细菌的机械敏感性通道可用作生物分子器件中的力电换能器。液滴界面双层膜（DIBs）是此类器件中受细胞启发的构建单元，为整合和刺激机械敏感性通道提供了新平台。本文中，我们展示了一种基于微移液管的新型DIBs形成方法，可在机械刺激条件下研究机械敏感性通道。
本文内容
摘要
摘要
MscL 是一种大电导机械敏感通道（MSC），作为一种普遍存在的渗透压溶质释放阀，可帮助细菌在突然的低渗冲击下存活。该通道已被发现并利用膜片钳技术进行了近三十年的深入研究。其基本功能是将施加于细胞膜上的张力转化为通透性响应，这使其成为在基于人工膜的生物分子器件中充当机械电转导元件的有力候选者。作为此类器件的构建单元，液滴界面双层膜（DIBs）可被用作整合和刺激 MscL 通道的新平台。本文描述了一种基于微移液管的方法，用于形成 DIBs 并测量其中整合的 MscL 通道的活性。该方法包括由脂质包裹的水相液滴，分别固定在两个相对（同轴排列）的硼硅酸盐玻璃微移液管尖端。当液滴相互接触时，便形成脂质双层界面。该技术可精确控制每个液滴的化学组成和大小，以及双层膜界面的尺寸。将其中一个微移液管连接至谐振压电驱动器，即可施加所需的振荡刺激。通过分析液滴在形变过程中的形态变化，可估算界面处产生的张力。利用该技术，首次报道了 MscL 通道在 DIB 系统中的活性。除机械敏感通道外，该方法还可用于研究其他类型通道的活性，证明了该平台的多功能性。本文所述方法不仅能够测量膜的基本物理特性，还可更精确地控制对称与非对称膜的形成，为刺激和研究机械敏感通道提供了一种替代性手段。
引言
在过去十年中，随着液滴界面双层膜技术的发展，人工脂质双层膜的构建取得了显著进展。由于具有稳定性和鲁棒性，液滴界面双层膜（DIBs）已成为经典的涂覆式（Mueller）和折叠式（Montal-Mueller）平面双层膜的替代模型系统1。尽管利用液滴构建脂质双层膜的想法可追溯至20世纪60年代2，但直到最近才获得广泛关注。首个成功尝试由Takeuchi课题组报道3，随后Bayley课题组通过一系列研究展示了利用液滴网络形成双层膜的方法4-6。近年来，Leo课题组提出了封装技术7-9，并率先提出将DIBs作为新型刺激响应材料体系基本构建单元的概念10。在以往的研究中，DIBs已被证实能够响应电刺激9,11、化学刺激10,12和光刺激13。当不同功能的刺激响应性生物分子被重组到DIB中时，均可实现有效调控10,14。鉴于这些成功实践，一个重要的问题被提出：当引入适当的生物分子时，DIB是否也能响应机械刺激？作用于DIB的界面力与其他双层膜系统中的力有所不同15,16。因此，可通过调节水-脂质-油界面的张力来控制由液滴支撑的双层膜中的膜张力；这一原理在涂覆式或折叠式双层膜系统中并不适用。
MscL通道，通常被称为渗透压溶质释放阀，是细菌细胞质膜的基本组成成分，可响应膜张力的增加17,18在发生低渗冲击时，存在于小细胞膜上的多种通道19 可产生强烈的通透性反应，迅速释放离子和小分子，从而避免细菌发生裂解20从生物物理学角度来看，MscL 主要通过经典的膜片钳技术得到了深入的研究和表征21-23可靠的结构模型，用于解释MscL的门控机制24,25 基于其同源蛋白的晶体结构提出26,27，建模28以及大量实验的结果 24,29-31在约10 mN/m的施加张力下，由跨膜螺旋紧密束构成的闭合通道会转变为一组显著倾斜的螺旋环，形成一个约28 Å、充满水的导电孔道。21,24,32此外，位于内侧跨膜区TM1结构域交界处的紧密门控的疏水性已被证实决定了该通道的激活阈值。33相应地，研究发现通过降低门控结构的疏水性，可降低其张力阈值22MscL 的这一特性使得设计出多种可控阀门成为可能34，主要用于药物递送。基于上述所有特性及其将细胞膜过度张力转化为电生理活动的核心功能，MscL 非常适合作为 DIBs 中的力电转导元件。
本文介绍了一种基于微移液管的原创方法，用于构建双层脂质膜（DIB）并测量其中整合的机械敏感性通道蛋白MscL在机械刺激下的活性。我们首次报道了DIB对机械刺激的响应，以及MscL的V23T低阈值突变体在DIB中的功能性重建35。
