使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

摘要

本文介绍了使用R26R-Confetti小鼠进行多色谱系示踪实验的设计与操作原理，并提供了一种针对角膜上皮细胞追踪的具体实验方案，该方案可经修改后适用于其他感兴趣的组织。

摘要

谱系示踪实验用于确定特定组织或生物体中细胞的起源、命运及行为。该技术已成功应用数十年，在发育生物学领域揭示了诸多重要发现。近年来，干细胞生物学家采用该技术，在几乎无需人工干预的情况下识别并追踪不同类型的干细胞群体。随着小鼠遗传学的最新进展、大量可用的小鼠品系以及荧光显微镜技术的进步，研究者如今仅需具备基础的专业知识，并利用市售工具，即可为多种组织设计出高效而直接的谱系示踪系统。我们近期利用这一强大方法，结合R26R-Confetti小鼠模型，探索了眼表干细胞的起源与命运。该模型提供了一种多色遗传系统，可随机表达四种荧光基因。本文阐述了该方法的基本原理，并提供了一套可灵活调整的实验设计流程，不仅适用于角膜上皮，也可推广至其他组织。

引言

在胚胎发育过程中，组织和器官的形态发生通过一个精确的程序进行，该程序可以用细胞增殖、细胞迁移和谱系特化来描述^1-4。这些生物学过程也参与维持成体组织的稳态，而这一过程需要干细胞的再生。谱系示踪技术通过识别和追踪特定类型细胞群体的后代，为研究胚胎发生和干细胞稳态提供了重要工具。事实上，该技术正被越来越多地应用于多个研究领域。特别是，谱系示踪已成为确定干细胞在稳态及癌症发展过程中起源与命运的关键工具。这是因为该方法能够在完整组织或生物体的背景下，以最少的实验干预揭示细胞的行为信息，相比之下，细胞分离以及in vitro培养或移植则可能引入不必要的偏差。

传统上，人们使用脂溶性碳菁类染料等染料进行谱系示踪，这类染料可掺入细胞的质膜中。尽管此类实验已成功推动了发育生物学领域的重要发现并奠定了奠基性的概念^5,6，但仍存在一些局限性，包括难以控制靶向细胞的特异性、染料对细胞行为的非预期影响，以及标记信号随时间推移而稀释等问题。核苷酸类似物标记方法使得研究者能够记录“标记保留细胞”的存在，这些细胞被认为是处于静息状态的干细胞^7,8。然而，尽管该技术可根据有限时间段内的增殖动力学证明慢周期细胞的存在，却无法提供关于干细胞功能的实质性见解。理想的谱系示踪方法应尽量减少标记对被标记细胞本身、其子代细胞或邻近细胞特性的影响。此外，若能对标记诱导过程进行控制，即能够在特定发育阶段和时间点、以单细胞（克隆）方式标记目标细胞群体，将具有显著优势。一种稳定且不可逆的标记方法至关重要，该方法应能将标记传递给起始细胞的所有子代，从而确保标记随时间长期保留，并且不会转移至邻近细胞。

最近，发展出了基于遗传学的细胞标记方法。在这些系统中，可利用细胞特异性启动子驱动Cre重组酶的表达，从而移除两侧带有loxP位点的阻断序列，启动报告基因（如绿色荧光蛋白）的表达 Β-半乳糖苷酶报告基因^9-13该方法不仅能够追踪细胞及其子代，还可实现细胞的分离与分子表征。通过诱导单个荧光报告基因的表达，可在单细胞水平实现细胞追踪。该系统的一个重要局限在于，只有当极低比例的细胞被标记时，才能有效分离并追踪单个克隆。为克服这一局限，可采用多色报告系统。使用多色标记时，可高效追踪同一微环境中相邻细胞的不同命运。^14-17最近，已开发出多种用于谱系示踪实验的Brainbow（Br）等位基因，这些等位基因利用Cre/lox系统实现多个荧光报告基因的随机表达。Cre/lox系统包含Cre重组酶，该酶可识别并结合特定的DNA序列（如loxP位点）。在Cre重组酶结合后，发生位点特异性重组，导致被loxP位点侧翼包围的序列被切除，从而随机表达不同的荧光蛋白（其机制如下所述）。目前已有多种Br品系可供使用（参见相关综述）^16,18,19主要差异体现在Br品系之间，包括：（i）表达盒中包含的荧光基因数量不同，从2个（Br 2.0）、3个（Br1.0）到4个（Br1.1、Br2.1）不等；（ii）存在方向相反的lox位点，可实现基因倒位（Br2.0-2.1）；（iii）所使用的lox位点类型不同；（iv）在Cre激活前荧光基因的表达状态或沉默状态不同。最新建立的Br3品系为神经元的多色成像提供了更优的方法。该转录本的一个主要特征是包含一组新的光稳定性法尼基化荧光蛋白，能够对最细微的神经元突起实现均匀染色²⁰.

