成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in vivo）的真实行为。本文介绍一种基于流式细胞分选（FACS）的小鼠皮肤成纤维细胞分离方案，该方法无需进行细胞培养。
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摘要
摘要
成纤维细胞是分泌细胞外基质的主要细胞类型，也是多种器官和组织的关键组成部分。成纤维细胞的生理与病理过程涉及一系列临床疾病，包括多器官纤维化、烧伤后增生性瘢痕、缺血后心脏功能丧失以及肿瘤间质的形成。然而，成纤维细胞仍是一种特征尚不明确的细胞类型，这主要归因于其内在的异质性。现有的成纤维细胞分离方法需要进行细胞培养，而培养过程会显著影响细胞的表型和行为。因此，许多研究成纤维细胞生物学的工作依赖于 体外 操作无法准确反映成纤维细胞的行为 体内为解决这一问题，我们开发了一种基于流式细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠背部皮肤中分离成纤维细胞，该方法无需细胞培养，从而保留了单个细胞的生理转录组和蛋白质组特征。我们的策略通过谱系阴性门控（Lin⁻）排除非间充质来源的细胞，-而不是采用阳性筛选策略，以避免预先选择或富集表达特定表面标志物的成纤维细胞亚群，并尽可能涵盖这种异质性细胞类型的多样性。
引言
成纤维细胞通常根据形态被定义为梭形且能够黏附于塑料基质的细胞。成纤维细胞是胚胎和成体器官中负责合成和重塑细胞外基质的主要细胞类型1。因此，成纤维细胞对哺乳动物的发育至关重要，并显著影响各组织和器官中邻近细胞类型的微环境及其行为。
成纤维细胞也是多种疾病状态的主要细胞类型，这些疾病造成了巨大的临床负担。成纤维细胞的病理性活动会损害正常组织功能，包括组织和器官纤维化（如肺和肝纤维化）、皮肤创伤愈合后的瘢痕形成、动脉粥样硬化、系统性硬化症以及血管损伤后动脉粥样斑块的形成2-5。尤其是创伤愈合过程，无论急性或慢性，均涉及瘢痕组织的沉积，这种组织在结构和功能上均不同于周围的正常组织，并在多种病理状态下导致显著的疾病负担。损伤后，成纤维细胞会转化为肌成纤维细胞，后者分泌结构性细胞外基质（ECM）成分，对邻近细胞类型产生旁分泌效应，并通过沉积瘢痕组织来恢复机械稳定性6。
在皮肤组织中，伤口修复的质量在不同发育阶段以及不同解剖部位之间存在显著差异。生命前两个孕期的胎儿能够实现无瘢痕愈合；然而，从第三个孕期开始直至成年，人类的伤口愈合均会形成瘢痕。此外，伤口愈合还存在部位特异性和年龄特异性的差异。口腔内的伤口可发生重塑，几乎不形成瘢痕7,8，而皮肤伤口中的瘢痕组织沉积则十分明显9。关于微环境与局部成纤维细胞的内在特性在年龄和部位相....
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方案
本方案遵循斯坦福大学实验动物护理与使用管理委员会批准的方法。
1. 小鼠真皮的消化
- 使用腹腔注射氯胺酮 100 mg/kg + 赛拉嗪 20 mg/kg + 乙酰丙嗪 3 mg/kg 进行麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。
注意：可使用不同年龄和遗传背景的小鼠。 - 剃除并脱去背部皮肤的毛发。从一块约 60 mm × 100 mm 的背部皮肤中可分离出约 100,000 个细胞。
- 将小鼠浸入 70% 乙醇中，并置于洁净无菌的表面上晾干。
- 立即使用无菌解剖剪取下小鼠背部皮肤。在雌性小鼠中，避免包含乳腺组织。
- 从尾部基部开始，用镊子提起皮肤，并做一横向切口，随后沿筋膜上平面进行解剖。
- 在取材过程中应小心避免带入任何皮下脂肪。检查所获取的皮肤组织，若存在皮下脂肪，使用手术刀钝边小心刮除。
- 将取下的皮肤用聚维酮碘冲洗，随后在冰上用 PBS 洗涤 5 次。
注意：应尽可能保持皮肤无菌，以避免污染。 - 在无菌培养皿中使用剃刀片和解剖剪将皮肤组织切碎，直至样品成为大小均匀的 2–3 mm 碎块。
- 准备 50 ml 锥形管，每管加入 20 ml 胶原酶 IV（溶于 DMEM，浓度为 1 mg/ml）。根据每管对应五只小鼠的比例将真皮组织分装入管中。
- 在 37 °C 条件下....