实验系统由脂质包裹的水相液滴组成，这些液滴被固定在两根相对的硼硅酸盐玻璃微电极的尖端。当液滴相互接触时，会形成脂双层界面。该技术可精确控制每个液滴（主体）的化学成分和大小，以及脂双层界面的尺寸。此外，可轻松构建每层具有不同脂质组成的非对称膜。其中一根微电极连接至谐振压电驱动器，从而能够施加预编程的单周期或振荡刺激。张力通过压缩支撑人工膜的两个液滴传递至膜上。由于液滴发生形变，水-脂质-油界面的面积增加，同时液滴之间的夹角减小，导致膜张力升高并瞬时激活机械敏感性通道MscL。通过分析液滴在形变过程中的形态，可估算界面处产生的张力。尽管本文重点在于DIB的机械转导特性，但我们同时强调，该多功能平台也可激活其他类型的生物分子，例如短杆菌肽alamethicin。本文以逐步详述的方式，全面展示了采用这一新方法进行样品制备、系统组装及测量的所有技术细节。
方案
1. PEG-DMA 水凝胶的制备
- 选择合适的测量/混合容器（烧瓶、烧杯， 等等。）用于该实验。使用洗涤剂和水彻底清洗，并用无绒布擦拭。
- 佩戴手套以避免手指油脂污染玻璃器皿。用足量去离子水冲洗容器，以去除洗涤剂残留。
- 用无尘纸擦拭容器以去除水分，然后喷洒异丙醇（IPA，99.5%）并擦拭至洁净。将容器置于真空干燥箱中，使所有异丙醇完全挥发。用蒸馏水清洗用于水凝胶制备过程的其余实验器材。
- 要制备40% (w/v) PEG-DMA水凝胶溶液，使用实验室天平称取4 g聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA；MW = 1,000 g/mol）聚合物。
- 将称量好的PEG-DMA放入烧瓶中，使用超声波水浴在45–55 °C下加热，直至固体PEG-DMA完全液化。在此过程中，用Parafilm封口膜或蜡纸覆盖烧瓶口，防止水分进入。
- PEG-DMA 完全液化后，加入缓冲液（500 mM KCl，10 mM MOPS，pH 7.0），直至总体积达到约 10 ml（足够六个月内进行多次实验）。
- 加入0.5%（w/v）的固化剂。在此情况下，向10 ml混合物中加入0.05 g固化剂。将烧瓶重新放入超声波清洗仪中，使各组分溶解于溶液中（约10分钟，250瓦）。
注意：一旦将固化剂加入溶液中，如果暴露于任何光源下足够长的时间，水凝胶将会固化（变硬）。为防止这种情况，可用黑胶带包裹小瓶/容器，并将其存放在黑暗处。该溶液可在室温（22 °C）下保存数周。
2. 脂质体的制备
- 取20 mg以冻干粉形式购买的合成脂质1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DPhPC），加入10 ml缓冲液（500 mM KCl，10 mM MOPS，pH 7.0），配制成10 ml浓度为2 mg/ml的脂质溶液。确保脂质囊泡与缓冲液充分混合（完全溶解后混合物应呈现均匀且浑浊的外观）。
- 将新配制的脂质混合物在-20 °C下冷冻并室温下完全解冻，重复此冻融过程共六次。解冻时务必在室温下进行，切勿使用加热环境。
- 使用 commercially available extruder（商用挤出器），先将全部脂质悬浮液通过0.4 μm聚碳酸酯膜滤器挤出，随后再通过0.1 μm膜滤器挤出六次。此过程可获得直径约为100 nm的脂质颗粒（与滤膜孔径相当）。
注意：： 可使用此方法制备其他脂质及不同脂质比例的脂质体。脂质体应在 4 °C 下保存数周。
3. MscL 的分离与重组
- 在含有100 μg/ml 氨苄青霉素的琼脂平板上划线接种携带V23T MscL基因（在3'端扩展有6-His标签，即C末端）的pB10b质粒的E. coli MJF465细胞。将平板置于37 °C恒温培养箱中静置培养过夜（12–16小时）。该质粒通过在标准LB培养基中添加100 μg/ml氨苄青霉素进行筛选并保留在细胞中。次日，在培养容器（如50 ml锥形瓶或其他可用于培养的容器）中加入20 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。取前一晚培养的平板，用无菌接种环挑取单个菌落，接种至已准备好的20 ml含氨苄青霉素的LB培养基中。将20 ml菌液置于37 °C摇床中，以250 rpm振荡培养过夜（12–16小时）。
