降低噪声的基于全内反射荧光（TIRF）的成像技术，细胞与表面的接触方式应避免对细胞表面施加限制，或干扰其质膜的生理状态。通过适当蛋白功能化修饰以促进细胞黏附的支撑脂双层（SLB）非常适用于此目的，因为所有嵌入SLB中的配体均具有侧向流动性，能够根据受体结合及分隔动力学在双层膜内调整其侧向位置。
为了以可重复的方式制备支持性脂双层（SLB），最好从高纯度的小单层囊泡（SUV）开始。如本文所述，关键步骤是通过两次超速离心去除在超声处理过程中同时产生的多层囊泡，因为这些多层囊泡会干扰具有高流动性的连续SLB的形成。高质量的SLB只能在洁净的玻璃表面形成。清洁后的玻片应立即使用，或保存在真空环境中。重要的是，SLB绝不能暴露于空气中，否则会导致其结构破坏。SLB的洗涤过程如图所示，使用移液管进行缓冲液冲洗，这种方法不仅安全，而且节省时间。
在收获和纯化SLB结合蛋白时，应避免使用去污剂。因为即使痕量的去污剂也会显著降低蛋白质的流动性。为完全避免使用去污剂，建议在哺乳动物或昆虫细胞中可溶性表达带有分泌型多聚组氨酸标签的配体。如果需要从大肠杆菌包涵体中进行复性，则必须谨慎操作，确保在包涵体变性和复性之前有效去除其中的去污剂。
使用支持性脂双层（SLB）的一个主要优势在于其模块化和可重构的特性，这使得研究人员能够特异性地解析特定受体-配体相互作用在细胞活化和细胞黏附中的作用。需要特别指出的是，DGS NTA-Ni 在 SLB 中的含量应保持在 10%，以防止蛋白质之间竞争 NTA-Ni 结合位点。当使用的 SLB 中仅含有 1% 或 2% 的 DGS NTA-Ni 时，可观察到某种特定多聚组氨酸标签蛋白的结合量减少，尤其是在共孵育越来越多的第二种多聚组氨酸标签蛋白的情况下（未发表观察结果）。而使用含有 10% DGS NTA-Ni 的 SLB 时则不会出现这一现象。
尽管我们从未观察到任何测试过的带有多聚组氨酸标签的蛋白质与含有DGS-NTA-Ni的支撑脂双层（SLB）发生非特异性结合，但在首次引入新蛋白质时仍应验证这一可能性。为此，我们建议使用不含DGS-NTA-Ni的SLB进行对照实验（此时蛋白质不应发生结合）。其次，在使用含有DGS-NTA-Ni的SLB时，用含300 mM咪唑的PBS缓冲液洗涤SLB后，蛋白质应被完全洗脱。
使用支持性脂双层（SLB）的另一个显著优势是，能够以更高的时空分辨率监测瞬时相互作用和信号事件17-19。这至少部分归因于三维结合过程实际上被简化为二维成像维度，尤其是在使用降低噪声的全内反射荧光（TIRF）模式记录时。SLB的应用与单分子信号检测兼容，这是光激活定位显微技术（PALM）或随机光学重建显微技术（STORM）——即分辨率低于衍射极限的超分辨率显微技术——所必需的前提条件15,16。这些特殊的成像模式使得单分子荧光共振能量转移（FRET）实验成为可能，可用于可视化突触环境中单个蛋白质-蛋白质相互作用20。该方法在JoVE发表的一篇题为“利用基于FRET的显微分析技术测量TCR-pMHC结合”的文章中有详尽阐述21。
在解释基于SLB的实验时，应始终牢记SLB并不具备活细胞质膜的全部特性，某些缺失的特性可能会影响所研究的生理过程。毕竟，SLB中嵌入的蛋白质是自由扩散的，不像大多数细胞中的对应蛋白那样被组织在膜微区中5,6,22。来源于贴壁细胞的固定化质膜片层在一定程度上保留了活细胞质膜的结构，已被成功用于研究B淋巴细胞对膜嵌入抗原的摄取过程23。然而，即使是这类膜也无法与高度动态的细胞骨架相互作用，并且由于其支撑于刚性玻璃表面，缺乏柔韧性。鉴于这些差异，显然有必要对SLB进行工程化改造，使其能够以明确的方式实现蛋白质的区室化，并由可调节柔韧性的表面支撑，或由能响应局部光脉冲而改变刚度的表面支撑。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
M.A. 受奥地利科学基金会（FWF, J3086-B11）的薛定谔奖学金资助，并感谢马克斯·普朗克学会提供的资金和行政支持。G.S. 受维也纳科学与技术基金（WWTF, LS13-030）资助。J.H. 受维也纳科学与技术基金（WWTF, LS14-031）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1.5 玻璃载片 | VWR | 631-0853 | |
| 250 ml 圆底烧瓶 | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 分束立方体 | Thorlabs | BS013 | |
| 声光调制器 C1205-2 | Isomet | - | 仅在使用无法调制的连续波激光器时需要 |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| 高压灭菌胶带 | VWR | 489-1312 | 或任何其他耐高温粘性胶带 |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | 可替代浴式超声仪 |
| 浴式超声仪 QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| 分束器 | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi 旋转蒸发仪 | VWR | 531-0837 | |
| 相机 | Andor | iXon Ultra 897 | 替代型号见正文 |
| 浓过氧化氢 | Roth | 9683.1 | |
| 浓硫酸 | Roth | X944.2 | |
| 环氧胶 | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| 滤光轮 | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek 培养腔室 | VWR | 734-2062 | |
| 激光器 | Toptica | - | 提供多种不同波长（375–785 nm）的型号 |
| 透镜 | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni（脂质） | Avanti Lipids | 790404C | 推荐使用已溶于氯仿的镍盐形式产品 |
| POPC（脂质） | Avanti Lipids | 850457C | 推荐使用已溶于氯仿的供货形式 |
| 显微镜 Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| 反射镜 | Thorlabs | BB1-E02 | |
| 光学滤光片 | AHF, Chroma, Semrock | - | 针对多种染料组合均有配套滤光片组可供选择 |
| 示波器 | BK Precision | 2120C | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life technologies | 14190-136 | 使用前需脱气 |
| 潜望镜组件 | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | 可替代环氧胶 |
| 激光功率计 Lasermate-Q | Coherent | - | 任何在所用光谱范围内具有灵敏度的功率计均可使用 |
| 脉冲发生器 | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| 空间滤波器 | Thorlabs | KT310/M | |
| 注射器滤器 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| 可用于全内反射荧光（TIRF）的复消色差物镜 100倍，数值孔径 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| 三氯甲烷/氯仿 | Roth | 3313.1 | |
| 超速离心管 聚碳酸酯材质 1.00 mm，11 mm × 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall 超速离心机 | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| 超速离心机转子 | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| 紫外分光光度计 Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| 真空泵 | VWR | 181-0248 |
参考文献
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