利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

摘要

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。

摘要

近年来，诱导多能干细胞（iPSCs）作为一种用于再生治疗的新型细胞来源，受到了广泛关注。尽管最初生成iPSCs的方法依赖于通过侵入性活检获取的皮肤成纤维细胞，并采用逆转录病毒将外源基因插入基因组，但人们已做出诸多努力以克服这些缺点。人类外周血T细胞是生成iPSCs的一种独特细胞来源。由T细胞衍生的iPSCs含有T细胞受体（TCR）基因的重排，可作为抗原特异性T细胞的来源。此外，基因组中T细胞受体的重排还具有标记单个细胞系的潜力，可用于区分移植细胞与供体细胞。为了iPSCs在临床中的安全应用，重要的是尽量降低新生成的iPSCs暴露于有害物质的风险。尽管胎牛血清和饲养层细胞在多能干细胞培养中曾是必需成分，但为了降低不可预知致病性的风险，最好将其从培养体系中去除。为解决这一问题，我们建立了一种利用仙台病毒从人类外周血T细胞生成iPSCs的方案，以减少iPSCs暴露于未明病原体的风险。尽管操作仙台病毒需要具备相应生物安全等级的设备，但该病毒可在不插入基因组的情况下高效感染活化的T细胞。在本方案中，我们展示了在无饲养层条件下，结合活化T细胞培养与仙台病毒感染，从人类外周血T细胞生成iPSCs的方法。

引言

诱导多能干细胞（iPSCs）作为一种革命性的细胞来源，在再生医学领域已引起广泛关注^1-3。迄今为止，已有多种生成iPSCs的方法被报道^4,5。其中，由人T细胞生成的iPSCs尤其受到关注，因其细胞取样方法具有较低的侵入性^6-8。此外，来源于T细胞的iPSCs含有T细胞受体（TCR）基因的重排，因此可作为抗原特异性T细胞的来源^9,10。因此，安全地生成T细胞来源的iPSCs对于推动再生医学的发展具有重要意义。

该方法基于降低不可预测致病性风险的理念。为了确保诱导多能干细胞（iPSCs）在临床应用中的安全性，降低暴露于病原体的风险至关重要¹¹。此前，在许多多能干细胞培养体系中，胎牛血清和饲养层细胞常被用作必需试剂¹²。然而，为了降低不可预测的致病性风险，在iPSC的制备过程中，最好从培养体系中去除这两种试剂。

此外，该方法具有避免对患者进行侵入性细胞取样以及繁琐的饲养细胞制备的优点。由于T细胞来源的诱导多能干细胞已成功应用于疾病研究^13,14，该方法同样适用于从患者体内生成疾病特异性的诱导多能干细胞，具有重要应用价值。

在T细胞重编程方法中，使用仙台病毒（SeV）载体作为基因载体是一种能够高效生成诱导多能干细胞（iPSCs）的方法^7,16。此外，由于SeV是一种单链RNA病毒，其复制过程无需DNA中间阶段，因此在iPSCs的生成过程中使用SeV可避免对宿主基因组造成断裂^17-19。因此，我们已建立了在无血清、无饲养层条件下，利用基质胶（matrigel）、mTeSR培养基和SeV载体联合应用，从人外周血T细胞生成iPSCs的技术方案。

方案

1. 准备活化的人类T细胞

1. 通过静脉穿刺从供体采集 10 ml 肝素抗凝全血。
   1. 在静脉穿刺前须事先获得供体的知情同意。静脉穿刺必须由具备资质且经过培训的专业人员操作。
   2. 使用无菌设备处理所采集的血液样本，并遵循适当的生物安全指南。
2. 用 10 ml D-PBS(–) 稀释 10 ml 肝素抗凝全血。
3. 将 15 ml Ficoll 溶液（Ficoll-Paque PREMIUM）加入一个新的 50 ml 锥形管中。
4. 将步骤 1.2 中制备的 20 ml 血液溶液小心地铺加到步骤 1.3 中的 Ficoll 溶液上层。使用电动移液器，使步骤 1.2 中制备的血液溶液沿管内壁缓慢流下。注意避免血液溶液与 Ficoll 溶液混合。
5. 在室温下以 400 × g 离心 30 分钟。将离心机的减速速度设置为“慢速”。
   注意：离心后，在上层乳白色血浆层与下层透明 Ficoll 层之间会出现一层白色薄层。该白色薄层含有单个核细胞。
6. 用 1 ml 移液器将单个核细胞层转移至一个新的 50 ml 锥形管中。注意不要混入 Ficoll 溶液。
7. 向单个核细胞中加入 D-PBS(–)，使总体积达到 10 ml，然后在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
8. 弃去上清液。向单个核细胞中加入 10 ml D-PBS(–)，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
9. 弃去上清液，向收集的单个核细胞中加入 1 ml KBM502 培养基，使用血细胞计数板进行细胞计数。通过适当的 Ficoll 分离方法，从 10 ml 肝素抗凝全血中可获得超过 5 × 10⁶ 个单个核细胞。
10. 用 D-PBS(–) 配制浓度为 10 µg/ml 的抗人 CD3 抗体溶液。将抗人 CD3 抗体溶液加入 6 孔板中，润湿每孔表面，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育至少 30 分钟。
11. 在接种细胞前，从各孔中移除抗人 CD3 抗体溶液，并用 D-PBS(–) 洗涤一次。
12. 将步骤 1.9 中制备的单个核细胞以 2.5 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度接种于涂有抗人 CD3 抗体的 6 孔板中，使用 KBM502 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 3–7 天，期间不更换培养基，直至 T 细胞达到汇合状态。此阶段的 T 细胞既有悬浮细胞，也有贴壁细胞。