- 将20 ml过夜培养物倒入2–4 L的LB培养基中。此时不再需要添加氨苄青霉素。将锥形瓶置于摇床培养箱中，于37 °C、250 rpm振荡培养，直至OD600达到0.5。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为0.6 mM，并继续培养1小时（至OD600 = 0.8–1.0）。
- 将锥形瓶置于冰上冷却菌液，随后通过离心收集细菌。使用六个400 ml的锥形离心管（或根据所用转子允许的最大数量），在7,438 × g条件下离心5–8分钟，以沉淀细菌。弃去上清液，并重复此步骤，直至所有培养液中的细胞均被收集。所需离心次数取决于培养物总量及所用转子的容量。对于2 L培养物，通常仅需离心一次即可。将所有收集的细胞转移至同一个离心管中。
- 用约20 ml法国压榨缓冲液（100 mM KPi和5 mM MgCl2，pH 7.4）重悬细胞沉淀。悬浮液应呈浓稠状（类似奶油或牛奶）。在进行法国压榨前立即加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为2 mM，并剧烈混匀。
- 使用35 ml法国压榨细胞，在10,000至16,000 psi压力下对菌液进行压榨。随后在4 °C条件下，以7,438 × g离心10分钟，沉淀未破碎的细胞。
- 将上清液转移至另一离心管中，并加入溶菌酶和DNase（各0.2 mg/ml）。室温下轻轻翻转混匀，孵育10分钟。
注意：DNase 为可选项；它可降低高通量离心时的黏度。溶菌酶至关重要；它可降解细胞壁残余成分，并有助于提高使用温和非变性去污剂进行膜提取时的得率。
- 将上清液混合物分装至两支超速离心管中，在4 °C条件下以106,883-153,911 × g（根据转子类型而定）离心40分钟。离心后弃去上清液，管底的棕褐色沉淀（即总膜组分）可于-80 °C冻存以长期保存，或直接用于后续蛋白质纯化。
- 配制 0.5–1 L 高咪唑缓冲液：100 mM NaCl + 500 mM 咪唑，用浓 HCl 滴定至 pH 7.2–7.4。注意，咪唑本身是一种良好的缓冲物质。
- 准备0.5-1 L低咪唑缓冲液：100 mM NaCl + 15 mM咪唑，通过用100 mM NaCl适当稀释上述缓冲液制备。无需调节pH。
- 分别取100–150 ml每种缓冲液置于不同的瓶中，加入1%（w/v）正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）。充分搅拌溶液，并通过0.22 μm滤膜过滤。这些溶液即为低咪唑和高咪唑层析溶液。
- 配制提取缓冲液，取50 ml低咪唑缓冲液，加入3%（w/v）正辛基-β-D-葡萄糖苷（OG），过滤缓冲液。
- 使用0.5–2 g湿重的膜沉淀进行蛋白质分离。加入5–7 ml提取缓冲液，重悬沉淀，并在30 ml手动玻璃活塞匀浆器中进行匀浆。用5–10次轻柔研磨，制成无团块的均匀悬浮液。注意：已知剪切应力可导致蛋白质变性。
- 离心去除不溶性颗粒（中速离心机，固定角转子，38,478–68,405 × g，4 °C 离心 15 分钟）。同时，取 3 ml Ni NTA 磁珠（6 ml 悬浮液），加入低咪唑缓冲液（不含 OG），在 15 ml 螺口离心管中振荡洗涤一次。静置使磁珠自然沉降至管底（约 5–7 分钟），或在 4 °C 以 129–201 × g 离心 1 分钟。待磁珠形成沉淀后，小心倾去上清液，并重复该洗涤步骤一次。用 2–3 ml 含 3% OG 的提取缓冲液对磁珠进行平衡处理。
