三维成像与分析人表皮内神经纤维中的线粒体

摘要

本方案采用三维（3D）成像与分析技术，用于可视化并定量神经特异性线粒体。该技术适用于其他利用一种荧光信号从另一种荧光信号中分离出特定数据子集的情况。

摘要

本实验方案的目标是研究表皮内神经纤维中的线粒体。为此，开发了三维成像与分析技术，以分离神经特异性的线粒体，并评估感觉神经远端末端因疾病引起的线粒体改变。该方案结合荧光免疫组织化学、共聚焦显微镜和三维图像分析技术，用于可视化并定量神经特异性的线粒体。整个操作流程中均定义了详细的参数，以提供一个具体示例，说明如何利用这些技术分离神经特异性的线粒体。使用抗体对皮肤钻孔活检组织切片中的神经和线粒体信号进行标记，随后通过间接免疫荧光分别以绿色和红色荧光信号显示神经和线粒体。利用共聚焦显微镜获取Z系列图像，并使用三维分析软件对信号进行处理与分析。无需严格遵循本文所述的精确参数，但在染色、图像采集和分析各步骤中，所选参数必须保持一致。本方案的优势在于其适用于多种情况，即利用一种荧光信号来分离其他原本无法单独研究的信号。

引言

线粒体具有多种重要的细胞功能，包括产生细胞能量、缓冲钙离子，以及调控坏死性和凋亡性细胞死亡^1,2,3。与机体其他部位相比，神经系统具有较高的代谢率⁴，这表明神经元主要通过线粒体呼吸作用产生大量以三磷酸腺苷（ATP）形式存在的细胞能量。大量证据表明，神经元功能依赖于ATP⁵，尤其是在突触部位⁶。因此，线粒体在神经元内的分布至关重要。

在过去的10年中，大量研究结果表明，神经元线粒体的运输和锚定受到高度调控。分子马达蛋白参与将线粒体分布到神经元内特定的细胞区室中。线粒体的运输尤为重要，因为神经元的轴突和树突远离胞体。驱动蛋白（kinesin）马达蛋白主要介导线粒体沿微管进行顺向运输（即远离胞体），而动力蛋白（dynein）马达蛋白则介导逆向运动（即朝向胞体）^7,8,9,10。细胞内的某些信号，如线粒体膜电位和冲动传导，会影响线粒体运输的存在及其方向^11,12,13。

除了运输线粒体外，还存在一些特化蛋白，可将线粒体定位于能量需求较高的特定细胞区域，例如郎飞结和突触^8,14,17。事实上，轴突内的大多数线粒体并不具有运动性^9,13,18。诸如Syntaphilin之类的特化蛋白可将线粒体锚定在轴突的微管上，而其他蛋白则将线粒体锚定在肌动蛋白细胞骨架上^19-21。已有研究报道，生长因子和钙离子等可促进线粒体运动的停止，从而将其定位于所需区域^21,22,23。

综上所述，线粒体的运输和锚定对于神经元的正常功能至关重要。支持这一观点的是，线粒体运输障碍已与多种神经系统疾病相关，包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症、亨廷顿病、遗传性痉挛性截瘫以及视神经萎缩^{15,24,25,26,27}。近期研究聚焦于线粒体功能障碍和病理改变，认为这可能是糖尿病性神经病变（即糖尿病相关的感知功能丧失）的潜在机制^{28,29,30,31,32,33}。该假说认为，糖尿病会改变皮肤神经末梢感觉投射中线粒体的分布。因此，研究人员开发了一种技术，用于可视化并定量分析表皮内神经纤维（IENFs）——即背根神经节感觉传入纤维远端末梢——中的线粒体。该技术结合了特异性线粒体和神经纤维标记物的荧光免疫组织化学染色、共聚焦显微镜z轴序列信号采集，以及强大的三维图像分析软件，从而实现对人类皮肤钻孔活检样本中神经特异性线粒体分布的定量测量。

方案

皮肤钻孔活检样本取自在美国犹他大学糖尿病中心（盐湖城，犹他州）的一个大型基于社区的初级医疗网络中招募的受试者。本研究经密歇根大学机构审查委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的伦理原则。在检测前，已从每位受试者处获得书面知情同意书。

