通过靶向裂解营养细胞从环境样本中物理分离芽孢

摘要

开发了一种从复杂的微生物群落中分离细菌内生孢子的方法，以便对该类细菌进行定制化的培养或分子研究。

摘要

芽孢形成是一种存在于厚壁菌门（Firmicutes）部分细菌中的生存策略。在芽孢形成过程中，这些细菌进入一种形态生理上的休眠状态，从而增强其在恶劣环境条件下的存活能力。尽管产芽孢的厚壁菌是培养研究中最常富集和分离的细菌类群之一，但在基于分子方法的多样性研究中却常常缺失。芽孢核心的抗性被认为是限制从内生孢子中回收DNA的因素之一。我们开发了一种方法，利用内生孢子更高的抗性，通过物理、酶解和化学裂解手段，将其从复杂的微生物群落中分离出来。由此获得的仅含内生孢子的样品可用于重新培养，或进行后续分析，例如针对内生孢子优化的DNA提取及后续的DNA测序。该方法应用于沉积物样品后，成功富集了内生孢子，并通过测序揭示了淡水湖泊沉积物中存在大量多样性的产芽孢微生物。我们预计，将此方法应用于其他样品也将获得类似的结果。

引言

本研究的目的是提供一种从环境样品中分离细菌内生孢子与营养细胞的实验方案。细菌内生孢子的形成是一种生存策略，通常由营养缺乏所触发，存在于厚壁菌门（Firmicutes）的多个细菌类群中¹。产孢细菌已被广泛研究，主要因为其中一些菌株具有致病性，因而具有重要的医学意义（例如，Bacillus anthracis 或 Clostridium difficile）。产孢细菌的环境菌株几乎已从所有类型的环境中被分离获得（包括土壤、水体、沉积物、空气、冰、人类肠道、动物肠道等）^1-3。因此，厚壁菌门是培养物保藏中丰度第二高的菌门⁴。

由于具有坚韧的外层皮层和保护性核心蛋白，内生孢子能够耐受从干燥到高辐射、极端温度以及有害化学物质等多种极端环境条件⁵。这种极强的抗性使得从内生孢子中提取DNA极具挑战性^6-8。这可能解释了为何在环境测序研究中内生孢子常被忽视^9,10。其他方法，如利用荧光抗体靶向环境样品中的内生孢子¹¹、测定土壤¹²和沉积物¹³中吡啶二羧酸（DPA）的含量、流式细胞术¹⁴，或通过巴氏灭菌后培养^15,16，已被用于从环境样品中回收或定量内生孢子。近年来，已开发出优化的DNA提取方法以及特异性分子引物，用于靶向内生孢子特异性的基因序列^10,17-20。这些进展有助于揭示这类细菌更丰富的生物多样性²¹，并推动了内生孢子检测在工业和医学领域的应用，例如在奶粉中的检测¹⁹。

本文所述方案基于细菌芽孢与营养细胞在抵抗有害理化条件（如高温和去垢剂）方面的差异。为了破坏样品中的营养细胞，我们依次使用加热、溶菌酶以及低浓度去垢剂进行处理。这些处理的时间和强度已优化至足以裂解所有营养细胞，但不会破坏芽孢。由于环境样品中的部分细胞比其他细胞更具抗性，因此我们采用三种不同的处理方式，以提高彻底清除所有营养细胞的可能性。该方法的优势与创新之处在于，处理后的芽孢仍保持完整，可用于后续多种下游分析，包括DNA提取、定量PCR（qPCR）以及扩增子或宏基因组测序（可特异性针对芽孢类群，从而降低多样性并提高测序覆盖度）。此外，这些芽孢还可用于后续的培养实验，或通过荧光显微镜、流式细胞术以及DPA检测进行定量分析。本方法的一个重要特点是，通过比较处理前与处理后的样品，可推断出环境样品中芽孢的数量和多样性，同时也能获得对应于营养细胞组分的信息。

方案

1. 化学试剂与仪器的准备 

1. 配制500 ml 1%六偏磷酸钠（SHMP）（NaPO₃）₆溶液₃)_n 溶液并经高压灭菌。
2. 将硝酸纤维素（NC）滤膜（孔径 0.22 µm，直径 47 mm）置于密闭的玻璃培养皿中，经高压灭菌器灭菌。
3. 使用密闭的玻璃培养皿对NC滤膜（孔径0.22 µm，直径25 mm）进行高压灭菌。
4. 称重并记录无菌50 ml离心管（带盖）的空重（每份样品一个管）。
5. 制备1× Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液）：配制含10 mM Tris的溶液（tris（羟甲基）氨基甲烷和1 mM EDTA缓冲液。调节pH至8，经高压灭菌后使用。
6. 将0.02 g溶菌酶溶解于1 ml TE缓冲液中，配制20 mg/ml的溶菌酶溶液。建议每次使用前新鲜配制，4 °C保存，保存时间不超过1周。
7. 通过将8 g/L氯化钠（NaCl）溶解于蒸馏水中来制备生理溶液。经高压灭菌后使用。