- 将3.12步骤中获得的匀浆混合物（膜沉淀和提取缓冲液）与3-3.5 ml Ni NTA凝胶混合，在螺旋盖管中旋转孵育60分钟（批量上样）。在201 × g条件下离心30秒，收集凝胶，手动倾去上清液，并用1% OG低咪唑缓冲液洗涤凝胶一次。再次按照3.13步骤离心收集凝胶，重悬于20-30 ml新鲜的低咪唑缓冲液中。
- 用镍柱（配备上部流速适配器）装填一个小层析柱，打开活塞使裂解液流过，让镍珠自然沉降（切勿让镍珠变干）。打开活塞，用10 ml低咪唑缓冲液（含1% OG）洗涤镍珠一次。
- 将纯的低咪唑缓冲液和高咪唑缓冲液分别约25 ml加载到层析仪中，按照仪器设定的流速（因仪器而异）进行操作；首先使低咪唑缓冲液流经系统。在OD处将光学记录仪调零260 （基线）。注意，缓冲液与水有较大差异，因为低纯度的咪唑含有吸收紫外光的杂质。将流路适配器插入柱子并连接到仪器上。
- 用低咪唑缓冲液（1 ml/min）再次洗涤层析柱，直至流出液的OD值降至基线水平（可能需要10–20 ml），以去除未结合的蛋白质。
- 以1 ml/min的流速，施加20至500 mM咪唑的线性梯度，持续30分钟。当OD达到时开始收集每管4 ml的组分。600 显示增加。前两个组分含有大量结合较弱的蛋白质，而MscL-6His在约线性梯度的40%时开始洗脱。该蛋白的大部分出现在第3至第8组分中。
注意：由于咪唑浓度百分比逐渐增加，将观察到OD值呈线性上升。 - 将第3-4、5-6和7-8组分分别合并。可选择将各组分单独浓缩。使用离心过滤器将组分浓缩6-10倍。在804 × g、4 °C条件下离心20分钟后，小心重悬浓缩后的蛋白质，注意蛋白质易粘附于滤膜上。
- 吸取50 μl等分试样，与SDS上样缓冲液混合，通过PAGE凝胶电泳检测蛋白质纯度。
注意：MscL 将以约 17 kDa 的弥散条带迁移至凝胶底部。 - 使用蛋白检测试剂盒（按照制造商说明书）对浓缩后的组分进行蛋白定量。由0.8 g膜沉淀物获得的典型产量为合并组分中含有最多0.2 mg的纯化蛋白。
- 通过透析将V23T MscL重组到DPhPC脂质体中。取10 mg/ml的DPhPC氯仿溶液，分装0.5 ml（即 将5 mg脂质分装至三支一次性圆底（12 x 130 mm）玻璃试管中。在氮气流下干燥脂质，并在真空条件下除去残留的氯仿（4–6小时）。
- 向每支试管的干燥脂质中加入15至20 mg粉末状OG，溶于2 ml透析缓冲液（100 mM KCl，5 mM KPi，pH 7.2）中，涡旋混匀，并进行轻度超声处理。OG溶解的脂质应形成澄清溶液。
- 向每支试管中加入浓缩的 V23T MscL 溶液，使蛋白与脂质的比例分别为 1:100、1:300 和 1:1,000，充分涡旋混匀。剪取并清洗三段透析袋（截留分子量 8000，直径 7.5 mm，每段长约 12 cm），并准备好三对编号夹子。
- 将溶解的脂质-蛋白混合物放入透析袋中，用夹子小心封口，于4 °C条件下在2 L缓冲液（100 mM KCl，5 mM KPi，pH 7.2）中透析48小时，每12小时更换缓冲液一次，共更换四次。透析结束后，蛋白脂质体即制备完成。
注意：：脂质体溶液可添加 2 mM 的 NaN3（叠氮化钠），并在 4 °C 下保存。避免冷冻。
4. 油藏的制备
- 在直径为2英寸、长1.5厘米的亚克力圆柱体底部上方1厘米处，沿管壁相对两侧钻两个贯穿孔（直径1.0 mm）（图1A）。
- 以先前钻好的1 mm孔为中心，钻两个直径为4 mm的同心孔，深度均为1 mm（注意不要钻透）。这些孔用于安装橡胶垫圈。
- 将内径为1 mm的两个橡胶垫圈放入较大的孔中并用胶固定，以防止油泄漏。
- 使用通用环氧树脂将加工好的圆柱体粘接到一块10 cm × 10 cm的薄亚克力板上（图1）。
实验当天：
5. 电极的制备
- 截取两根直径为 250 μm、长度为 7 cm 的银丝，将其末端浸入漂白剂中两小时，以形成氯化银（AgCl）涂层。若末端呈现灰色，则表明已成功形成 AgCl 涂层（图 2E）。
- 使用玻璃切割器将一根长 10 cm、外径/内径为 1/0.58 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细管切割为两根 5 cm 长的毛细管。
