肺动脉高压啮齿类动物模型的血流动力学表征

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种累及肺小动脉的疾病，可导致肺小动脉闭塞并引发右心室衰竭。啮齿类动物PAH模型对于理解PAH的病理生理机制至关重要。本文展示了在小鼠和大鼠中通过右心导管术和超声心动图进行血流动力学表征的方法。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种罕见的肺血管疾病，其特征是内皮细胞凋亡、平滑肌细胞增殖以及肺小动脉的闭塞。这继而导致右心室（RV）功能衰竭，并伴有显著的发病率和死亡率。小鼠和大鼠的肺动脉高压动物模型对于理解该罕见疾病的病理生理机制具有重要意义。值得注意的是，不同的肺动脉高压模型可能伴随不同程度的肺动脉高压、右心室肥厚以及右心室功能衰竭。因此，对肺动脉高压小鼠和大鼠进行全面的血流动力学表征，对于评估药物或基因修饰对疾病的影响至关重要。

本文展示了在大鼠和小鼠肺动脉高压（PAH）模型中评估右心室功能及血流动力学的标准操作流程。超声心动图可用于评估大鼠的右心室（RV）功能，但在清醒小鼠中获取标准的右心室切面较为困难。经胸腔内颈静脉入路可实现对闭胸状态下的小鼠和大鼠进行右心导管检查。压力测量可采用连接液体压力传感器的聚乙烯导管或微型压阻式导管。压力-容积环分析可在开胸条件下进行。完成血流动力学测量后，处死实验动物。随后可将心脏解剖，分离右心室游离壁与左心室（LV）及室间隔（S），以便通过Fulton指数（RV/(LV+S)）评估右心室肥厚程度。之后可根据需要采集心脏、肺脏及其他组织样本用于后续分析。

引言

肺动脉高压（PAH）是一种累及肺血管的疾病，其特征为炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖以及内皮细胞凋亡。这些改变导致肺小动脉闭塞，进而引起右心室（RV）功能障碍和心力衰竭。为了深入理解PAH及其右心室衰竭的病理生理机制，研究人员已开发出多种不同的研究模型，包括遗传性和药理学模型（其他文献已有综述^1,2）。

在这些模型中，最常用的是小鼠低氧诱导型肺动脉高压（Hx）模型，以及大鼠的野百合碱（MCT）模型和SU5416-低氧（SuHx）模型。在小鼠Hx模型中，小鼠暴露于4周的低氧环境（常压或减压性低氧，相当于海拔18,000英尺，FiO₂为0.10），导致肺动脉中膜增生、右心室收缩压升高以及右心室肥厚的形成³。单次给予60 mg/kg剂量的MCT可通过尚不明确的机制损伤肺血管内皮细胞，进而引发肺动脉高压⁴。SU5416是一种血管内皮生长因子受体（VEGFR）1和2的抑制剂，单次皮下注射60 mg/kg后，再持续暴露于低氧环境3周，可导致不可逆的肺动脉高压，并出现与人类疾病相似的病理改变，包括闭塞性血管病变的形成⁵。近年来，已开发出多种肺动脉高压的转基因小鼠模型，其中包括骨形态发生蛋白受体2（BMPR2）基因的敲除和突变模型，因为BMPR2基因突变在家族性和特发性肺动脉高压中均有发现，此外还包括血红素加氧酶-1基因敲除和IL-6过表达模型（其他文献已有综述^1,2）。

这些不同的啮齿类动物肺动脉高压（PH）模型在肺动脉高压程度、右心室肥厚和右心室功能衰竭方面各不相同。尽管低氧模型及各种转基因小鼠模型所诱导的肺动脉高压（PAH）程度远轻于任一鼠类模型¹，但其可用于检测不同基因突变及其相关的分子信号通路。MCT模型可导致严重的PAH，但MCT似乎对多种组织中的内皮细胞具有毒性⁴。SuHx模型的特征是血管改变更类似于人类特发性PAH，但需要同时进行药物干预和低氧暴露。此外，在所有这些模型中，组织病理学改变、肺动脉压力与右心室功能之间的关系在PAH发展过程中可能存在脱节。这与人类疾病形成对比，在人类疾病中，组织病理学改变、肺动脉高压严重程度与右心室功能衰竭程度之间通常存在相应的比例关系。因此，必须对这些PH啮齿类动物模型进行全面表征，包括对右心室功能（通常通过超声心动图）、血流动力学（通过心脏导管术）以及心肺组织病理学（通过组织取材）的评估。