重要的是，不同版本的 Br 表达盒可能包含神经元特异性的 Thy1 启动子或普遍表达的 CAG（CMV）启动子。最后，某些 Br 转基因小鼠可能仅含有单个 Br 转基因，而其他小鼠则可能包含多个转基因拷贝，从而使得每个细胞中可表达出极为丰富的颜色组合（例如参见¹⁶）。

在本研究中，我们使用了 R26R-Confetti 小鼠，该小鼠携带 Br 2.1 基因盒²¹。由于 loxP 位点呈反向互补排列，Br2.1 被独特设计为不仅允许 Cre 介导的 DNA 切除，还可实现 DNA 倒位（图 1）。因此，只要存在 Cre，这些导致颜色变化的倒位/切除事件便可持续发生¹⁶。正因如此，在使用 Br2.1 进行可靠细胞示踪时，一个可诱导的时空调控 Cre 表达系统至关重要。如图 1所示，Br2.1 包含一个普遍性表达的 CAG 启动子，其后为 loxP 位点侧翼包围的 Neo^R-基因盒（作为转录阻断元件），再后是 4 个荧光报告基因，分别编码绿色（GFP）、黄色（YFP）、红色（RFP）和青色（CFP）荧光蛋白，这些基因以两组串联形式排列。在 Cre 激活之前，不表达任何荧光。Cre 重组酶的诱导表达将移除 Neo-R 基因盒，从而使得单个细胞中随机表达 4 种荧光蛋白之一。第一段包含 loxP 位点侧翼的 GFP 和反向排列的 YFP，第二段包含 loxP 位点侧翼的 RFP 和反向排列的 CFP。只要存在 Cre 重组酶，这些 DNA 片段便可持续发生倒位（通过反向排列的 loxP 位点）或切除。因此，应使用瞬时且可控的 Cre 转基因表达。Br2.1 基因盒提供了一个优异的系统，可用于在信号定位时区分重叠的荧光发射：YFP 和 RFP 的表达位于细胞质，GFP 表达定位于细胞核，而 CFP 则结合于细胞膜。GFP 与 RFP 的荧光发射可通过常规荧光显微镜轻松区分。为了区分 YFP、GFP 与 CFP 的发射信号，则需要使用光谱共聚焦成像系统。总体而言，Br2.1 基因盒可在每个靶向细胞中实现四种不同荧光基因之一的随机、可诱导且组织特异性的表达。事实上，当需要更多颜色组合时，可构建携带两个 Br2.1 等位基因的纯合小鼠，从而使每个细胞表达两种颜色标签，将可能的颜色组合数量提升至 10 种²²。某些 Br 小鼠品系能够实现更多颜色组合，因其基因组中整合了多个拷贝的该基因盒¹⁶。然而，在大多数情况下，单个 Br2.1 等位基因提供的四种颜色组合已足够使用。按照本文提供的实验方案，仅需相对简单的光谱显微镜装置，几乎无需或仅需极少校准，即可建立该技术方法。

