微柱阵列上简便而精确的力学表征

摘要

本文描述了用于量化贴壁细胞与微结构基底之间机械相互作用的实验方案。这些相互作用与细胞迁移、增殖、分化和凋亡等基本细胞行为密切相关。本方案介绍了一款名为 MechProfiler 的开源图像分析软件，该软件可实现对每个微柱所受作用力的测定。

摘要

集成柔性微柱的细胞培养基底可使研究人员研究细胞与其周围微环境之间的力学相互作用，尤其关注细胞与基底之间的相互作用。目前，微柱阵列技术已发展成熟，过去十年中已发表大量相关应用。然而，由于微柱制备过程耗时且技术难度较高，同时缺乏易于使用的软件来分析细胞与微柱相互作用的图像，生物学家对该技术的采用仍持保留态度。

微柱产生的力信号读取出人意料地简便。微柱的作用类似于弹簧，细胞理想情况下附着在其顶端。根据细胞大小，细胞通过一个或多个局灶性黏附点将其细胞骨架产生的力传递至微柱，从而导致微柱发生偏转。偏转程度与所施加力的方向和大小直接相关。细胞覆盖的微柱数量以及微柱偏转模式具有特征性，可据此确定每根微柱受力等数值，以及多种具有生物学意义的参数，从而实现对细胞表型的“力学特性分析”（mechano-profiling）。

本文介绍了一种便捷的机械性能分析方法，该方法结合了第一代即用型市售微柱阵列与本实验室开发的软件包，该软件现已向所有研究人员开放。作为典型应用的示例，采用明场显微镜拍摄骨癌细胞的单张图像，用于转移性细胞系模型的机械性能分析。这种商业化的牵引力传感器与开源分析软件的结合，首次使得非专业用户能够快速将微柱阵列技术应用于常规实验工作。此外，该方法具备稳健且流程化的分析过程，使用户能够以高度高效的时间利用率分析大量微柱图像。

引言

力敏型细胞实验可用于研究贴壁细胞，其应用范围广泛，反映了力学因素在细胞生物学中的核心作用。这些应用通常聚焦于驱动亚细胞过程或整个细胞行为的潜在机制。一方面，外部环境因素（如细胞外基质的成分或基质刚度）可显著影响细胞的力学和生物学响应¹。在使用多种药理活性化合物后，也可观察到类似现象，其效应通常通过细胞培养模型进行表征²。另一方面，基因型特性（如由自发或实验诱导的基因突变引起的变化）可导致细胞表型发生显著改变，这些改变常与细胞骨架结构和功能的异常相关³。上述例子仅仅是细胞力学表型分析相关研究主题中的一小部分，而这些主题均已成功地利用微柱阵列进行过有效研究。

截至目前，已有约200篇文章发表，描述了细胞与微柱之间的相互作用。这些研究既探讨了微柱弯曲原理的理论方面，也提供了其制造过程中的实际操作指导。首篇描述细胞与柔性微柱阵列相互作用的文章由Tan及其同事于2003年发表⁴。与传统的牵引力显微镜技术（TFM）不同，后者使用连续的软基底来估算纳米牛顿量级的细胞收缩力，而Tan 等则提出了一种方法，采用多个由硅酮弹性体制成的紧密排列的垂直微梁结构。该技术的主要优势源于两个关键特征：首先，为了改变细胞所感知的基底刚度，只需调整微柱的几何尺寸，同时保持基底材料组成不变，从而避免了表面拓扑结构和化学性质的差异；其次，微柱可作为独立的弹簧单元，能够以单个黏着斑级别的力和空间分辨率进行离散化....

方案

1. 在微柱阵列上培养细胞

注意：所有步骤均须在生物安全柜中进行，以确保无菌。此处提供的体积适用于 T25 细胞培养瓶。细胞培养基配方和细胞接种密度已针对骨癌细胞系 HuO9 和 M132 进行优化。