- 使用 34 号微细针头将 PEG-DMA 水凝胶填充至毛细管中。为防止水合后的水凝胶在毛细管中膨胀溢出，需在毛细管末端预留 3 mm 的空隙，并确保毛细管内无气泡。
- 将 Ag/AgCl 电极插入已填充水凝胶的毛细管中（图 2E）。
- 使用功率为 1 W 的紫外点光源照射 2 分钟，通过自由基光聚合反应使 PEG-DMA 水凝胶固化。
6. 实验设置
注意：实验装置位于法拉第笼内，且法拉第笼接地至膜片钳放大器的接地端。
- 将一根微移液管连接至带有雄性接头的直型微电极夹持器上（图2E）。
- 将微电极夹持器连接至膜片钳放大器的前置放大器头级（图2A）。为将头级接地，使用18号绝缘铜线焊接至适用于头级的接头。
- 将头级安装在三轴手动显微操作器上。将头级安装板（可随显微操作器一同购买，或在机加工车间定制）固定于显微操作器，然后使用合适的螺钉将头级连接至安装板。
- 通过实验室自制的连接件将第二根微移液管连接至线性驱动器，并将两者共同安装在第二个显微操作器上（图2B）。两根微移液管应相对放置，对齐并保持水平。注意：显微操作器的品牌和型号无关紧要。
- 在玻璃小瓶中，混合0.1 ml的DPhPC脂质体与0.01 ml的V23T MscL蛋白脂质体溶液。
注意：此步骤旨在降低蛋白与脂质的比例（约 0.0002），这对于形成稳定的脂双层至关重要。
- 使用34号微细注射针，将两个微移液管尖端填充蛋白脂质体溶液（图3A）。
- 将储液池置于直立显微镜上方，并将微移液管从相对的1 mm孔中穿入（图2B）。注意：只要能够清晰观察到液滴，任何类型的显微镜均可使用。
- 用十六烷（99%）将储液池填充至液面。十六烷无需进一步纯化。
- 为在微移液管尖端形成球形液滴，使用第三个安装在第三台微操作器上的直径为10 μm的硼硅酸盐玻璃微移液管，在微移液管尖端释放稀释的V23T MscL蛋白脂质体溶液（约0.00052 ml），以形成液滴（图3）。
- 根据需要调节液滴大小（通过减少或增加体积），并静置10分钟，使单分子层完全形成（图3）。
- 使两个液滴相互接触，双分子层将在1至2分钟内形成。
7. 软件与设备的设置
- 打开计算机、显微镜、压电振荡器控制器、函数发生器、膜片钳放大器和低噪声数据采集系统的电源，以准备软件运行。
注意：可使用任意膜片钳放大器，以下说明针对本实验所用的特定型号，该型号已在材料与设备列表中列出。 - 在膜片钳放大器的前面板上，将 "模式" 旋钮设置为 VHOLD/IHOLD 和 V-CLAMP。
- 在前面板上，将 "低通" 贝塞尔滤波器 设置为 1 kHz，输出增益 设置为 2。
- 将 "配置" 设置为 WHOLE CELL β = 1。
- 确保其余旋钮均置于零位或中性位置。
- 以 5 kHz 采样频率采集所有 DIB 电流测量数据，并使用 1 kHz 贝塞尔抗混叠滤波器。
- 通过双击桌面上的图标启动软件。
- 点击 "配置 > 数字转换器" 以打开 "数字转换器" 对话框，然后点击 "更改" 按钮。
- 在 "更改数字转换器" 对话框中，从 "数字转换器类型" 列表中选择 "Digidata 1440 系列" 。
- 点击 扫描 按钮以检测数字转换器。
- 点击 "确定" 退出 "更改数字转换器" 对话框，然后点击 "确定" 退出 "数字转换器" 对话框。
- 点击 "配置 > 实验台"。
- 在实验台的输入信号选项卡中，选择数字转换器通道下的 Analog In Å。将比例因子设置为 0.002。
8. 脂质双分子层的形成
- 使用 BNC 电缆，将波形发生器的输出端连接到数据采集系统后侧面板上的外部命令输入前端切换开关。向探头发送一个 10 Hz、500 mV 峰峰值的三角波形。
- 使用显微操作器，水平移动玻璃微电极，使液滴相互接触直至轻微接触，然后等待双层膜变薄（通常约 1 至 2 分钟）（图 3C 和 3D）。
注意: 通过显微镜可直观观察到双层膜形成过程的进展，并可通过电流测量进行监测（图4).