本文提供了一种可调整的实验方案，用于携带单个 Br2.1 等位基因的 R26R-Confetti 小鼠在角膜上皮谱系示踪实验中的应用。该转基因小鼠品系已被用于研究结肠^21,23和角膜上皮干细胞^22,24的起源与命运、肠道肿瘤中 干细胞 活性 的存 在²⁵，以及表征局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）中的肾小球足细胞¹⁷。

方案

伦理声明：本研究中的动物护理和使用均遵循眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明。所有实验均经当地伦理委员会批准。

1. 选择合适的表达 Cre 重组酶的小鼠品系

1. 根据可购买的多种 Cre 转基因小鼠品系²⁶，并结合所研究的靶向组织，选择一种 Cre 重组酶基因受特定组织启动子调控的 Cre 转基因小鼠品系。若需要时间上的控制，则应选择可诱导型 Cre 品系。
   注意：我们选用他莫昔芬可诱导的 K14-Cre^ERT 转基因小鼠，以特异性地标记角膜缘和角膜上皮干细胞/前体细胞²⁴。需要注意的是，不同品系之间可能存在差异，Di Girolamo 及其同事曾报道其 K14-Cre^ERT 品系具有角膜缘特异性且无角膜表达²²。使用可诱导型 Cre 转基因小鼠的一个优势在于，可在不同的时间点灵活地启动谱系示踪实验。

2. 选择合适的小鼠品系

1. 根据研究问题和可用的 Cre 品系选择合适的 Br 盒式元件^16,18,20。
   1. 如果使用非诱导型 Cre 小鼠品系，应选择不会导致持续 DNA 倒位/切除、从而产生终末产物的 Br 盒式元件（例如 Br1.0 或 Br1.1）¹⁶。

3. 杂交感兴趣的转基因品系

1. 对于本实验方案，将纯合的 R26R-Confetti 品系（Br2.1/Br2.1）与纯合的 Cre^ERT 品系（Cre^ERT/Cre^ERT）杂交，以获得杂合子后代（Br2.1/+;Cre/+），这些后代可用于单等位基因谱系示踪，因其均含有一个 Br2.1 等位基因和一个 Cre 等位基因。
   注意：为提高标记效率，可构建携带两个 Cre 等位基因的小鼠（Br2.1/+; Cre/Cre）；而携带两个 Br2.1 等位基因的小鼠（Br2.1/Br2.1; Cre/+）则可增加颜色组合（详见文献²²）。

4. Cre 重组酶诱导

注意：在这些实验中，他莫昔芬通过每日腹腔注射的方式给药，持续 3–4 天，以诱导 Cre^ERT 重组酶转位至角膜缘和角膜基底层 K14 阳性干细胞/前体上皮细胞的细胞核中。以下方案适用于四只小鼠的注射。或者，将他莫昔芬局部应用于眼表可获得更高的效率。他莫昔芬溶液可在 4 °C 避光保存最多一周。使用前需将溶液预热。

1. 称取100 mg他莫昔芬，溶于5 ml玉米油中，配制成20 mg/ml的他莫昔芬溶液。
2. 向8周龄小鼠腹腔注射200 µl他莫昔芬溶液（含4 mg他莫昔芬），连续注射3–4天。
   注意：他莫昔芬溶液可在4 °C避光保存最多一周。使用前需将溶液预热。
3. 用于局部应用时：称取60 mg他莫昔芬，溶于1 ml玉米油中，配制成60 mg/ml的他莫昔芬溶液。涡旋混匀后，将溶液置于65 °C的振荡水浴中，直至溶液变澄清，并在使用前一直保留在水浴中。
   1. 小心地将100 μl他莫昔芬溶液涂抹于每只小鼠的眼表表面。