1. 荧光免疫组织化学

1. 准备皮肤活检组织用于表皮内神经纤维免疫组织化学染色：
   1. 由医务人员进行3 mm皮肤活检，并将完整活检组织置于1.5 mL Zamboni固定液（含2%多聚甲醛、0.3%饱和苦味酸的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）中，4 °C条件下固定过夜。
   2. 用含30%蔗糖的PBS溶液在4 °C条件下漂洗样本16–24小时，或直至样本沉底。
   3. 使用冷冻模具将样本包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中。将3 mm活检组织表皮面朝下放入模具，加入约2 mL OCT填充模具。将模具置于碎干冰上速冻，随后于-80 °C保存备用。
   4. 使用冷冻切片机切取50 µm厚的横切片，每张切片置于96孔板的独立孔中，每孔加入180 µL防冻保存液（含30%乙二醇、30%甘油的PBS溶液）。以下操作以96孔板中的8个孔为例。对来自同一活检部位、彼此间隔200–300 µm的切片进行染色。

第1天：

2. 淬灭角质层的非特异性标记：
   1. 按照 图1 所示标记96孔板。
   2. 向每个孔中加入150 µL的信号增强剂储备液，以减少二抗的非特异性结合^34,35。使用接种环将组织切片转移至信号增强剂溶液中。
      注意：操作组织时需小心，避免损伤或撕裂组织切片。将切片在室温下置于平动摇床上的信号增强剂溶液中孵育30分钟。
   3. 在96孔板的第2和第3行中准备漂洗孔，每孔加入150 µL的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
   4. 小心地将切片转移至第2行，在1× PBS中室温漂洗10分钟。
   5. 再次在1× PBS中室温漂洗10分钟（第3行）。
3. 配制5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液：
   1. 在组织切片于信号增强剂溶液中孵育的同时，配制含5% BSA和0.3% Triton X-100（TX-100）的0.1 M PBS封闭液（见 表1）。BSA不易溶解，需涡旋振荡至完全溶解。
   2. 在96孔板的第4行中准备封闭孔，每孔加入150 µL的5% BSA封闭液。
   3. 将组织切片分别转移至含有5% BSA封闭液的各孔中，并在室温下于平动摇床上孵育1–2小时。
4. 配制1% BSA漂洗液及一抗稀释液：
   1. 在组织切片于5% BSA封闭液中孵育的同时，配制含1% BSA和0.3% TX-100的0.1 M PBS漂洗液（见 表2）。BSA不易溶解，需涡旋振荡至完全溶解。
   2. 在1% BSA漂洗液中稀释一抗，同时组织切片仍在5% BSA封闭液中孵育。
      1. 配制1,500 µL的一抗溶液，并加入第5行各孔中。
      2. 稀释一抗：使用神经特异性标记物——兔多克隆抗蛋白基因产物9.5抗体（PGP9.5），按1:1,000稀释；使用线粒体特异性标记物——鼠单克隆抗丙酮酸脱氢酶E2/E3bp抗体（PDH），按1:100稀释于1% BSA漂洗液中。
5. 加一抗：
   1. 向96孔板第5行的每个孔中加入150 µL一抗溶液。
   2. 使用环状工具将组织切片从封闭液（第4行）转移至含一抗的第5行孔中。
   3. 用封口膜严密包裹整块板，防止干燥。
   4. 将样品置于室温下的平动摇床上孵育1小时，随后在4 ºC下于平动摇床上过夜孵育。

第2天：

6. 清洗样本：
   1. 在96孔板的第6、7、8行中准备清洗孔，每孔加入150 µL 1% BSA清洗液。
   2. 将组织切片转移至第一轮1% BSA清洗液（第6行），室温孵育1小时。随后在第7和第8行的1% BSA清洗液中各再孵育1小时，共重复清洗两次。
7. 用1% BSA清洗液稀释二抗：
   1. 当组织切片正在最后一轮1% BSA清洗液（第8行）中孵育时，配制1,500 µL二抗溶液。
   2. 稀释二抗：PGP9.5使用绿色荧光标记的山羊抗兔抗体（1:1000），PDH使用红色荧光标记的山羊抗鼠抗体（1:1,000），均用1% BSA清洗液稀释。
8. 准备二抗孵育：
   1. 用移液器将150 µL二抗溶液加入96孔板第9行各孔中。
   2. 轻柔地将组织切片从1% BSA清洗液（第8行）转移至含二抗的孔（第9行）。
   3. 用封口膜严密包裹整块板以防止干燥，并用铝箔纸包裹避光。将样本置于水平摇床上室温孵育1小时，随后于4 ˚C在水平摇床上避光过夜孵育。

