本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。
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本文内容
摘要
摘要
人类心脏组织工程可通过开发新型物种特异性筛选系统，从根本上影响治疗手段的发现。这类系统能够复制三维原生人类心肌的生物保真度，同时实现对生物复杂性的可控调节，并允许对组织收缩功能进行非破坏性的纵向监测。最初，人类工程化心脏组织（hECT）是利用人多能干细胞定向分化所获得的全部细胞群体构建的，其中心肌细胞比例通常低于50%。然而，为了建立可靠的人类心肌预测模型，并阐明异质细胞间相互作用的机制，精确控制工程化组织中的生物组成至关重要。
为解决这一局限性，我们利用活细胞分选技术，针对心脏表面标志物 SIRPα 和成纤维细胞标志物 CD90，分别制备含有这两种细胞类型比例为 3:1 的组织，随后将它们混合并加入基于胶原蛋白的基质溶液中。因此，所获得的人工工程化心肌组织（hECTs）在细胞组成和细胞外基质组成上均实现了完全明确的定义。
本文介绍了一种构建明确定义的心脏工程化组织（hECTs）的方法，作为研究细胞治疗中细胞间相互作用机制的模型系统，并以目前正用于人体临床试验的人骨髓来源间充质干细胞（hMSC）为例进行说明。明确的组织组成对于理解hMSC如何与内源性心肌细胞类型相互作用以增强组织功能至关重要。本文还描述了一种生物反应器系统，可同时平行培养六个hECTs，从而在细胞分选后更高效地利用细胞。
引言
心脏组织工程在过去十年中取得了显著进展，多个研究团队已发表利用小鼠心肌细胞构建出具有完全功能并能搏动的心脏组织的研究成果1-6 以及近期由人类干细胞衍生的心肌细胞7-12心脏组织工程领域主要由两个基本且相对独立的目标推动：1）开发可移植到功能衰竭心脏中的外源性移植物，以改善心脏功能4-6；以及 2）开发 体外 用于研究生理学与疾病的模型，或作为治疗开发的筛选工具2,7.
三维（3-D）细胞培养被认为是开发下一代筛选工具的关键，因为与传统的二维（2-D）单层细胞培养相比，3-D基质更能模拟天然的心脏微环境；事实上，细胞生物学的某些方面在2-D与3-D培养之间存在根本性差异13,14此外，工程化心脏组织由完全明确的组分构建而成：细胞外基质和细胞群体。对于传统的人类工程化心脏组织而言，尽管细胞外基质的成分（通常为纤维蛋白）9 或胶原蛋白7,8,10）受到严格控制，而输入的细胞组成则定义较不明确，包含由胚胎干细胞（ESC）进行定向心脏分化所产生的全部细胞混合物7,9）或诱导性多能干细胞（iPSC10,12) 添加至组织中。根据所用特定细胞系及分化方案的效率，所得心肌细胞的比例可能介于不到25%至超过90%之间，具体的心肌细胞表型（即，心室样、心房样或起搏....
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方案
注意：所有细胞操作均须在使用HEPA过滤的II级生物安全柜的无菌条件下进行，并通过0.2 µm滤膜过滤对所有溶液进行灭菌。组织构建和功能检测应在相同的无菌条件下或在层流罩中进行。
1. 心脏分化前H7 hESC的接种
- （第1天）制备基底膜基质
- 将150 µl hESC级基底膜基质在冰上于4 °C过夜解冻。
- （第0-4天）在包被板上接种hESC
- 将解冻的基质加入12 ml预冷的DMEM/F12培养基中稀释，并充分混匀。
- 将1 ml DMEM/F12-基质溶液转移至6孔组织培养板的每个孔中。每份基质溶液可包被两块6孔板。
- 将包被好的培养板在室温下孵育至少1小时。
注意：根据我们的经验，用石蜡密封的包被培养皿可在4 °C的基质溶液中保存最多10天后再使用。 - 当细胞融合度约为75%时，使用6 ml非酶解离试剂从10 cm培养皿中解离H7 hESC。5分钟后，用一次性细胞刮轻轻刮下细胞，并将细胞悬液转移至无菌15 ml离心管中。
- 从15 ml离心管中取出含细胞的0.5 ml解离液，转移至新的无菌15 ml离心管中（保留5.5 ml解离液用于进一步解离hESC），用于干细胞系的传代。
- 在20 °C下以300 x g离心5分钟，收集0.5 ml细胞....