5. 成像用组织制备

1. 使用异氟烷（2% 溶于氧气中）麻醉动物，通过反射消失确认麻醉充分后，在他莫昔芬注射后的相应时间点采用 CO₂ 吸入法处死动物，并采集相关组织。
   1. 本实验中，在他莫昔芬注射后 1、4、8、12 和 16 周的时间点摘除眼球。使用弯头镊进行眼球摘除：按压眼睑使眼球突出于眼眶，将镊子置于眼球后方夹住视神经，轻柔牵拉并摘除眼球。
      注意：在此阶段，如下文所述，可对组织进行处理以用于标记细胞的全层染色分析。也可制备常规冷冻切片，经 PFA 固定后按如下方法成像（见第 6 节及²²）。
2. 将每只眼球置于盛有 PBS 的 60 mm 培养皿中。
3. 在体视显微镜下，用镊子夹住靠近视神经处的眼球，使角膜朝下，使用手术刀切除视神经、眼外肌及结缔组织，并在眼球后部做一小切口。
4. 使用弹簧剪小心扩大切口，使晶状体自然脱出，并用镊子移除虹膜。
5. 使用手术刀从中央向周边做 4–5 条放射状切口，将角膜展平。
6. 使用手术刀切除角膜缘以外的多余周边组织。
7. 将角膜在 4% 多聚甲醛（PFA）中固定 10 分钟，随后用 PBS 短暂洗涤。
8. 将样本与 DAPI 孵育 10 分钟，再用 PBS 短暂洗涤。
9. 将角膜上皮面朝上置于载玻片上，在角膜表面滴加一滴封片介质，加盖盖玻片。室温下避光干燥过夜，随后将载玻片保存于 4 °C。

6. 共聚焦显微镜与成像分析

1. 使用能够分离YFP/GFP/CFP发射光的光谱共聚焦系统。根据Br表达盒中荧光蛋白的特性设置荧光激发和发射波长。为每种蛋白选择最合适的激发波长，以尽量减少交叉激发。选择较窄的发射波长范围，以最大限度降低不同蛋白间信号串扰。
   1. 对于 Br2.1 试剂盒，可采用以下荧光激发（ex）和发射（em）参数作为起始设置：DAPI — ex 405 nm/em 420–480 nm，CFP — ex 458 nm/em 470–500 nm，GFP — ex 488 nm/em 497–508 nm，YFP — ex 514 nm/em 529–540 nm，RFP — ex 561 nm/em 575–615 nm。
2. 为了以高分辨率观察大范围组织区域，需进行拼图成像。对于图中所示结果，在 图2A-B，通过获取 12 × 12 图像阵列来成像整个角膜， 即， 使用4个荧光通道，每个视野采集144个场次（512 × 512），共采集576张图像，然后进行合并。
3. 为了探究标记细胞在组织不同深度和结构中的定位，需获取感兴趣区域的Z轴层扫图像。为了完整成像角膜的全层深度，以3 µm为间隔采集8个光学切片。可使用常规成像软件构建所采集切片的正交视图以及基于最大强度投影的图像。 ²⁴.

7. 角膜损伤联合他莫昔芬诱导

1. 使用异氟烷（2% 氧气雾化）麻醉小鼠，并皮下注射镇痛剂（卡洛芬，10 mg/kg）。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉成功。
2. 称取 1 g 他莫昔芬粉末，溶于 5 ml 无菌 DMSO 中，配制成浓度为 200 mg/ml 的溶液。
3. 将他莫昔芬溶液置于 65 °C 水浴中加热，直至溶液变澄清。使用前保持溶液在水浴中保温。
4. 对未处理的对侧眼涂抹眼膏，以防止麻醉期间角膜脱水。 在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。接受眼部损伤处理的小鼠在完全恢复前不得放回与其他小鼠同笼饲养。损伤后应密切监测小鼠状态。若小鼠体重减轻超过 10%、出现角膜糜烂 或明显不适 ，应终止实验。 在整个实验过程中，每 24 小时重复给予一次镇痛剂。 
5. 使用无针头的无菌注射器，将 200 µl 他莫昔芬溶液均匀滴加至每只小鼠单侧眼球的整个角膜表面。
   注意：该液体溶液在室温下接触眼表后会迅速固化。 角膜损伤的程度取决于创伤严重性。单次应用他莫昔芬/DMSO 溶液后，未观察到小鼠出现不良反应。 若多次重复给药，可能出现角膜混浊。
6. 在相应时间点继续进行组织制备和成像（见第 5 和第 6 节）。本研究展示的结果中，于损伤后一周处死小鼠（详见第 5.1 步骤）（图 2 和 ²⁴）。