第3天：

9. 通过0.22 µm滤膜过滤制备洁净的1×PBS：
   1. 将150 µL过滤后的1×PBS加入第10、11和12行。
   2. 将样品转移至第10行，在室温下用1×PBS漂洗1小时。用铝箔覆盖96孔板，并将其置于平动摇床上进行漂洗。随后在第11和12行中，于室温下再用过滤后的1×PBS重复漂洗两次，每次1小时。
10. 准备用于封片组织切片的显微镜载玻片：
    1. 在载玻片上放置50 µL过滤后的1×PBS。
    2. 将切片从1×PBS（第12行）转移至该50 µL液滴中。通过展开组织并轻轻压平，将切片准确置于PBS液滴中。使用玻璃移液管去除多余的PBS，以避免稀释封片试剂。切勿用玻璃吸头接触切片。
    3. 小心地将1–2滴含DAPI的封片试剂直接滴加在载玻片上的切片表面，注意不要扰动切片的方向。轻轻将一块50 mm × 24 mm、厚度为#1.5的显微镜玻璃盖玻片覆盖在切片上。
    4. 排除盖玻片下产生的气泡，并擦去盖玻片边缘的多余液体。准备新的载玻片，并对每个切片重复上述封片过程。
    5. 将载玻片置于暗处室温过夜，使封片介质固化/干燥。随后将载玻片转移至4 °C短期保存（1–2周），或转移至-20 °C长期保存（超过2周）。
       注：阴性对照在步骤1.4.2.2中省略了PGP9.5或PDH的一抗，结果显示表皮中的神经或线粒体均无明显标记信号。针对PDH抗体进行了阳性对照实验，以证实其可标记所有线粒体（数据未显示）。阳性对照使用原代培养的小鼠背根神经节神经元，这些细胞通过杆状病毒转导表达绿色荧光蛋白（GFP）以标记线粒体，随后固定并用PDH抗体及红色荧光二抗染色。所有表达GFP的线粒体均与PDH免疫组织化学的红色标记共定位（数据未显示）。

2. 共聚焦成像

1. 进行共聚焦成像：
   1. 使用倒置显微镜上的激光扫描共聚焦显微镜，配备40倍油浸物镜（数值孔径（N.A.）为1.25），采集图像。
      1. 在每个焦平面上依次采集荧光信号：
         细胞核：激发波长 λ = 405 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 420 - 480 nm
         神经纤维：激发波长 λ = 488 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 505 - 560 nm
         线粒体：激发波长 λ = 543 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 606 - 670 nm
   2. 在显微镜软件中输入以下扫描参数：扫描速率为600 Hz，帧均值为2，放大倍数为2.2；强度分辨率为12位（4096个灰度级）。
      1. 设置显微镜软件以优化横向分辨率（扫描分辨率为1,024 × 1,024）和轴向分辨率/光学切片能力（共聚焦孔径为1艾里单位（AU），z轴步长为210 nm）。
         注：最终的XYZ分辨率为172.2 nm × 172.2 nm × 210 nm，图像尺寸为176.1 µm × 176.1 µm × 30–50 µm。
   3. 对神经信号（绿色荧光）启动实时扫描，并调节显微镜软件中的z轴聚焦控制，确定并设定包含组织切片内神经信号的上下焦平面。对于50 µm厚的组织切片，z轴总范围通常为30–50 µm。
   4. 在实时扫描过程中，使用显微镜软件旋转扫描视野，使表皮在图像中呈水平或垂直方向排列。
   5. 分别扫描每种信号，并调节探测器（光电倍增管，PMT）的电压和偏移，以最小化或消除过饱和和欠饱和像素。
      注：使用上述参数的扫描时间约为20–40分钟，具体取决于z轴切片的数量。