在本实验方案中，我们描述了用于大鼠和小鼠肺动脉高压（PAH）模型血流动力学表征的基本技术。这些通用技术可应用于任何关于右心室和肺血管的研究，并不仅限于PAH模型。通过超声心动图对右心室（RV）进行可视化观察在大鼠中相对简单，但由于小鼠体型较小且右心室几何结构复杂，该操作在小鼠中更具挑战性。此外，一些用于量化右心室功能的替代指标，如三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）、肺动脉（PA）加速时间以及肺动脉多普勒波形切迹，在人体中的有效性尚未充分验证，且与侵入性血流动力学评估肺动脉高压及右心室功能的相关性较弱。右心室血流动力学的测定最好采用闭胸方式进行，以维持吸气时胸腔内负压的影响；尽管如此，开胸状态下使用阻抗导管进行导管插入可获得压力-容积（PV）环，从而实现更详细的血流动力学表征。与任何实验操作一样，熟练掌握这些操作技术对于实验成功至关重要。

方案

所有操作步骤均遵循杜克大学医学院的动物护理指南。

1. 实验开始前的准备

注意：在进行任何动物实验操作之前，必须确保已获得相应的机构许可。与所有实验操作一样，应使用适当的镇痛药物，以确保动物不会遭受痛苦。

1. 使用肝素化无菌生理盐水（100 U/ml）冲洗导管，以确保导管通畅。从导管尖端标记出相当于从心脏至颈部中点长度的距离（大鼠约4 cm，小鼠约2 cm）。
2. 对小鼠或大鼠进行麻醉。可选的麻醉剂包括异氟烷（诱导浓度3-4%，维持浓度1.5%，与100%氧气混合使用）、氯胺酮/赛拉嗪（80-120/10 mg/kg）和戊巴比妥钠（40-80 mg/kg）⁶。
   1. 例如，使用氯胺酮:赛拉嗪（小鼠腹腔注射80-120 mg/kg:10-16 mg/kg，大鼠腹腔注射80-100 mg/kg:5-10 mg/kg），单次给药可维持麻醉20-50分钟。进行超声心动图检查时，建议使用异氟烷麻醉小鼠或大鼠（诱导浓度3-4%，维持浓度1.5%）。通过夹捏手术区域的肢体来评估麻醉深度，确认无回缩反射。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
      注意：正确使用并优化不同麻醉剂均可获得可靠结果（其他文献已有综述⁶）。我们进行导管插入术时倾向于使用氯胺酮:赛拉嗪。氯胺酮/赛拉嗪过量可能显著降低心率和心脏功能，因此维持适当的体温和呼吸控制至关重要。为维持小鼠心率（> 400次/分钟），我们常规施行双侧迷走神经切断术。 此处使用的氯胺酮/赛拉嗪剂量通常可维持20-30分钟，足以完成开胸或闭胸心脏导管术，并随后实施安乐死。
3. 准备大鼠/小鼠以进行手术操作（图1）。
   1. 剃除胸部毛发（以便进行超声心动图检查）以及右侧颈部手术区域的毛发。
   2. 使用聚维酮碘棉球以同心圆方式从中心向外周擦拭手术区域，随后用70%酒精棉片清洁。
   3. 将动物置于带有加热垫的手术平台上。调节加热档位以维持体温在37-37.5 °C之间，并使用直肠探头监测体温。低温可导致显著的心动过缓，而高温则可引起显著的心动过速。