结果

近期，我们的研究旨在鉴定角膜上皮干细胞及其祖细胞的起源、存活与迁移过程²⁴。越来越多的证据支持一种公认观点，即角膜上皮由位于角膜边缘区（limbal niche）的干细胞再生，该区域为角膜周边呈环状分布的结构。这一理论得到了体外（in vitro）和体内（in vivo）实验数据的支持，并且临床证据也为成功的角膜缘干细胞移植治疗奠定了基础^27-29。然而，近年来由于一项基于角膜缘移植实验的研究提出小鼠的角膜缘并不参与角膜更新³⁰，该领域仍存在较大争议。为了验证这一有趣的假说，我们利用R26R-Confetti小鼠进行了谱系追踪实验，以在稳态条件下持续观察角膜缘和角膜上皮干细胞/祖细胞的命运长达120天²⁴。在他莫昔芬注射后第10天和第120天，摘除眼球并制备角膜平展标本，通过光谱共聚焦激光扫描荧光显微镜进行分析。正如预期，在注射后10天，整个眼表可见少量散在的荧光细胞簇；而在1至4个月后（图2B和²⁴），逐渐出现从角膜缘向角膜中央延伸的细长条带状结构。该结果表明，角膜由从角膜缘向中央迁移的细胞再生。接下来，我们进一步研究了损伤条件下的角膜再生过程。为了在诱导高效细胞追踪的同时检测K14阳性角膜缘/角膜细胞在损伤条件下的命运，我们将他莫昔芬溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，后者在局部应用时可引起角膜损伤。通过这种方法，若仅局部应用一次，可诱导轻度损伤（图2C）；若在他莫昔芬诱导前一天额外单独使用DMSO处理，则造成中度损伤；若在他莫昔芬诱导前连续两天单独局部应用DMSO，则导致严重损伤。

与稳态条件下缓慢形成并在4个月内逐渐延伸至角膜中央的细窄角膜缘条带不同，损伤后的细胞迁移速度较快。值得注意的是，在损伤后7天内即可观察到长而粗的角膜缘条带。 有趣的是，有时颜色多样性较低（图2D）。在我们的实验中，偶尔在整个角膜中主要检测到红色细胞，表明颜色多样性可能偏向于特定的荧光蛋白。这种非预期的偏差可通过剂量-反应测试进行校准，如先前在Br1.0L³¹和Br2.1²¹中所报道。

图 1. R26R-Confetti 构建体的示意图。（A） R26R-confetti 构建体包含用于高水平表达的 CAG 启动子、一个由 loxP（黑色三角形）两侧包围的 Neo^R-阻断元件，以及位于 Rosa26 位点的 Brainbow2.1 盒式结构^16,21。Brainbow2.1 盒式结构包含两个头尾相连的 loxP 侧翼二聚体。其中一个二聚体由定位于细胞核的绿色荧光蛋白（GFP）和反向排列的细胞质黄色荧光蛋白（YFP，反向排列标记为 -PFY）组成。第二个二聚体包含细胞质红色荧光蛋白（RFP）和反向排列的膜锚定青色荧光蛋白（CFP，反向排列标记为 -PFC）¹⁶。（B–E）在 Cre 重组酶激活后，可能发生不同的切除和倒位事件；B–E 展示了可能的结果。Cre 活性诱导盒式结构发生随机重排，导致基因的删除和/或倒位，从而随机表达四种荧光蛋白中的一种。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 稳态及损伤条件下角膜谱系示踪。 按照本方案所述，向R26R-confetti/K14-Cre小鼠注射4 mg他莫昔芬。在诱导后的指定时间点，对展平的角膜进行成像（A-B）。通过将溶于DMSO的他莫昔芬局部应用于角膜实现损伤并同时诱导Cre重组（C-D）。图中展示了通过多通道拼接光谱共聚焦显微镜获得的拼接图像（A-D）。在稳态条件下，缓慢迁移的细胞形成从角膜缘延伸至角膜中央的放射状条带。这些条带发展缓慢，需4–5个月才能到达角膜中央（B）。同时可见角膜细胞的簇状结构（白色箭头，B）。相比之下，在损伤条件下，仅一周内即出现较大的角膜缘条带（C）。图中示例显示细胞颜色多样性偏向红色细胞（D）。虚线标注了角膜缘-角膜边界。比例尺为500 µm。缩写：CFP，青色荧光蛋白；GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白；YFP，黄色荧光蛋白。本图改编自²⁴。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