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结果
为获得心肌细胞，采用略微改进的 Boheler 和 Lian 分化方法30,31。分化必须在细胞生长的对数期开始，同时起始细胞群体需达到足够高的融合度，以便在分选后获得可用数量的细胞（约75%融合度为最佳）。通常情况下，将 H7 hESCs 以每6孔板每孔140,000个细胞的密度接种于Essential 8培养基中，在37 °C、5% CO2的培养箱中培养4天后，可获得适合启动分化的融合度，如图1A-D所示。由于胰岛素会抑制分化过程中的心肌特化32，因此在分化的前10天使用无胰岛素培养基（分化培养基I，表1）。一旦通过添加GSK3抑制剂CHIR99021启动分化，将出现明显的细胞死亡（图1E）。因此，必须每天更换培养基。在分化第2天，将细胞从CHIR99021中移出，并在不含小分子添加物的分化培养基I中静置24小时。在分化培养基中静置24小时后，用IWR-1处理细胞48小时，随后细胞开始自组织形成细胞簇（图1F
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讨论
构建明确定义的人源工程化心肌组织（hECT）可提供一种更为一致且可靠的人类心肌细胞功能模型。关键在于，该系统中的所有细胞及细胞外成分均是已知的，并可根据需要进行操控，从而消除了由分化过程产生的其他未知细胞类型的干扰影响。为了平衡细胞快速生长与高产量，建议在人胚胎干细胞（hESCs）贴壁后第四天、达到约75%融合度时开始分化。此外，在细胞解离以及分选后的再聚集过程中使用ROCK抑制剂Y-27632，可显著提高细胞存活率。在分化过程中出现心肌细胞的自发性搏动，是评估分化效率与细胞健康状态的重要指标。若未观察到自发性搏动，可能提示分化效率低下，原因可能是试剂效果不佳或干细胞多能性的丧失。
在构建组织的过程中，PDMS 柱必须与基板中的通道精确对齐，以形成结构完整且能够维持足够长时间的组织，从而用于测量收缩功能。为了提高装置对准的便捷性，并增强组织在易断裂的柱周围形成时的牢固性，可以在通道末端增加额外宽度（每侧约一个柱体直径），如图 3A中“哑铃”形通道所示。若装置对准不当，组织要么在培养后不久从柱体上脱落，要么在移除基板时仍滞留在孔中。如果结构完整的组织.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究获得了以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）授予 T.J.C. 的项目（1F30HL118923-01A1）；NIH/国家心肺血液研究所（NHLBI）PEN 合同 HHSN268201000045C 授予 K.D.C. 的项目；香港研究资助局 TRS T13-706/11 项目（K.D.C.）；美国国立卫生研究院（R01 HL113499）授予 B.D.G. 的项目；美国心脏协会（12PRE12060254）授予 R.J. 的项目；以及中国香港特别行政区研究资助局（TBRS, T13-706/11）授予 R.L. 的项目。此外，T.J.C. 还获得了 NIH DRB 5T32GM008553-18 的额外资助，并获得美国国家儿童健康与人类发展研究所（NIDCR）跨学科系统与发育生物学及出生缺陷培训项目 T32HD075735 的培训资助。作者谨此衷心感谢纽约市立学院 Zahn 中心的 Arthur Autz 在生物反应器加工方面的协助，以及 Mamdouh Eldaly 提供的技术支持。我们还感谢 Kenneth Boheler 博士在心肌细胞分化方面的指导，以及 Joshua Hare 博士慷慨提供人源间充质干细胞。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich | A2411 | 用DMSO配制2.5 mg/ml的储存液，并通过滤膜除菌 |
| 含胰岛素的B27 | Life Technologies | 17505055 | |
| 不含胰岛素的B27 | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | 配制6 μM的储存液，分装后于-20 °C保存。 |
| Essential 8 培养基 | Life Technologies | A1517001 | |
| H7人胚胎干细胞 | WiCell | WA07 | |
| 人胚胎干细胞专用基质，Corning Matrigel | Corning | 354277 | 在4 °C冰上过夜解冻，分装为每管150 μl，于-20 °C保存。 |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | 配制10 mM的储存液并分装，于-20 °C保存 |
| 新生牛血清 | Life Technologies | 16010159 | |
| 非酶解离试剂：温和细胞解离试剂 | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | 需冷藏保存 |
| Y-27632（ROCK抑制剂） | Stemgent | 04-0012 | 重悬至10 mM的储存浓度，分装后于-20 °C保存。避免反复冻融。 |
| 细胞分选 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| 酶解解离试剂：Cell Detach Kit I（含0.04%胰蛋白酶/0.03% EDTA、胰蛋白酶中和液和Hanks平衡盐溶液） | PromoCell | C-41200 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| 组织构建 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 0.25%胰蛋白酶/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | 可选：用于收集额外感兴趣的细胞 |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10x PBS粉末 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| 牛I型胶原蛋白 | Life Technologies | A10644-01 | 需置于冰上保存 |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s改良Eagle培养基（DMEM），高糖 | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| HEPES钠盐 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| 材料 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml 聚丙烯离心管 | Corning | 352096 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底试管 | Corning | 352235 | 带一体化35 μm细胞筛网 |
| 50 ml 聚丙烯离心管 | Corning | 352070 | |
| 6孔平底组织培养板 | Corning | 353046 | |
| 一次性细胞刮刀 | Biologix | 70-2180 | |
| 聚砜 | McMaster-Carr | ||
| 聚四氟乙烯（特氟龙） | McMaster-Carr | ||
| 设备 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ-61 | 或类似型号，必须具备可安装高速相机的支架 |
| 电刺激系统 | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| 高速相机 | Pixelink | PL-B741U | 或类似型号，但必须能够以每秒100帧的速度进行准确的数据采集 |
| 培养板温度控制装置 | 用于在数据采集期间维持培养基温度。 | ||
| 定制材料 | 公司 | 货号 | 备注 |
| LabView 后处理追踪程序 | 可向作者申请获取 |
参考文献
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening ....
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重印与许可