3. 人类表皮内神经纤维中线粒体的三维可视化与分析

1. 分离三维表皮：
   1. 复制原始图像，并使用该图像的最大强度投影（扩展焦面视图）来识别和分离表皮。
   2. 使用感兴趣区域工具沿表皮的上、下边缘进行勾画，以去除不含表皮内神经纤维的角质层和真皮等不需要的区域。按此选择进行裁剪。
2. 对神经和线粒体荧光信号进行去卷积处理：
   注意：去卷积有助于恢复荧光信号的完整性。本方案中使用的恢复方法称为盲去卷积，因其利用图像中的荧光信号来确定信号从原始来源扩散的程度（点扩散函数）。该过程通过将扩散的信号重新分配至其原始位置，从而提高信号分辨率。
   1. 使用以下参数计算绿色荧光神经信号（green-fluorescence）的点扩散函数（point spread function, PSF）：
      1. 将计算得到的点扩散函数（PSF）设为共聚焦模式。将介质折射率设为1.515，数值孔径设为1.25。将探测器针孔设为1个艾里单位（A.U.）。激光激发波长设为488 nm，发射波长设为515 nm。
   2. 使用以下参数计算红色荧光线粒体信号（red-fluorescence）的点扩散函数（PSF）：
      1. 将计算得到的点扩散函数（PSF）设置为共聚焦模式。将介质折射率设为1.515，数值孔径设为1.25。将探测器针孔设为1 AU。激光激发波长设为543 nm，发射波长设为617 nm。
   3. 使用上述对应的点扩散函数（PSFs），通过去卷积优化神经和线粒体的荧光信号，设置迭代恢复参数为100%置信度，迭代次数上限为10个循环。
3. 创建神经特异性表面：
   1. 使用 "创建表面" 用于从PGP9.5标记的神经经去卷积绿色荧光二次标记后生成神经的实心表面结构的工具。
   2. 取消选中 "平滑" 特征并使用绝对强度特征来设定神经信号的阈值，因为其亮度显著高于背景荧光。
   3. 使用绝对强度功能来设定神经信号的阈值，因为神经信号明显比背景荧光更强。将阈值设置得足够低，以准确识别神经。
   4. 根据大小过滤掉较小的非神经表面。
      注意：如有必要，手动去除神经外的其他非神经表面 "编辑" 按住 CONTROL 键以同时选中多个对象，然后按 Delete 键将其删除。
4. 分离神经特异性荧光线粒体信号：
   1. 选择神经表面的编辑选项卡以查看 "口罩特性" 特征。步骤3.3中生成的神经表面用于将神经内的线粒体与角质形成细胞相关的线粒体信号分离开来。
   2. 随着 "“遮罩全部”按钮可打开一个 "掩膜通道" 窗口中，从下拉菜单中选择去卷积后的红色荧光信号 "通道选择" 用于线粒体信号。
   3. 单击该框以添加勾选标记 "应用遮罩前复制通道" 选项
   4. 点击其前方的单选按钮 "恒定的内外环境" 遮罩设置的选项，然后单击复选框以添加勾选标记 "将表面外部的体素设置为" 选项并输入值 0.00。单击“确定”按钮，创建代表神经表面内线粒体信号的新通道。
5. 创建线粒体特异性表面：
   1. 使用 "创建表面" 用于从步骤 3.4 获得的神经元特异性线粒体荧光信号新通道中，构建线粒体的实心表面模型的工具
   2. 取消勾选 "平滑" 特征并选择 "背景扣除" 使用该功能设置阈值。此功能利用线粒体信号周围局部对比度，从背景中识别线粒体。
   3. 将阈值设置得足够低，以准确识别线粒体。在此示例中，对于16位（65,536）的灰度范围，下限阈值设置为2,000。
   4. 根据大小筛选线粒体表面。在此示例中，体素阈值设置为1.0体素，这是可设置的最低限值。如有必要，可手动删除线粒体内部的非线粒体表面 "编辑" 按住 CONTROL 键以选择多个对象，然后按 Delete 键将其删除。
      注意：有时软件会生成与可识别的荧光线粒体信号无关的表面结构。在此类情况下，可通过以下方法将其去除 "编辑" 表。
6. 导出并计算形态测量值以进行分析：
   1. 从神经和线粒体表面导出数值 "统计学" 用于电子表格软件的进一步分析标签
   2. 导出神经和线粒体表面的体积值。
   3. 统计每张图像中单个神经纤维的数量，并将数值记录在电子表格中。
   4. 对于每张图像，计算以下可用于电子表格分析的潜在数值：
      1. 将所有神经表面的体积相加。
      2. 过滤掉体积小于 0.02 µm 的神经特异性线粒体表面³ 按尺寸对表面进行分级。例如，使用以下分级范围：0.02–0.04、0.04–0.08、0.08–0.16、0.16–0.32、0.32–0.64、0.64–1.28、1.28–2.56、大于 2.56 µm³.
         注意：线粒体体积的下限设定为 0.02 µm³ 基于已发表的线粒体体积数据^36,37,38.
      3. 统计每个区间内神经特异性线粒体表面的数量以及各区间的表面总数（0.02 - 大于 2.56 µm）³).
      4. 计算每个区间的神经特异性线粒体表面所占比例。使用每个区间内的计数除以线粒体表面总数。
      5. 汇总所有神经特异性线粒体表面的体积。
      6. 通过将神经的总表面积体积除以所有线粒体表面积体积之和，计算具有线粒体信号的神经所占比例。
      7. 通过将神经总体积除以线粒体表面总数，计算单位神经体积内的线粒体数量。