- 通过使用显微操作器调节安装在驱动器上的液滴位置，控制双层膜的大小（直径约250 μm）。注意：可通过显微镜目测估算双层膜的大小。该方法使研究人员能够通过显微操作器轻松移动液滴，从而更方便地控制双层膜的尺寸。
9. 动态激发与 MscL 门控
- 一旦双层膜形成并稳定后（即 当双层膜未破裂且不导电时，使用信号发生器发送正弦信号刺激液滴。
- 为刺激整合在双层膜中的MscL蛋白，向压电伺服控制器发送峰峰值振幅为175 μm、频率为0.2 Hz、占空比为50%的正弦波形。（可发送不同类型、不同振幅、频率和占空比的波形）
10. 结果的处理与解读
- 使用数据采集系统记录当前测量结果，并以 .ABF 格式保存。利用函数文件 "abfload" 将 .ABF 格式的数据导入 Matlab，随后对数据进行分析和处理。"abfload" 文件可在网上免费获取。
- 利用适当相机记录液滴在完整驱动循环过程中的视频，估算双层膜的张力及液滴的表面积膨胀程度。
- 在 Matlab 中处理视频，通过图像处理技术对单帧图像进行分析，以估算水/油界面的面积以及液滴之间的夹角。注意：使用视频中提取的二维帧，检测水-油界面（i.e. 液滴边缘），然后通过旋转法估算表面积。
结果
图1和2展示了在对脂双层膜进行机械刺激过程中记录蛋白质活性的实验装置和设备。为了尽量减少测量中的电噪声，工作站放置在一个自制的法拉第笼内，并连接至AxoPatch 200 B放大器的接地端口实现接地。
形成稳定的绝缘脂双层是本研究中的关键步骤。在此体系中，脂单层在浸没于有机溶剂中的水相液滴的油/水界面处自组装。当液滴相互接触时，多余的油相被排除，相对的脂单层变薄，形成厚度为两个分子的脂双层。脂双层表征最常用的技术是电压钳制。在电压钳制中，脂双层两侧的电压保持恒定，同时测量通过的电流。 图4 展示了一次典型的实时电流记录，反映了双层膜初始形成过程。了解其特定电容（~0.6 μF/cm2)5 DPhPC 脂质双层的面积，可通过改变液滴的位置来调控所形成双层膜的面积（图 4A）。利用压电驱动器，可产生不同类型的波形（正弦波、方波、三角波 等等.) 可在不同频率、振幅和占空比下施加于液滴，以实现液滴的水平和轴向振荡，从而改变双分子层的张力和面积（图4B).
当对DIB进行机械刺激的同时，保持膜两侧的直流电位恒定，MscL的低阈值（功能获得型）V23T突变体可产生可靠的活动，主要包括亚导通态，并偶尔出现完全开放事件（图5）。这些事件与使用膜片钳技术从完整的大肠杆菌（coli）内膜以及重组了纯化V23T MscL的脂质体中记录到的事件完全相同。图5 的结果证明，门控响应膜张力的增加而发生，因为所有电流尖峰均出现在压缩峰值时刻。在压缩峰值时，液滴的相对表面积扩张达到最大，因此界面处的张力也达到最大。
Alamethicin 是一种电压门控离子通道，也是被研究得最为广泛的肽之一，当在膜两侧施加直流电压时，它会增加膜的通透性36。通过使用 Alamethicin 肽进行电压门控行电流记录，也可检验脂双层界面容纳跨膜蛋白和肽的能力。将 Alamethicin 与磷脂溶液混合，使其终浓度达到 100 ng/ml。图6展示了在电压钳制条件（+115 mV）下的电流测量结果。本实验中将液滴拉开，以获得较小的双层膜界面，从而实现更高的电阻和更小的电容。Alamethicin 肽的门控行为表现为电流的离散阶跃（图6）。图中右侧的直方图显示了相对于基线水平（0.0962 nS）的电导变化，该基线基本上对应通道本身的第一个电导水平。
图1：描述油储层主要部件和尺寸的示意图。 油储层由弗吉尼亚理工学院机械加工车间制造，由一个经机械加工的圆柱形丙烯酸管粘接在丙烯酸板表面构成。其尺寸和设计可根据不同应用需求进行调整，也可支持两个以上的微移液管。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：实验装置与微移液管的制备。（A）用于形成、机械刺激并表征界面双层膜的标准工作站，包括显微镜、三轴操作器、数码相机、压电振荡器、隔振台和法拉第笼（图中未显示）。（B）实验装置由两个相对放置的微移液管组成，微移液管内填充PEG-DMA水凝胶，并水平置于十六烷油浴中。每个微移液管均含有Ag/AgCl电极，以提供电连接。第三个微移液管中装有蛋白脂质体溶液，用于在其他微移液管尖端形成液滴。（C）DIB电流响应可通过膜片钳放大器与低噪声数据采集系统联合测量。（D）放大图像，显示在微移液管尖端形成的水相液滴。（E）Ag/AgCl电极通过将两根直径250 μm的银丝尖端浸入漂白剂中制备而成。随后将电极插入充满PEG-DMA水凝胶的硼硅酸盐玻璃毛细管中，并用紫外光照射使水凝胶固化。使用带公头连接器的直型微电极夹持器，将其中一个微移液管连接至膜片钳放大器的前置放大头段。
图3：液滴界面双层形成过程的示意图。（A）将一支10 μm的微移液管充满蛋白脂质体，在显微镜下将其移至另一微移液管尖端附近。通过连接微移液管的注射器，挤出少量蛋白脂质体以形成所需体积的球形液滴。静置液滴10分钟，使其单层膜形成。使液滴相互接触；当界面处的所有油相完全消除后，双层膜即形成。（B）在双层膜形成过程中，可通过使用微型微移液管注入所需化学物质，精确控制界面两侧的化学组成。（C）液滴初次接触瞬间的状态。（D）脂质双层膜完全形成后的液滴状态。
图4：实时测量显示界面的初始变薄过程以及随后的扩张。（A）在施加三角波电势过程中测得的电流。所测电流的大小与电容成正比，因此也与双层膜界面的面积成正比。液滴之间靠得越近，界面面积越大，反之亦然。（B）施加机械激励后，双层膜界面的面积以与刺激信号相同的频率增大和减小。