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结果
该方法的有效性（图1已通过多种方式验证，详细内容可参见我们近期的出版物27包括对分选细胞进行免疫细胞化学检测，以及对新鲜分选的大量细胞和单细胞进行转录组分析。直接分选成纤维细胞而非依赖培养，能更准确地捕获其 体内 表型。采用谱系阴性耗竭法（图2A）而非采用阳性筛选方法，可避免对特定亚群进行预先筛选。该方法的价值最近由 Rinkevich 所证实 等27，鉴定出位于真皮层先前未被描述水平的CD26阳性成纤维细胞的存在。
为了证实成纤维细胞培养过程会导致基因表达发生显著变化，我们采用微阵列技术对培养的成纤维细胞与未培养的成纤维细胞进行了比较。我们对通过两种方法分离的成纤维细胞进行了培养：一种是本文详细描述的活体收获法，另一种是已知的组织块培养法28。全转录组微阵列分析显示，通过活体收获法（C.LH）和组织块培养法（C.TE）分离的培养成纤维细胞在全转录组水平上具有高度相似性，其皮尔逊积矩相关系数（r）为0.92（图2B）。相比之下，培养的成纤维细胞与通过活体收获法获得.......
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讨论
本论文所述方案提供了一种基于流式细胞术分选分离成纤维细胞的方法，与现有方法相比，该方法无需选择特定亚群，也无需在后续分析前进行细胞培养。从皮肤收获到成纤维细胞分选完成所需时间约为6小时；然而，收获过程中使用的小鼠数量会影响这一时间估算。
在实验方案中有几个关键点需要特别注意。首先是限制脂肪细胞的污染，需在消化前去除皮肤中的脂肪组织，并在消化及离心后的分离过程中去除上清液中的上层脂质层。此外，在细胞沉淀后更换为新的离心管可能也有帮助，因为部分脂类成分会黏附在离心管的塑料管壁上，可能导致后续洗涤步骤中产生污染。第二个要点是在表皮-真皮连接处仔细分离真皮与表皮。尽管污染的表皮细胞可通过FACS耗竭策略予以去除，但仍应尽可能在此步骤中减少污染。
该方法的局限性包括当前谱系抗体组合可能无法完全排除污染性细胞的存在。在选择与谱系抗体（CD31、CD45、Tie2、Ter119、EpCAM）偶联的荧光素时，研究人员必须充分考虑可能需要进行的其他表面标志物分析。额外的染色所用荧光染料必须与所选谱系抗体的荧光素处于不同的检测通.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM087609 基金（授予 H.P.L.）、Ingrid Lai 与 Bill Shu 为纪念 Anthony Shu 捐赠的礼物基金（授予 H.P.L.）、NIH U01 HL099776 基金（授予 M.T.L.）、Hagey 儿科再生医学实验室以及 Oak 基金会（授予 M.T.L.、G.C.G. 和 H.P.L.）的支持。G.G.W. 得到了斯坦福医学院、斯坦福医学科学家培训项目以及 NIGMS 培训基金 GM07365 的支持。Z.N.M. 得到了整形外科基金会研究奖学金以及 Hagey 家族基金的支持。M.S.H. 得到了加州再生医学研究所（CIRM）临床研究员培训基金 TG2-01159、美国颌面外科医师学会（ASMS）/颌面外科医师基金会（MSF）研究基金奖以及移植与组织工程研究员奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术镊 | Kent Scientific | INS650916 | |
| 微型剪刀 | Kent Scientific | INS600127 | |
| 聚维酮碘消毒液 | Dynarex | 1415 | |
| Nair（脱毛霜） | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104-019 | |
| 弹性蛋白酶 | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液 | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm 滤膜 | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μm 滤膜 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μm 滤膜 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| 碘化丙啶（PI 活性染色） | BioLegend | 421301 |
参考文献
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
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重印与许可
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