三维成像与分析人表皮内神经纤维中的线粒体

摘要

本方案采用三维（3D）成像与分析技术，用于可视化并定量神经特异性线粒体。该技术适用于其他利用一种荧光信号从另一种荧光信号中分离出特定数据子集的情况。

摘要

本实验方案的目标是研究表皮内神经纤维中的线粒体。为此，开发了三维成像与分析技术，以分离神经特异性的线粒体，并评估感觉神经远端末端因疾病引起的线粒体改变。该方案结合荧光免疫组织化学、共聚焦显微镜和三维图像分析技术，用于可视化并定量神经特异性的线粒体。整个操作流程中均定义了详细的参数，以提供一个具体示例，说明如何利用这些技术分离神经特异性的线粒体。使用抗体对皮肤钻孔活检组织切片中的神经和线粒体信号进行标记，随后通过间接免疫荧光分别以绿色和红色荧光信号显示神经和线粒体。利用共聚焦显微镜获取Z系列图像，并使用三维分析软件对信号进行处理与分析。无需严格遵循本文所述的精确参数，但在染色、图像采集和分析各步骤中，所选参数必须保持一致。本方案的优势在于其适用于多种情况，即利用一种荧光信号来分离其他原本无法单独研究的信号。

引言

线粒体具有多种重要的细胞功能，包括产生细胞能量、缓冲钙离子，以及调控坏死性和凋亡性细胞死亡^1,2,3。与机体其他部位相比，神经系统具有较高的代谢率⁴，这表明神经元主要通过线粒体呼吸作用产生大量以三磷酸腺苷（ATP）形式存在的细胞能量。大量证据表明，神经元功能依赖于ATP⁵，尤其是在突触部位⁶。因此，线粒体在神经元内的分布至关重要。

在过去的10年中，大量研究结果表明，神经元线粒体的运输和锚定受到高度调控。分子马达蛋白参与将线粒体分布到神经元内特定的细胞区室中。线粒体的运输尤为重要，因为神经元的轴突和树突远离胞体。驱动蛋白（kinesin）马达蛋白主要介导线粒体沿微管进行顺向运输（即远离胞体），而动力蛋白（dynein）马达蛋白则介导逆向运动（即朝向胞体）^7,8,9,10。细胞内的某些信号，如线粒体....

方案

皮肤钻孔活检样本取自在美国犹他大学糖尿病中心（盐湖城，犹他州）的一个大型基于社区的初级医疗网络中招募的受试者。本研究经密歇根大学机构审查委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的伦理原则。在检测前，已从每位受试者处获得书面知情同意书。

1. 荧光免疫组织化学

1. 准备皮肤活检组织用于表皮内神经纤维免疫组织化学染色：
   1. 由医务人员进行3 mm皮肤活检，并将完整活检组织置于1.5 mL Zamboni固定液（含2%多聚甲醛、0.3%饱和苦味酸的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）中，4 °C条件下固定过夜。
   2. 用含30%蔗糖的PBS溶液在4 °C条件下漂洗样本16–24小时，或直至样本沉底。
   3. 使用冷冻模具将样本包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中。将3 mm活检组织表皮面朝下放入模具，加入约2 mL OCT填充模具。将模具置于碎干冰上速冻，随后于-80 °C保存备用。
   4. 使用冷冻切片机切取50 µm厚的横切片，每张切片置于96孔板的独立孔中，每孔加入180 µL防冻保存液（含30%乙二醇、30%甘油的PBS溶液）。以下操作以96孔板中的8个孔为例。对来自同一活检部位、彼此间隔200–300 µm的切片进行染色。

第1天：

结果

人IENF中线粒体的可视化与定量

荧光免疫组织化学技术可对人皮肤活检样本中的多种信号进行同时标记，以可视化神经、线粒体和细胞核。使用96孔板可方便地组织免疫组织化学实验的各个步骤。图1显示，该配置最多可同时处理8个组织切片，经历12个不同的溶液阶段。游离漂浮法结合平摇仪的轻柔振荡，可确保抗体充分接触并从两侧穿透组织切片。该实验方案需3天完成，主要原因是需在4 °C条件下对一抗和二抗进行过夜孵育，从而稳定地标记神经和线粒体。

后续步骤包括荧光信号的成像、处理与分析。共聚焦显微镜利用荧光信号，通过消除离焦信号，实现对焦平面内离散信号的光学切片。对组织切片进行Z轴序列图像采集，可获得神经、线粒体和细胞核荧光信号的三维图像。成像参数经过优化，可覆盖.......

讨论

本方案旨在从人类皮肤活检样本中分离、定量并分析三维皮肤内神经末梢纤维（IENF）内神经特异性线粒体的大小和分布。该方案包含若干关键步骤。游离漂浮式荧光免疫组织化学技术旨在对每个样本中的多个信号进行染色和分析，从而为探索性研究提供更灵活的方法^44,45。该程序可使抗体充分渗透至组织内部，从而最大限度地获取整个50 µm切片内的图像信息，这对于共聚焦显微镜成像和三维分析至关重要。另一个关键步骤是图像采集参数的设置，需在每幅图像中捕获足够数量的神经纤维与保持线粒体测量所需分辨率之间取得平衡。本方案及标准皮肤活检方案所用组织切片长度约为3 mm^45,46,47,48。本方案所述的采集参数可覆盖足够的表皮区域，使每幅图像平均包含4–6条神经纤维。若以更高分辨率采样，将显著减少每.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% Zamboni固定液	Newcomer Supply, Middleton, WI	1459A	含2%多聚甲醛、0.2%饱和苦味酸的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	用于配制1x PBS
Image-iT FX 信号增强剂	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	通过减少非特异性结合来增强Alexa Fluor染料信号
抗蛋白基因产物9.5抗体（兔多克隆）	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	缩写为PGP9.5，替代已停产的AbD Serotec（货号7863-0504）抗体
抗丙酮酸脱氢酶E2/E3bp抗体（小鼠单克隆）	abcam, Cambridge, MA	ab110333	缩写为PDH
山羊抗小鼠二抗Alexa Fluor 594偶联物	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	红色荧光偶联二抗
山羊抗兔二抗Alexa Fluor 488偶联物	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	绿色荧光偶联二抗
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	缩写为BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	缩写为TX-100
0.22 µm 滤膜	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0.22 µm Millipore滤膜
Parafilm M封口膜	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M（PM-996）
非校准接种环	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	Decon LeLoop接种环（MP 199-25）
96孔检测板	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96孔平底板
含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	用于细胞核的DAPI染色
显微镜盖玻片 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	盖玻片
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	显微镜载玻片
Leica SP5 激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	共聚焦显微镜
Volocity x64 软件	Perkin Elmer, Waltham , MA	版本 4.4.0	Volocity软件用于实验方案中第3.1和3.2步的图像处理
Imaris x64 三维分析软件	Bitplane, Concord, MA	版本 7.7.1	Imaris软件用于实验方案中第3.3至3.5步的图像分析
Excel	Microsoft, Redmond, WA	Office 2013 版本	Excel电子表格软件用于实验方案第3.6步，汇总形态计量学特征
最佳切割温度包埋剂	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	缩写为OCT
Leica 冷冻切片机	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	用于切割50 µm 厚的组织切片
CellLight 线粒体-GFP，BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	作为阳性对照，用绿色荧光标记线粒体