2. 超声心动图

注：啮齿类动物超声心动图的完整描述见其他文献⁷。对于小鼠，在麻醉前可对清醒状态下手动固定的小鼠进行成像。对于大鼠，由于体型较大，清醒状态下难以手动固定，因此建议在超声心动图检查前先实施麻醉。

1. 胸骨旁长轴（PLAX）切面。
   1. 将动物以仰卧位放置在平台上，或手动固定。
   2. 选择B模式以显示实时二维图像。
   3. 将超声探头沿左侧胸骨旁线放置，小鼠使用频率为40 MHz的探头，大鼠使用频率为25 MHz的探头；随后将探头逆时针旋转30°，使探头指示方向朝向尾侧（5至11点钟位置）。轻微倾斜探头（在同一断层平面内沿探头短轴方向轻微 rocking），以在屏幕中央获得左心室腔的完整视图。
   4. 定位并观察以下解剖结构（图2A）：左心室（LV）腔、室间隔（IVS）、右心室（RV）腔、升主动脉（AO）和左心房（LA）。
   5. 当上述结构清晰可见后，切换至M模式。以升主动脉为参考点，将取样线置于左心室腔最宽处，并确保聚焦深度位于左心室腔中心（图2B）。通过调整探头角度并获取M模式图像，对右心室进行类似的测量。
   6. 使用 cine 存储功能创建视频循环，用于离线测量（左心室腔尺寸、缩短分数FS及左心室壁厚度）。
   7. 在脉冲波多普勒（PW Doppler）模式下，将PW取样门置于主动脉内，获取主动脉流出道的多普勒频谱（图2C）。
2.  胸骨旁短轴（PSAX）切面（主动脉水平）。
   1. 切换至B模式。
   2. 从胸骨旁长轴切面将探头顺时针旋转90°，以获得胸骨旁短轴切面（图3）。移动并倾斜探头朝向头侧，以识别主动脉瓣的横截面图像。
   3. 识别右心室流出道（RVOT），其为位于主动脉右上方的新月形结构，延续为肺动脉瓣瓣叶及肺动脉。
   4. 手动保持探头在同一位置稳定不动。切换至脉冲波多普勒（PW Doppler）模式。
      注意：可使用固定啮齿类动物和探头的平台，以尽量减少移动及探头位置的变化。
   5. 将取样容积置于右心室流出道中心、接近肺动脉瓣水平处，并将取样线光标与血流方向平行（图3B）。
      注意：必须根据血流方向调整取样角度，或使用超声软件校正角度偏差。若不进行校正，最大允许角度为30°，否则会导致流速低估约15%。
   6. 根据需要调整标尺（血流速度），以获得一个"良好"的多普勒频谱包络，其表现为清晰的白色边缘和内部深色空腔，提示层流血流（图3C）。记录多普勒频谱。
      注意："不良"的多普勒频谱包络缺乏足够的白色边缘和内部空腔。
   7. 若此时不进行导管插入术，则如使用麻醉，应让啮齿类动物恢复意识。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开看护；在完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。若需进行导管插入术，则进入第3节。