图 5：实时测量显示了双层膜对机械刺激的响应以及 MscL 的 V23T 突变体的门控行为。 电流响应呈正弦波形，这与双层膜面积变化引起的双层膜电容正弦变化相关。在每个周期峰值处出现的电流尖峰表明 V23T 突变体发生了亚电导态门控。极坐标图进一步表明，门控发生在最大压缩处，这反映了双层膜界面张力的增加。
图6：阿莱霉素通道门控行为的电压钳制下电流测量结果及相应的电导水平直方图。 阿莱霉素肽的门控行为表现为电流的离散阶跃式增加。所测得的电导水平与我们研究团队在弗吉尼亚理工学院先前进行的测量结果高度一致7。
讨论
机械感知代表了生物体进化过程中最早出现的感觉转导通路之一。利用这一现象研究和理解DIB的机械-电学特性，是开发功能性刺激响应材料的关键步骤。该方法涉及将机械敏感通道MscL作为机械-电转导元件和应变仪整合并激活于DIB中，以检测脂双层界面张力的增加。另一方面，机械敏感通道的功能可通过脂双层的基本材料特性（包括厚度、固有曲率和可压缩性）进行调控。基于上述背景，基于微移液管的技术为研究人员提供了一种有价值的工具，可用于研究DIB中的机械敏感通道，并深入揭示脂双层结构以及脂质-蛋白质相互作用的机制。
在过去的三十年中，膜片钳技术一直是研究机械敏感性（MS）通道的主要方法，因为它能够同时控制电压和张力。然而，膜片钳技术需要使用体积庞大的设备，难以实现小型化，而小型化特性对于传感与转换装置的工程化设计至关重要。由于其结构简单、稳定且紧凑，水滴双层膜（DIBs）为研究MscL通道的活性提供了适宜的环境。本文在已有DIB构建技术的基础上进一步改进，提出一种基于微移液管的技术，可精确控制液滴和双层膜界面的尺寸、各液滴的化学组成，并通过动态刺激调控界面张力。该技术的关键步骤是将含有蛋白脂质体的水相液滴锚定在同轴相对的玻璃毛细管尖端。将这些液滴置于有机溶剂浴中，当它们相互接触时，界面处即形成脂质双层膜。
微移液管连接至压电振荡器，可实现液滴的水平位移。通过动态压缩液滴，可增加水油界面的界面张力，从而提高双层膜的张力。本方法与近期发表的接触气泡双层膜（CBB）技术37相比，主要有两个方面的不同。首先，本文所述技术利用显微操作器控制双层膜的尺寸，因此液滴体积保持恒定，而CBB方法则不然。此外，CBB技术需要使用压力泵，而本文所介绍的方法无需压力泵，因而结构更简单，更易于搭建。
我们首次能够在不使用膜片钳移液管或化学修饰的情况下，将细菌的 MscL 整合并激活38。由于该系统有助于形成稳定的非对称脂双层膜，因而更接近生物膜中所存在的脂质非对称性。这使得我们能够研究受控的膜组成或非对称性对 MscL 活性的影响。此外，通过图像处理技术，该方法有助于估算脂双层界面处的张力。该技术有助于理解 DIB 中体相力与表面力之间相互转换的基本原理，促进对膜基本特性的测量，并加深对 MscL 响应膜张力机制的理解。
尽管该方法使我们更接近于构建一种生物分子刺激响应性材料系统，并可在不同的生理环境中研究MscL，但该系统仍存在局限性。由于每个液滴中存在以脂质体形式提供的脂质储库，其倾向于缓解油/水界面处的张力，因此该系统中的张力无法实现钳制。因此，目前在DIBs中仅能在动态模式下刺激机械敏感性通道。系统中气泡的存在会显著影响实验的精确性和可重复性。水凝胶中的气泡可能导致电连接失效。
尽管本文描述了使用基于微移液管的方法来刺激MscL，但该技术也可用于研究其他类型的机械敏感性通道，并具有被研究人员用于研究多种生物分子的潜力。例如，我们实验室已使用类似的装置来研究无通道液滴界面双层膜的力电响应。通过这种高度可控的实验装置，可以重构并激活多种蛋白质，但需注意每种生物分子的重构环境各不相同。本文所述方法的应用前景相当广泛，仅受限于研究人员的想象力。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国空军科学研究办公室基础计划资助，项目编号 FA9550-12-1-0464。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤膜 | Corning | 430624 | |
| 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | 以冻干粉末形式购买 |
| 34 号微管 | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
| 400 mL 离心瓶 | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
| Agilent 函数/任意波形发生器，20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
| 氨苄青霉素 | ThermoFisher | BP1760 | ACS 级 |
| Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | - | |
| AxioCam HSm | Carl Zeiss | - | |
| Axopatch 200B 放大器 | Molecular Devices | - | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce | 23225 | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDS 扫频/函数发生器 | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| 透析管 | 7 Spectra/Por | 132113 | 截留分子量 8000，直径 7.5 mm |