2. 从沉积物中分离生物量

1. 使用经乙醇火焰灭菌的金属药匙，将 3 g 沉积物样品加入预先称重的无菌 50 ml 离心管中。操作应在洁净且经紫外线灭菌的生物安全柜中进行，以避免污染。
2. 使用无菌刻度滴定管向样品中加入 15 ml 1% 无菌（经高压灭菌）SHMP 溶液。该 SHMP 溶液也可通过过滤方式处理，以防止污染。
3. 使用液体分散器/均质机（例如，Ultra-Turrax 均质机）对沉积物和 SHMP 溶液进行均质处理。使用前需用 70% 乙醇灭菌或高压灭菌分散转子。以 17,500 rpm 转速运行均质 1 分钟，静置样品 2 分钟后，再以相同转速重复均质 1 分钟。
4. 让样品静置 10 分钟。在此步骤中，最重的颗粒（矿物）将沉降下来，而细胞及样品中的有机组分则保留在溶液中。随后，小心转移上清液（含细胞生物量）至洁净的 50 ml 离心管中，注意不要扰动底部的沉积物沉淀。
5. 向沉积物沉淀中再次加入 15 ml 1% 无菌（经高压灭菌）SHMP 溶液，使用无菌刻度滴定管操作。然后重复步骤 2.3 和 2.4。此重复操作可确保最大程度地将细胞和有机颗粒从沉积物的矿物组分中分离出来。第二次分离所得的上清液可与第一次分离的上清液合并。
   注意：后续所有步骤均针对上清液（含细胞生物量）进行。矿物组分（沉积物沉淀）可弃去。
6. 将样品在 20 × g 条件下离心 1 分钟。此步骤施加的离心力足以使微小矿物颗粒沉淀，而生物细胞材料仍保留在溶液中。离心后，将上清液（含细胞生物量）转移至洁净的 50 ml 离心管中，弃去矿物沉淀。
7. 通过称重样品来确定含生物量溶液的最终体积。采用称重法可避免将样品转移至量筒，从而降低污染风险。

3. 滤膜上生物量的收集

1. 准备过滤装置（适用于直径为47 mm的滤膜）和真空泵。通过高压灭菌或（若为Pyrex玻璃材质）喷洒70%乙醇后用本生灯火焰灼烧的方式对过滤装置进行灭菌。待其冷却后再继续后续操作步骤。
2. 使用经乙醇火焰灭菌的无菌镊子将无菌硝酸纤维素（NC）滤膜放入过滤装置中。
3. 将上清液样品的一半（来自步骤2.6）加入滤膜过滤装置中，并通过真空泵将细胞收集在滤膜上。
4. 当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵，并使用经乙醇火焰灭菌的无菌镊子小心取出滤膜，将其放入无菌培养皿中。
   1. 使用经乙醇火焰灭菌的无菌剪刀将滤膜切成两半。将每半片滤膜分别放入两个独立的2 ml离心管中。其中一半用于DNA提取及整个细菌群落的分析；另一半滤膜则储存于-80 °C，作为备份样本。
5. 将新的NC滤膜放置于过滤装置上，利用真空泵收集剩余一半样品体积（来自步骤2.6）中的生物量。
6. 当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵，并使用经乙醇火焰灭菌的无菌镊子小心取出滤膜，将整片滤膜放入另一个2 ml离心管中。该样品将用于后续处理，以分离内生孢子与营养细胞。样品可在-20 °C条件下保存至后续使用。

4. 营养细胞的裂解

1. 对先前收集在NC膜上的生物量（步骤3.6）进行处理，以分离内生孢子和营养细胞。
   1. 如果膜已被冷冻，请在室温下放置10分钟 使其解冻。然后将膜放入无菌培养皿中，使用经乙醇火焰灭菌的剪刀将其剪成较小碎片（约剪4次）。随后将所有膜滤片转移至一个无菌的2 ml离心管中。
2. 向含有样品膜的离心管中加入900 µl 1× TE（Tris-EDTA）缓冲液（见1.5），并通过涡旋充分混匀。在此步骤中，生物量从膜上脱离并进入TE缓冲液溶液中。
3. 将离心管置于65 °C、80 rpm的培养箱中孵育10分钟，随后从培养箱中取出，并静置冷却15分钟。
4. 加入100 µl新配制的溶菌酶溶液（见1.5），使终浓度达到2 mg/ml。必须在样品冷却至37 °C以下后再加入溶菌酶，否则可能导致酶降解。
5. 在37 °C、80 rpm条件下孵育样品60分钟，此为溶菌酶裂解营养细胞的最佳条件。
6. 裂解完成后，向样品中加入250 µl 3 N氢氧化钠（NaOH）和250 µl 6%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。加入后样品总体积达到1.5 ml，NaOH的终浓度为0.5 N，SDS的终浓度为1%。
7. 在室温下以80 rpm孵育该混合液60分钟。加入碱和去垢剂有助于完成细胞裂解。这些去垢剂的浓度已优化，可在有效裂解营养细胞的同时不损伤内生孢子。
8. 准备一个可容纳直径25 mm膜的无菌过滤装置，通过高压灭菌法灭菌；若为Pyrex玻璃装置，则喷洒70%乙醇后用本生灯火焰灭菌。待其冷却。
9. 使用经乙醇火焰灭菌的镊子，将一张0.2 µm的NC膜（直径25 mm）放置于过滤装置上。
10. 将步骤4.7中的样品加至膜上，并利用真空泵过滤液体。当液体完全通过后，关闭真空泵。在此步骤中，裂解后的营养细胞成分被去除，因其无法被膜截留；仅有内生孢子保留在膜上。
11. 加入2 ml无菌生理溶液以洗去残留的去垢剂，并通过真空泵过滤液体。
12. 当液体完全过滤后，关闭真空泵，将膜保留在过滤装置上。