3. 右心导管检查

1.  经胸腔闭合法右心室压力测量
   1. 设置：
      1. 将压力换能器连接至输入通道1。在软件中，将通道1设置为压力，通道2设置为心率。
      2. 要将单位转换为 mmHg，需先记录基线轨迹，然后使用压力计手动进行压力校准（若使用血压换能器和PE导管）。随后在通道1下执行单位转换。
      3. 设置心率时，关闭通道2的输入。在通道2下选择循环测量，并选择通道1作为信号源，以速率作为测量参数。
   2. 将小鼠/大鼠置于解剖显微镜下，调整焦深，放大倍数设为5倍。
   3. 从下颌至胸骨切开皮肤（图1将一对牵开器分别置于切口两侧，充分暴露颈部区域。
   4. 用精细的钝头镊子钝性分离唾液腺，以暴露右侧颈外静脉图4A、B).
   5. 仔细分离右侧颈外静脉与其周围的结缔组织。
   6. 在右侧颈外静脉下方放置两根丝线缝合线（大鼠使用4-0，小鼠使用6-0），远端结扎静脉（尽可能靠近下颌骨），然后在近端打一个松结图4C).
   7. 使用虹膜剪刀剪出一个小口 "尼克" （剪断）位于远端结扎结近端的位置。
   8. 用镊子夹住导管，将导管插入静脉切口，然后扎紧近端结。
      注意：通常使用聚乙烯（PE）-10 导管（约 2 Fr 规格）用于小鼠，PE-50 导管（约 3 Fr 规格）用于大鼠，通过 31 G 或 21 G 针头连接至常规压力传感器并进行校准。用记号笔在导管上标记长度，该长度大致对应导管尖端置于右心室的位置。作为 PE 导管的替代方案，可使用微压电导管。轻柔牵拉远端结有助于导入导管。
   9. 轻柔地将导管推入右心，根据标记监测推进的深度。在软件中监测压力曲线，以确认导管位置并识别右心室（RV）压力图5).
   10. 保持导管静止，采集数据（点击“开始”按钮旁的数据记录开关）2分钟。
   11. 进入样本采集步骤（第4节）。
2. 右心室压力-容积环分析的开胸手术方法
   注意：由于导纳导管较硬，无法经上腔静脉（SVC）进入右心房（RA），因此不能通过闭胸方法进行右心室的压力-容积环（P-V loop）分析。市面上可获得的导纳导管是专为左心室（LV）P-V loop分析设计的。
   1. 在软件中，将通道1设置为电导；通道2设置为压力；通道3设置为心率。
   2. 用16 G聚四氟乙烯导管对大鼠进行插管，并将导管连接至机械呼吸机。使用以下公式计算并设置小鼠或大鼠的通气参数⁶：潮气量（V_t，毫升）＝ 6.2 × M^1.01(M = 动物质量，kg）；呼吸频率（RR，min⁻¹）^-1) = 53.5 × M^-0.26(图6A).
   3. 用70%酒精涂抹毛发，以减少毛发在手术区域的扩散。
   4. 在剑突下方做一切口，用剪刀向两侧 flank 方向分离皮肤。
   5. 沿膈肌进行双侧解剖，切开腹壁并打开腹腔。
   6. 打开膈肌以暴露心脏心尖，并双侧剪开肋骨 cage（图 6A）。使用注射器向胸腔和腹腔内喷洒生理盐水，以防止液体蒸发和组织干燥。
      注意：我们通常使用解剖剪刀打开腹腔和肋骨 cage。出血通常不明显，但如果出现出血，可使用电灼止血。
   7. 仔细分离下腔静脉（IVC）与其周围结缔组织。
   8. 在下腔静脉（IVC）周围放置一段丝线缝合线（大鼠使用4-0，小鼠使用6-0），然后打一个松结（或将缝合线穿过一段16 G聚四氟乙烯管）图6B).
   9. 用27-30号针头平行于右心室游离壁穿刺其心尖部，随后拔出针头。注意针头插入深度不得超过4 mm。
      注意：也可使用一小段PE-60导管作为引导，将导纳导管插入右心室心尖部。
   10. 将导纳导管尖端经右心室游离壁心尖处的刺入孔插入，直至所有电极均进入心室内部（图6C).
   11. 在软件中监测压力-容积环，然后调整导管位置，以获得形态稳定且无明显呼吸变异的压力-容积环图 7B、C).
   12. 记录至少10秒的基础压力-容积环（在“开始”按钮旁切换数据记录状态以启动记录），以获取足够数量的压力-容积环。
   13. 拉动置于下腔静脉（IVC）周围的缝线以改变前负荷，并记录压力-容积环（P-V环）。在体外分析数据，并计算右心室收缩功能的各项参数。图7D）。此前已有相关描述⁸.
       注意：下腔静脉也可通过钳夹阻断。监测右心室压力曲线，以确认前负荷的降低。
   14. 按照先前所述方法进行生理盐水和比色皿校准，以实现从电导单位到体积单位的转换⁶.
   15. 记录数据后，轻柔地将导管拔出，并立即将导管尖端放入含有生理盐水的水浴中。操作结束后，按照制造商的说明清洁导管。