2. 使用 SeV 载体感染人 T 细胞

1. 培养3–7天后，用移液管吸取含有活化T细胞的培养基，转移至15 ml锥形离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。
2. 弃去上清液，加入1 ml新鲜KBM502培养基。计数细胞后，将1.5 × 10⁶个细胞（溶于2 ml新鲜KBM502培养基中）接种至已包被抗CD3抗体的6孔板的每个孔中。
3. 将含有OCT3/4-SeV/TSΔF、SOX2-SeV/TSΔF、KLF4-SeV/TSΔF和c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF的SeV溶液置于冰上解冻。
4. 分别将含有OCT3/4-SeV/TSΔF、SOX2-SeV/TSΔF、KLF4-SeV/TSΔF和c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF的SeV溶液加入各孔，每种病毒的感染复数（MOI）为10。在37 °C、5% CO₂培养箱中继续孵育24小时。

3. 从人T细胞中去除SeV载体

1. 感染后24小时，用移液器收集感染的细胞。如果有贴壁细胞，可通过反复吹打轻松解离。将细胞转移至15 ml锥形管中，在室温下以200 × g离心5分钟。
2. 弃去含有SeV载体的上清液，加入2 ml新鲜的KBM502培养基。将细胞重新接种至各孔中，在37 °C、5% CO₂培养箱中继续孵育24小时。

4. 在 Matrigel 层上重新接种细胞

1. 通过在 4 °C 下解冻基底膜基质凝胶（具体品牌请参见材料列表），并将 0.2 ml 溶解于 10 ml DMEM/F12 培养基中，制备基底膜基质溶液。
   注意：基质凝胶（具体品牌请参见材料列表）需在 4 °C 下过夜解冻以确保完全融化。使用前应始终保持在冰上。
2. 每皿加入 5 ml 基底膜基质溶液至 100-mm 培养皿中，在接种细胞前于室温放置至少 30 分钟。每个实验至少需要两个 100-mm 培养皿。
3. 用移液器收集 SeV 感染的细胞，转移至 15-ml 圆锥形离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，加入 1 ml 新鲜的 KBM502 培养基。使用血细胞计数板计数细胞数量，移除步骤 4.2 中准备好的 100-mm 培养皿中的基底膜基质溶液，并将 1 × 10⁵ 和 1 × 10⁶ 个细胞（溶于 10 ml 新鲜 mTeSR 培养基中）接种到涂有基底膜基质的 100-mm 培养皿上。最后，选择克隆易于挑取的培养皿进行后续操作。
5. 将培养皿置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中过夜培养。
6. 每隔一天更换一次 10 ml 新鲜 mTeSR 培养基。
   注意：感染后约 20–30 天，将出现形态上与胚胎干细胞（ESCs）非常相似的克隆。

5. 扩增T细胞来源的iPSCs

1. 通过在 4 °C 下解冻基底膜基质凝胶（有关本研究中使用的具体品牌，请参见材料列表），并将其 0.2 ml 溶解于 10 ml DMEM/F12 培养基中，制备基底膜基质溶液。
2. 在 6 孔板中每孔加入 1 ml 基底膜基质溶液，在室温下放置至少 30 分钟，然后进行克隆挑选。
3. 在 96 孔板中每孔加入 20 µl mTeSR 培养基。
4. 在体视显微镜下使用 20 µl 移液器挑选形态类似于胚胎干细胞（ESC）的克隆。
   注意：胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）的克隆呈圆形且扁平，如图 1B所示。
5. 将挑选出的克隆转移至第 5.3 步中已加入 mTeSR 培养基的 96 孔板中。
6. 每孔加入 200 µl mTeSR 培养基，使用 200 µl 移液器在体视显微镜下轻柔地上下吹打，使克隆分散成小团块。吸去第 5.2 步中准备好的孔内的基底膜基质溶液，将每个克隆分别放入经基底膜基质包被的 6 孔板的一个孔中，每孔加入 2 ml mTeSR 培养基。
7. 每隔一天更换为 2 ml 新鲜的 mTeSR 培养基。

6. 维持T细胞来源的iPSCs

T细胞来源的诱导多能干细胞可以采用与人类诱导多能干细胞和人类胚胎干细胞相同的技术进行维持和保存。一旦诱导多能干细胞集落生长至足够大小，可通过重复相同操作步骤将其扩增至更大的培养皿中。