结果

人IENF中线粒体的可视化与定量

荧光免疫组织化学技术可对人皮肤活检样本中的多种信号进行同时标记，以可视化神经、线粒体和细胞核。使用96孔板可方便地组织免疫组织化学实验的各个步骤。图1显示，该配置最多可同时处理8个组织切片，经历12个不同的溶液阶段。游离漂浮法结合平摇仪的轻柔振荡，可确保抗体充分接触并从两侧穿透组织切片。该实验方案需3天完成，主要原因是需在4 °C条件下对一抗和二抗进行过夜孵育，从而稳定地标记神经和线粒体。

后续步骤包括荧光信号的成像、处理与分析。共聚焦显微镜利用荧光信号，通过消除离焦信号，实现对焦平面内离散信号的光学切片。对组织切片进行Z轴序列图像采集，可获得神经、线粒体和细胞核荧光信号的三维图像。成像参数经过优化，可覆盖...

讨论

本方案旨在从人类皮肤活检样本中分离、定量并分析三维皮肤内神经末梢纤维（IENF）内神经特异性线粒体的大小和分布。该方案包含若干关键步骤。游离漂浮式荧光免疫组织化学技术旨在对每个样本中的多个信号进行染色和分析，从而为探索性研究提供更灵活的方法^44,45。该程序可使抗体充分渗透至组织内部，从而最大限度地获取整个50 µm切片内的图像信息，这对于共聚焦显微镜成像和三维分析至关重要。另一个关键步骤是图像采集参数的设置，需在每幅图像中捕获足够数量的神经纤维与保持线粒体测量所需分辨率之间取得平衡。本方案及标准皮肤活检方案所用组织切片长度约为3 mm^45,46,47,48。本方案所述的采集参数可覆盖足够的表皮区域，使每幅图像平均包含4–6条神经纤维。若以更高分辨率采样，将显著减少每...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% Zamboni固定液	Newcomer Supply, Middleton, WI	1459A	含2%多聚甲醛、0.2%饱和苦味酸的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	用于配制1x PBS
Image-iT FX 信号增强剂	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	通过减少非特异性结合来增强Alexa Fluor染料信号
抗蛋白基因产物9.5抗体（兔多克隆）	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	缩写为PGP9.5，替代已停产的AbD Serotec（货号7863-0504）抗体
抗丙酮酸脱氢酶E2/E3bp抗体（小鼠单克隆）	abcam, Cambridge, MA	ab110333	缩写为PDH
山羊抗小鼠二抗Alexa Fluor 594偶联物	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	红色荧光偶联二抗
山羊抗兔二抗Alexa Fluor 488偶联物	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	绿色荧光偶联二抗
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	缩写为BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	缩写为TX-100
0.22 µm 滤膜	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0.22 µm Millipore滤膜
Parafilm M封口膜	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M（PM-996）
非校准接种环	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	Decon LeLoop接种环（MP 199-25）
96孔检测板	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96孔平底板
含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	用于细胞核的DAPI染色
显微镜盖玻片 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	盖玻片
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	显微镜载玻片
Leica SP5 激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	共聚焦显微镜
Volocity x64 软件	Perkin Elmer, Waltham , MA	版本 4.4.0	Volocity软件用于实验方案中第3.1和3.2步的图像处理
Imaris x64 三维分析软件	Bitplane, Concord, MA	版本 7.7.1	Imaris软件用于实验方案中第3.3至3.5步的图像分析
Excel	Microsoft, Redmond, WA	Office 2013 版本	Excel电子表格软件用于实验方案第3.6步，汇总形态计量学特征
最佳切割温度包埋剂	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	缩写为OCT
Leica 冷冻切片机	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	用于切割50 µm 厚的组织切片
CellLight 线粒体-GFP，BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	作为阳性对照，用绿色荧光标记线粒体