4. 心脏和肺组织样本的采集

注意：由于此处描述的操作为终末性操作，动物在完成闭胸或开胸右心导管术之后必须实施安乐死。

1. 若采用闭胸法，通过打开胸腔（双侧开胸术）、放血或在麻醉过量后关闭呼吸机的方式处死小鼠。
   注意：不推荐使用颈椎脱位法。
2. 为进行肺部灌注膨胀，将膨胀导管连接至铁架台，设定压力为 20 cmH₂O 以膨胀肺组织（但暂不打开阀门进行肺膨胀）。
3. 钝性分离气管周围的肌肉和结缔组织。
4. 在气管周围放置一段丝线缝合线（大鼠使用 4-0，小鼠使用 6-0），然后打一个松结。
5. 轻柔牵拉气管，通过按压头部并在靠近下颌处做一切口（约气管周长的 70%）。
6. 保持轻柔牵拉状态，插入气管插管（小鼠使用 20 G，大鼠使用 16 G），用缝线固定插管。将插管连接至膨胀导管，并用缝线扎紧插管周围，防止固定液反流。
7. 使用 10 ml 注射器刺入右心室游离壁并向肺动脉方向注射 PBS 以冲洗肺部。当肺组织开始变白时，切开左心房。
8. 在主动脉根部切断，取出心脏。
9. 使用蚊式止血钳夹住右下肺叶，切除右下肺叶。将组织块放入微量离心管中，并在液氮中速冻。
10. 用 10% 缓冲中性福尔马林膨胀肺组织 5 分钟，随后移除气管插管并结扎气管。
11. 将肺组织从胸腔中完整分离，并用 10% 缓冲中性福尔马林固定。
    注意：也可选择用最佳切割温度介质（OCT，以 PBS 1:1 稀释）膨胀肺组织，随后在未稀释的 OCT 中冷冻，用于后续制备冰冻切片。
12. 仔细分离心房与心室，并沿室间隔解剖分离右心室游离壁。
13. 称量右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S）的重量，计算富尔顿指数（Fulton index, RV/LV+S）⁹，以量化右心室肥厚程度。
    注意：富尔顿指数在不同肺动脉高压（PH）模型中有所差异。大鼠¹⁰：对照组为 0.28 ±0.01；缺氧诱导组为 0.57 ±0.02；MCT 处理组为 0.51 ±0.03。C57BL6/J 小鼠¹¹：对照组为 0.26 ±0.01；SuHx 模型（14 天）为 0.40 ±0.02；SuHx 模型（21 天）为 0.43 ±0.01；SuHx 模型（28 天）为 0.44 ±0.03。
14. 将右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S）在液氮中速冻，或用 10% 缓冲中性福尔马林固定。

结果

由于啮齿类动物的右心导管检查通常是一种终末性操作，无法用于纵向随访，因此超声心动图是一种出色的非侵入性替代方法，可用于筛查和随访¹²。在人类肺动脉高压（PAH）的超声心动图评估中，肺动脉收缩压通常通过三尖瓣反流来估算，该反流在心尖切面中通常易于获取；然而，在啮齿类动物中，该切面难以稳定获得，因而无法通过多普勒方法可靠估测肺动脉收缩压。但是，啮齿类动物中可轻松获得主动脉水平的短轴切面（PSAX），从而能够记录并测量肺动脉多普勒频谱，其波形形态已被证实与肺动脉高压的程度相关¹²。超声心动图研究的代表性结果见图3。在本方案中，超声操作人员对动物所接受的治疗或操作设盲。结果采用离线分析。