1. 每1–2天更换一次mTeSR培养基。
2. 当细胞集落生长至融合状态时，每5–7天根据生产商说明书，使用人iPSC和hESC解离溶液对细胞进行传代。

结果

通过本方案，使用者能够稳定地从人外周血T细胞生成诱导多能干细胞（iPSCs）。在不同供体样本中，使用仙台病毒（SeV）和基质胶（matrigel）从T细胞诱导生成iPSC的重编程效率约为0.002%–0.005%，且经过数次传代后已检测不到仙台病毒的存在¹⁶。图1A展示了在无饲养层条件下，利用基质胶和mTeSR培养基生成T细胞来源iPSC的实验流程示意图。感染仙台病毒约20–30天后，可观察到具有胚胎干细胞样形态的iPSC克隆（图1B）。免疫荧光染色显示，在无饲养层条件下生成的T细胞来源iPSC表达典型的多能性细胞标志物（NANOG、OCT3/4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81）（图1C）。

图1. （A）：本研究中在无饲养层条件下重编程T细胞的实验流程示意图。（B）：采血后第27天，在无饲养层条件下获得的典型类似胚胎干细胞（ESC）形态的诱导多能干细胞（iPSC）克隆。（C）：在无饲养层条件下生成的T细胞来源iPSC的碱性磷酸酶（ALP）染色及多能性与表面标志物免疫荧光染色结果（NANOG、OCT3/4、SSEA4、TRA-1-60 和 TRA-1-81）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

我们描述了一种在无血清且无饲养层的条件下，利用基质胶（matrigel）、mTeSR培养基和SeV载体组合，从人外周血T细胞生成诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。对于iPSCs的临床应用而言，建立一种能够稳定生成iPSCs的方案以及采用创伤更小的细胞取样方法至关重要。尽管使用基质胶与mTeSR培养基组合生成iPSCs的重编程效率低于使用敲除血清替代物（KSR）培养基和饲养细胞的方法，但该组合能够实现从供体稳定生成iPSCs¹⁶。稳定的iPSCs生成结合低侵入性的细胞取样方法，其优势在于可扩大可用于iPSCs制备的供体数量。

SeV 载体是一种负链 RNA 病毒，不会整合到宿主基因组中。因此，在重编程因子诱导阶段即可避免致瘤风险^20-24。此外，无饲养层条件采用成分明确的培养基与基质胶（matrigel）组合，替代传统饲养层，从而可最大限度地降低暴露于未知外源因子的潜在风险。这些技术的结合为再生医学提供了侵入性更小、更安全的诱导多能干细胞（iPSC）技术¹⁶。

本方案中的关键步骤包括激活人T细胞（步骤1）以及用SeV载体感染T细胞（步骤2）。若在SeV感染后的最佳观察时间未获得ESC样克隆，应考虑以下因素。首先，T细胞激活前单个核细胞的汇合度可能不适宜，因为T细胞的有效激活对SeV感染至关重要^25,26。单个核细胞密度过高会导致细胞死亡，从而干扰T细胞的正常激活；密度过低也会妨碍T细胞的正常激活与增殖。因此，应检查并相应调整单个核细胞的汇合度。其次，SeV载体的剂量可能不足。诱导iPSC克隆的效率依赖于病毒剂量⁶。若SeV感染后未观察到ESC样克隆，可考虑将病毒剂量增加至MOI为15–20。若观察到iPSC克隆出现分化迹象，可增加换液频率，至每隔一天一次，或在克隆较大时每天换液一次。

本方案的局限性在于该方法并非无病毒体系。尽管用于细胞重编程的仙台病毒（SeV）可方便地从商业途径获得，但使用者需要根据相应的生物安全等级准备设备。作为另一种生成无整合型诱导多能干细胞（iPSCs）的方法，目前一直使用附加体型载体^27-29。尽管附加体型载体可在生物安全等级较低的设备中使用，但其仍可能以极低频率插入宿主基因组。因此，与使用SeV时相同，需要额外检测以确认转基因的完全消失。

另一个局限性在于，该技术并非完全不含动物来源成分。某些基质材料，如基质胶（matrigel）、抗CD3单克隆抗体（anti-CD3 mAb）、解离溶液和SeV溶液均来源于动物制品，因此存在传播异种病原体的风险。然而，由于风险较低，减少培养体系中动物来源成分对于iPSC技术的临床应用具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-02
纯化型 NA/LE 小鼠抗人 CD3 抗体	BD Pharmingen	555336
牛血清白蛋白 V 型溶液	Gibco	15260-037
mTeSR1 培养基试剂盒	STEM CELL	5850	使用前于室温预热
解离溶液	ReproCELL	RCHETP002
D-PBS(–)	Wako	045-29795
SeV 载体试剂盒 CytoTune-iPS ver.1.0	DNAVEC	DV-0303c	使用前冰上解冻
100 mm 组织培养皿	Falcon	353003
96 孔组织培养板	Falcon	353078
6 孔组织培养板	Falcon	353046
15 ml 离心管	Greiner Bio-One	188271
50 ml 离心管	Greiner Bio-One	227261