| DigiData 1440A 系统 | Molecular Devices | - | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DPhPC | Avanti | 850356C | |
| E-625 压电陶瓷伺服控制器 | Physik Instrumente | E-526 | |
| FPLC 系统 | Pharmacia Biotech | - | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
| 十六烷，99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| 匀浆器 | Wheaton | 357426 | 15 mL |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| IPTG | Affymetrix | 17886 | |
| IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
| Isopore 膜过滤器 | EMD Millipore | VCTP02500 | |
| 异丙醇 | VWR International | BDH1133-4LP | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS 级 |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS 级 |
| Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
| LED-100 紫外点固化系统 | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 手动膜片钳显微操作器 | Thorlabs | PCS-520N | |
| MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS 级 |
| 微电极夹持器 | World Precision Instruments | MEH1S | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MOPS，滴定纯度不低于 99.5% | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
| N2 气体 | Airgas | UN1066 | |
| NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS 级 |
| Ni NTA 琼脂糖珠 | Qiagen | 1000632 | |
| 光学透明浇铸丙烯酸管，外径 2-1/2" × 内径 2" | McMaster-Carr | 8486K545 | |
| P-601 压电陶瓷柔性导向线性驱动器 | Physik Instrumente | P-601 | |
| PAGE 凝胶 | Bio-Rad | 456-9033 | |
| Parafilm M® 通用实验室膜 | Parafilm® | PM999 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 聚乙二醇1000二甲基丙烯酸酯 | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
| 聚碳酸酯 (PCTE) 膜过滤器，黑色，0.4 微米，25 mm，100 个/包 | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
| 无粉软质丁腈检查手套 | VWR International | CA89-38-272 | |
| 替换垫圈 1.0 mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
| 银丝 | GoodFellow | 147-346-94 | 可根据应用选择不同直径 |
| 叠氮化钠 | Affymetrix | 21610 | |
| 试管 | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 × 130 mm |
| 胰蛋白胨 | ThermoFisher | BP1421 | |
| Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 截留分子量 |
| VWR 轻型擦拭纸 | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D 超声波清洗机 | VWR International | 13089 | |
| 纯水仪 | Barnstead | D11931 | |
| 酵母 | ThermoFisher | BP1422 | |
| β-辛基葡萄糖苷 | Anatrace | O311S |
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