右心导管术及右心室收缩压（RVSP）的测量是评估肺动脉高压（PAH）的金标准，当不存在肺动脉狭窄时，RVSP可准确估计肺动脉收缩压，在啮齿类动物模型中尤为如此^13,14。本方案介绍了经胸壁闭合式方法测量右心室压力（图5）以及开胸法进行右心室压力-容积环（P-V环）分析（

讨论

本文所述方案详细介绍了肺动脉高压啮齿类动物模型中血流动力学和右心室功能的全面表征方法。尽管本文描述的右心导管术为终末性操作，但超声心动图检查相关的死亡率极低，因而可用于疾病进展的筛查和随访。然而，与肺动脉高压（PH）患者在麻醉状态下死亡率显著升高相似¹⁷，根据我们的经验，患有重度PH的大鼠由于右心功能失代偿、右心室前负荷降低，以及继发的低氧性肺血管收缩，对麻醉的耐受性较差。因此，缓慢诱导麻醉并密切监测呼吸功能至关重要。

本视频和插图展示了我们实验室在这些操作中取得成功的方法，尽管也可采用其他替代方案（详见 Pacher 等⁶的综述）。在肺动脉高压（PH）研究中，为了准确表征不同的疾病模型以及遗传或药物干预对这些模型的影响，必须使用这些技术。每种方法均有其固有的局限性：超声心动图对右心室的成像视野有限，且难以进行定量分析；闭胸导管插入术仅能通过右心室收缩压（RVSP）估算肺动脉压力，对右心室功能的评估也仅限于dP/dt；开胸导管插入术则需打开胸腔，可能影响静脉回流和右心功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vevo 2100 成像系统 (120V)	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo 2100 成像工作站	VisualSonics, inc.
高频机械换能器	VisualSonics, inc.	MS250, MS550D, MS400
超声耦合剂 Parker	Laboratories Inc.	01-08
PowerLab 4/35	ADInstruments	ML765
Labchart 8	ADInstruments
带三通阀和电缆的血压换能器	ADInstruments	MLT1199
血压换能器校准套件	ADInstruments	MLA1052
用于小鼠的 Mikro-Tip 压力导管	Millar	SPR-1000	可选自 Scisense FT111B（小鼠）和 FT211B（大鼠）的替代导管
用于大鼠的 Mikro-Tip 压力导管	Millar	SPR-513	可选自 Scisense FT111B（小鼠）和 FT211B（大鼠）的替代导管
Millar Mikro-Tip 超微型小鼠 PV 环导管	Millar	PVR-1035	可选自 Scisense FT112（小鼠）的替代导管
Millar Mikro-Tip 超微型大鼠 PV 环导管	Millar	SPR-869	可选自 Scisense FT112（小鼠）的替代导管
Millar PV 系统 MPVS-300	Millar	MPVS-300
4-0 黑色丝线编织线 100 码卷轴	Roboz Surgical	SUT-15-2
6-0 黑色丝线编织线 100 码卷轴	Roboz Surgical	SUT-14-1
精细虹膜剪刀，Integra Miltex	VWR	21909-248
VWR 解剖剪刀，锐/钝头	VWR	82027-588
VWR 精细剪刀，4 1/2"	VWR	82027-582
双齿止血钳，Excelta	VWR	63042-090
中性缓冲福尔马林	VWR	89370-094
蛇毒酶 Crotaline	Sigma	C2401
SU5416	Tocris Biosciences	3037
3.5X-45X 双筒变倍立体显微镜带支架	AmScope	SM-3BX
PE（聚乙烯管）-10	Braintree Scientific Inc	PE10 36 FT
PE（聚乙烯管）-50	Braintree Scientific Inc	PE50 36 FT
PE（聚乙烯管）-60	Braintree Scientific Inc	PE60 36 FT
台式异氟烷麻醉机	Kent Scientific	ACV-1205S
Surgisuite 多功能手术平台	Kent Scientific	Surgisuite
牵开器套装	Kent Scientific	SURGI-5002
麻醉诱导舱	VetEquip	941443
麻醉气体过滤罐	Kent Scientific	ACV-2001
啮齿动物鼻罩	VetEquip	921431