1. 准备将细胞接种到微柱阵列上的细胞培养物。
   1. 将培养瓶置于标准光学显微镜下，检查细胞培养质量。通过估算培养瓶底部被细胞覆盖的比例来判断细胞是否呈现正常的生长状态和形态。70%–80%的覆盖率表明细胞生长状态良好。注意观察悬浮细胞的数量，因其代表死亡细胞和/或过度生长的培养物。
   2. 通过移除培养基并用4 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后加入0.8 ml 1×胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），在室温下孵育直至细胞脱落，通常需要2–4分钟。在显微镜下观察该过程，并可轻敲培养瓶以促进细胞脱落。
   3. 加入5 ml细胞培养基（含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）的DMEM/F12培养基）以终止反应，并冲洗残留于瓶底的细胞。随后反复吹打数次，使细胞悬浮液均匀混合。吹打时应确保覆盖培养瓶原有的生长区域，以实现有效脱落。
   4. 将细胞悬液转移至15 ml离心管中，使用台式离心机以0.5 × g离心3分钟。
   5. 弃去上清液，加入5 ml培养基，通过反复吹打5次重悬细胞沉淀。操作过程中应避免产生气泡。
   6. 使用细胞计数板和....

结果

所述技术的主要优势在于其简便性以及能够快速有效地整合到常规实验室工作中的潜力。高质量的商用传感器阵列与开源软件相结合，可提供有关机械敏感性的信息，而这些信息原本需要洁净室设施以及图像分析和软件开发方面的深入知识才能获得。图1展示了本方法的工作流程。首先将细胞接种并培养在微柱阵列上，固定并染色后，微柱阵列即可用于成像。该技术的核心部分是使用MechProfiler软件进行图像分析。用户只需在图形用户界面（GUI）的“设置”中输入所有相关参数，即可立即开始分析图像。对应的像素尺寸是指单个像素所代表的实际长度，其值取决于用户的实验装置。对于每种使用的放大倍数，需通过拍摄已知尺寸物体的图像来单独确定该参数。补充材料中的图9给出了一个示例。

图像质量是一个关键因素，因为它会显著影响分析过程。为了获得最高质量的图像，应确保使用稳定且定期维护的成像平台，如图2所示。特别是光源的对准非常重要，因为未对准会导致产生不希望的阴影，这在图像分析时可能带来问题。此外，在大多数实验室中，将光学显微镜放置在防.......

讨论

本研究旨在通过显著降低技术与实践门槛，推动牵引力显微镜领域的发展。这些障碍主要来自两个方面。首先是必须克服的诸多非平凡技术挑战，以实现微柱阵列的可重复制造与实验部署。其次同样具有挑战性的是，需要对单细胞受力进行可靠且半自动化的分析——需注意，典型的实验可能需要分析数百甚至数千个细胞。上述技术的开发旨在使无驻场工程专业知识的细胞生物学实验室也能便捷地开展基于微柱的牵引力显微镜研究。本文介绍的传感器与分析方法可使非专业人员能够快速而准确地分析单个细胞所施加的力。

除了需要进入配备至少一台中档明场显微镜的细胞生物学实验室外，所述方法几乎不需要其他复杂的技术设备。即使用户经验有限，也能开展有效的牵引力显微镜实验，尽管该技术功能强大且用途广泛。然而，在本实验方案中有三个关键方面必须加以注意。首先，必须确保微柱阵列始终被液体覆盖，以避免因毛细作用力导致微柱塌陷。其次，需要优化微柱图像的成像参数，最佳做法是在同一阵列位置上连续采集多幅图像，同时调整曝光时间、光圈大小和补偿环位置。找到微柱顶端的正确焦平面至关重要，考虑到传感器阵列的轴向尺寸极小，这一点需要一定的操作经验。第三，用户.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T25 细胞培养瓶	Nunc	156367
1× PBS 缓冲液	Sigma	D8537
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400054
培养基 DMEM/F12	Sigma	D8437
南美来源胎牛血清（FBS）	Life Technologies	10270106
青霉素-链霉素 100×	Sigma	P4333
15 ml 离心管	Sarstedt	62.554.502
胶原 I/纤连蛋白预包被微柱阵列	MicroDuits	MPA-col1/FN	微柱尺寸：Ø=6.4 µm，l=18.2 µm；网格间距=13 µm，kcorr=2.87 nN/µm
无水乙醇 p.A.	Merck	100.983
12 孔板	Nunc	150628
中性缓冲福尔马林溶液 10%	Sigma	HT5011
亮蓝 G-250	Sigma	27815	考马斯亮蓝
甲醇 ACS p.A.	Merck	1.06009
乙酸	Sigma	695092
玻璃底培养皿	WillCo Wells BV	GWSb-3522	直径 35 mm，孔径 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	倒置显微镜
D3-L3	Nikon	n/a	相机控制器
DS Fi2	Nikon		相机