病原菌生长的定量分析是表征多种Arabidopsis thaliana（以下简称：拟南芥）免疫反应的有力工具。本文所述方法提供了一种优化的注射浸润实验，用于定量测定丁香假单胞菌致病变种（Pseudomonas syringae pv. maculicola）ES4326 在成年拟南芥叶片中的增殖情况。
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本文内容
摘要
摘要
在缺乏特化移动免疫细胞的情况下，植物通过局部程序性细胞死亡和系统性获得抗性来抵御病原体侵袭。通过检测感染组织内病原菌的生长情况，可对特定拟南芥基因在整体植物免疫反应中的作用进行特异且定量的评估。三十多年来，半活体营养型细菌 Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326）已被广泛用作研究拟南芥免疫反应分子机制的模式病原菌。为了将病原菌导入叶片组织，已建立了多种接种方法， 例如， 注射浸润、浸渍接种、喷雾、真空浸润和淹水接种。以下方案描述了一种优化的注射浸润方法，用于递送毒力菌株 Psm 将ES4326接种至成年土壤培养的拟南芥植株叶片中，并准确筛选对该病原菌增强的感病性（EDS）。此外，本实验方案可结合多种预处理方法，以进一步解析植物防御不同层次中特定的免疫缺陷，包括水杨酸（SA）诱导的免疫（STI）和微生物相关分子模式诱导的免疫（MTI）。
引言
由于植物的固着生长特性，它们 constantly 面临着大量具有不同生活方式和营养策略的病原体威胁1。从初步分类来看，活体营养型病原体通过维持寄主存活来获取营养，而死体营养型病原体则主动分泌毒素和酶以杀死寄主组织，并以死亡细胞为食1。另一类被称为半活体营养型的病原体，在侵染初期表现为活体营养阶段，当病原体积累达到一定阈值后，便转变为死体营养阶段2。为了有效抵御这些微生物，植物进化出复杂的先天免疫系统，该系统配备多种监控机制，可识别病原体侵袭并触发局部程序性细胞死亡3以及系统性获得抗性（SAR）4。目前的研究重点在于解析植物免疫系统中关键的信号组分及其相互之间的信号串扰5。
根据“之字形”模型5，植物先天免疫反应的第一层需要质膜定位的模式识别受体（PRRs）来识别微生物的入侵。PRRs能够识别微生物相关分子模式（MAMPs），并建立MAMP触发的免疫反应（MTI）6。除了诱导编码抗菌PR蛋白的基因发生转录上调7外，MTI还会引发多种抑制病原体生长的事件，包括活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的产生、胼胝质在细胞壁上的沉积，以及多个激酶信号通路的激活8。
迄今为止，已在拟南芥中鉴定出多种可触....
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方案
以下文本描述了在拟南芥中进行优化的Psm ES4326 注射式渗入实验的逐步操作方案。该实验的主要步骤以简化的流程图表示（图1）。
1. 植物生长条件
- 播种
- 准备2个花盆（直径4英寸 ，高3.75英寸 ），松散地装入土壤，并通过从底部浸泡过夜（O/N）的方式浇水，之后排去多余水分。
- 使用折叠的70 mm称量纸或其他纸张，将50–100粒拟南芥种子（野生型Col-0或npr1-1突变体）播种于每个花盆中。
- 用喷水后的透明罩盖住花盆，使相对湿度升至80–90%（图2A）。
- 将花盆置于4 °C条件下孵育72小时，以完成充分的层积处理并实现同步萌发。
- 将花盆转移至标准生长条件（12小时光照/12小时黑暗，21 °C，光照强度100 µmol/m2/sec，相对湿度40%），以促进种子萌发。转移至生长室后应立即在透明罩上开裂出一个2–3英寸 的开口，以避免水分凝结。
- 当第一片真叶长度达到2–3 mm时，将幼苗从花盆移栽至装有土壤的72孔育苗盘中。
- 用手指或1 ml 移液器吸头在育苗盘土壤表面中央压出一个深约1英寸 ....
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结果
我们在此描述的方案代表了一种优化的 P. syringae 通过注射浸润法定量评估拟南芥植株的免疫反应。如图所示 图1，注射器浸润法 Psm ES4326 之后进行病原体提取与定量 通过 系列稀释与菌落计数
如方案文本中第3步所述，可通过接种OD值为0.0002的菌液来评估对Psm ES4326的增强疾病敏感性（EDS）。如图3所示，高度敏感的npr1-1突变体中的病原菌生长量比野生型Col-0植株高出约2.5 log（即300倍）。根据实验条件的不同，npr1-1植株中的细菌生长量可能比Col-0高出最多达3.0 log，通常结果范围在1.5–2.5 log之间。因此，该EDS检测方法提供了较宽的差异窗口，研究人员可借此对拟南芥突变体和转基因植株进行比较，以鉴定可能参与植物免疫反应的候选基因。
除了确定EDS外，Psm ES4326 .......
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讨论
随着可用耕地减少和人口增长，全球研究人员面临着作物改良的紧迫需求。作物产量会受到多种生物和非生物胁迫的显著影响。其中，病原体感染是导致作物减产的主要原因之一，仅在美国就造成了约12%的产量损失45。为解决这一问题，科研人员已在模式植物拟南芥—P. syringae 病害系统中开展了大量研究，以全面表征植物免疫反应的组分及其调控机制。本文介绍了一种优化的P. syringae ES4326 注射式侵染实验方法，可用于在整株植物水平上定量评估植物免疫反应中的细微差异。
尽管已有多种病原体感染实验用于表征植物免疫反应29,35，但注射器渗入法提供了一个高度可控的系统，可将等量的病原体接种至感染组织中。在其他感染实验中，包括浸染接种和喷雾接种，病原体会被施加到整个地上部分组织，包括子叶和真叶34。已有报道指出，在浸染接种实验中，生态型Landsberg erecta（Ler）的子叶对病原体更为敏感，这可能导致数据偏差，从而对整体抗病性得出错误结.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Shahid Mukhtar博士对文稿的批评指正，以及Xinnian Dong博士提供的样本数据分析文件。本工作由美国国家科学基金会职业奖（NSF-CAREER，项目号IOS-1350244）和阿拉巴马大学伯明翰分校生物系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| 大号花盆 | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 插盘 | Grosouth | LM1206 | |
| 无孔 11x21 育苗盘 | Grosouth | LM1020 | |
| 带孔 11x21 育苗盘 | Grosouth | LM1020H | |
| 乙烯基育苗罩 | Grosouth | CW-221 | |
| 蛋白胨 | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| 磷酸氢二钾三水合物 | MP Biomedicals | 151946 | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | A360-500 | |
| 硫酸链霉素 | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm 培养皿 | Fisher Scientific | R80150 | |
| 矩形培养皿 | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 六水合物 | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| 甘油 | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml 注射器 | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| 吸水纸巾（Kimwipe） | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| 研磨管 | Denville Scientific | B1257 | |
| 研磨管盖 | Denville Scientific | B1254 | |
| 不锈钢研磨珠 | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96 孔板 | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| 水杨酸钠 | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | 定制合成 | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | 定制合成 | |
| 打孔器 | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus 核酸蛋白测定仪 | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen 高通量匀浆器 | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin 微型离心机 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| 多通道移液器 (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| 多通道移液器 (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| 移液器 (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| 移液器吸头 | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie 永久性记号笔 | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml 离心管 | Eppendorf | 22363204 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 08-890 |
参考文献
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 ....
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重印与许可