谱系示踪实验已进行了多年。近年来技术的进步以及Confetti小鼠品系的出现为研究开辟了新的途径。如今，研究人员可以利用大量商业化的组织特异性Cre品系、基因敲除小鼠和转基因小鼠。这使得研究人员仅需具备基础的专业知识即可设计出多样化的实验系统，避免繁琐的操作，同时获得可靠且稳健的数据。

R26R-Confetti 小鼠是一种用于在活体生物中高效追踪并研究细胞特性与行为的精巧工具。该系统易于建立，可在胚胎发生过程、稳态下的干细胞再生，或在损伤、炎症和癌症等不同条件下，实现对单个细胞的无创谱系追踪。所获得的数据能够以可量化的方式，稳健地描述靶向细胞的存活、克隆性细胞扩增以及细胞迁移情况。其中关键的一步是选择合适的遗传小鼠品系，以确保在特定发育阶段实现可靠且组织特异性的标记。该系统的一个局限性在于，若要对活体生物进行监测，目标组织必须具有可及性且透明。类似地，在活体动物中追踪较厚的组织通常需要借助双光子或多光子显微镜。然而，细胞追踪仍可在死后组织切片上进行，或者在通过 CLARITY 方法使完整组织转化为透明状态后进行研究^32,33。另一个需要考虑的局限性是：尽管表达相同荧光蛋白的相邻细胞很可能源自同一克隆谱系，但也有可能它们来自独立的细胞起源，仅因随机表达而激活了相同的荧光基因。当使用多个 Br 等位基因以产生多种颜色组合时，这种可能性将变得极低。

未来，结合 五彩纸屑 具有可用遗传工具的系统（即， 基因敲除、基因敲入和转基因小鼠模型将有助于研究基因及其突变在健康与疾病中的作用。同样，在不同系统扰动条件下进行谱系示踪即， 干细胞微环境破坏、激光介导的细胞消融、药物处理等手段将为信号通路在细胞命运决定中的作用提供新的见解。最终，荧光与生物发光标记、信号通路遗传报告系统与前沿显微技术的联合应用，将为研究人员提供一个强大的体系，用以探究单个细胞在其原生环境中如何响应周围信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
R26R-Confetti 转基因小鼠（对 Brainbow 2.1 基因盒呈纯合子）	Jackson	菌株编号 #013731
K14-Cre雌激素反应元件 小鼠	Jackson	品系编号 #005107
他莫昔芬	Sigma	T5648
异氟烷 USP Terrell	Piramal Critical Care
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	浓度为4时使用 µg/ml
Immu Mount	赛默飞世尔科技	9990402
LSM 510 Meta 激光扫描共聚焦系统连接至配备电动载物台的倒置电动显微镜（Axiovert 200M）	Zeiss		GFP、YFP 和 CFG 之间的光谱重叠需要使用光谱成像技术，以分离这些荧光蛋白的发射光谱。本文采用蔡司 LSM 510 Meta 光谱共聚焦显微镜。该系统配备的 Meta 检测器包含 32 个检测单元，每个单元收集 10 纳米波段的发射光。该技术称为 "光谱指纹识别" 可使用户设定最适合的波段过滤范围。可选用多种光谱共聚焦系统，包括Leica SP5（参考文献#21）、SP8、Zeiss LSM 780（参考文献#22）。
Zen 2009 成像软件	Zeiss
杜润眼膏	爱尔康