5. DNase 处理

注意：请直接在滤膜上进行DNase处理。确保过滤装置不漏液，并关闭真空泵，这一点非常重要。

1. 在滤膜上直接加入 450 µl 无菌水、50 µl DNase 反应缓冲液（1x）和 0.5 µl DNase 酶，静置 15 分钟。若条件允许，可在略高于常规室温的环境中进行消化，因为该酶在 25 °C 及以上温度时活性更佳。
   注意：将本生灯放置在过滤装置旁边也可提高温度，同时有助于维持周围环境的无菌状态，从而降低样品污染的风险。
2. DNase 消化完成后，开启真空泵以去除样品中的酶。
3. 加入 1 ml 生理溶液并进行过滤，以洗去残留的酶。
4. 待液体完全通过后，关闭真空泵，用无菌镊子取出含有芽孢的滤膜，并将其放入无菌培养皿中。
   注意：分离得到的芽孢样品现已可用于后续分析。如用于 DNA 提取，可保存在 -20 °C；如用于萌发和培养，可保存在 4 °C。

结果

此处展示的结果此前已发表^10,21。有关数据的环境解释与讨论，请参考这些文章。

整个实验流程如图1所示，包括三个主要步骤：首先，从沉积物或任何其他环境基质中分离生物量；其次，破坏营养细胞；最后，对分离得到的内生孢子进行下游分析。下游分析可包括例如DNA提取和扩增子测序，以确定其多样性。DNA提取过程需要优化，以确保内生孢子的充分裂解。在沉积物样品中，我们通过采用一种强力的连续DNA提取方法实现了这一点¹⁰。该方法在沉积物中的应用表明，分离后形成内生孢子的厚壁菌门（Firmicutes）所占比例显著增加。在16S rRNA基因的扩增子测序中，未经处理的样品（整个群落）中厚壁菌门仅占序列的8.0%和19.0%（表1）。相比之下，处理后厚壁菌门在内生孢子富集样品中分别占90.6%和83.9%。该方法富集了主要的两种可形成内生孢子的厚壁菌门目——芽孢杆菌目（Bacilliales）和梭菌目（Clostridiales），而与之形成对比的是，不形成内生孢子的乳杆菌目（Lactoba...

讨论

细菌芽孢对外界强烈理化因素（例如温度或去污剂）的抗性被用于设计一种方法，以从环境样品中分离细菌芽孢与营养细胞。这是首个以非破坏性方式从环境样品中分离芽孢的综合性方法。以往用于定量、检测或分析样品中芽孢的方法，主要基于对芽孢特异性替代标志物的测定，如吡啶二羧酸或特定标记基因。相比之下，本文所介绍的方案通过去除样品中除芽孢以外的其他组分，最终使芽孢成为样品中唯一且纯化的残留物。尽管已有其他方法（如巴氏灭菌法或密度梯度离心法）被提出用于富集芽孢²²，但我们的实验表明，由于不同芽孢形成菌在生理特性及密度上的差异，密度梯度离心法并不适合作为适用于各类环境样品的通用方法（数据未显示）。相比之下，本方案可轻松应用于各类环境样品，并适用于后续分子生物学分析或培养等应用。

该实验方案中有两个关键步骤。第一步是将生物量从样品基质（即沉积物颗粒）中分离出来。必须尽可能最大化从基质中分离出的细胞数量，以避免遗漏部分微生物多样性。对于本研究中所用的沉积物样品，该方案的一个主要局限性在于，部分细胞或孢子可能仍附着在沉积物基质上而未能被分离，因而未被纳入...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Whatman 硝酸纤维素膜滤器，0.2 μm 孔径，47 mm 直径	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
三（羟甲基）氨基甲烷	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
来自鸡蛋清的溶菌酶	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	粉末，CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax T18 basic 匀浆器	IKA	3720000
适用于 47 mm 膜的玻璃滤器 holder，Pyrex 玻璃材质	EMD Millipore	XX10 047 00
耐化学腐蚀真空泵	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
适用于 25 mm 膜的多通道采样过滤装置	Millipore	1225 Sampling Manifold	聚丙烯材质
Dnase	New England Biolabs	M0303S	无 Rnase
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman 硝酸纤维素膜滤器，0.2 μm 孔径，25 mm 直径	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich