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方法文章

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

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DOI：

10.3791/53447

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2016年3月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

本文内容

摘要

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。

摘要

人类心脏组织工程可通过开发新型物种特异性筛选系统，从根本上影响治疗手段的发现。这类系统能够复制三维原生人类心肌的生物保真度，同时实现对生物复杂性的可控调节，并允许对组织收缩功能进行非破坏性的纵向监测。最初，人类工程化心脏组织（hECT）是利用人多能干细胞定向分化所获得的全部细胞群体构建的，其中心肌细胞比例通常低于50%。然而，为了建立可靠的人类心肌预测模型，并阐明异质细胞间相互作用的机制，精确控制工程化组织中的生物组成至关重要。

为解决这一局限性，我们利用活细胞分选技术，针对心脏表面标志物 SIRPα 和成纤维细胞标志物 CD90，分别制备含有这两种细胞类型比例为 3:1 的组织，随后将它们混合并加入基于胶原蛋白的基质溶液中。因此，所获得的人工工程化心肌组织（hECTs）在细胞组成和细胞外基质组成上均实现了完全明确的定义。

本文介绍了一种构建明确定义的心脏工程化组织（hECTs）的方法，作为研究细胞治疗中细胞间相互作用机制的模型系统，并以目前正用于人体临床试验的人骨髓来源间充质干细胞（hMSC）为例进行说明。明确的组织组成对于理解hMSC如何与内源性心肌细胞类型相互作用以增强组织功能至关重要。本文还描述了一种生物反应器系统，可同时平行培养六个hECTs，从而在细胞分选后更高效地利用细胞。

引言

心脏组织工程在过去十年中取得了显著进展，多个研究团队已发表利用小鼠心肌细胞构建出具有完全功能并能搏动的心脏组织的研究成果1-6 以及近期由人类干细胞衍生的心肌细胞7-12心脏组织工程领域主要由两个基本且相对独立的目标推动：1）开发可移植到功能衰竭心脏中的外源性移植物，以改善心脏功能4-6；以及 2）开发 体外 用于研究生理学与疾病的模型，或作为治疗开发的筛选工具2,7.

三维（3-D）细胞培养被认为是开发下一代筛选工具的关键，因为与传统的二维（2-D）单层细胞培养相比，3-D基质更能模拟天然的心脏微环境；事实上，细胞生物学的某些方面在2-D与3-D培养之间存在根本性差异13,14此外，工程化心脏组织由完全明确的组分构建而成：细胞外基质和细胞群体。对于传统的人类工程化心脏组织而言，尽管细胞外基质的成分（通常为纤维蛋白）9 或胶原蛋白7,8,10）受到严格控制，而输入的细胞组成则定义较不明确，包含由胚胎干细胞（ESC）进行定向心脏分化所产生的全部细胞混合物7,9）或诱导性多能干细胞（iPSC10,12) 添加至组织中。根据所用特定细胞系及分化方案的效率，所得心肌细胞的比例可能介于不到25%至超过90%之间，具体的心肌细胞表型（即，心室样、心房样或起搏细胞样）也可能不同，甚至非心肌细胞组分也可能具有高度异质性15,16 并改变已分化心肌细胞的成熟度17.

近期的心脏组织工程技术研究尝试通过使用心脏报告基因人胚胎干细胞系8或细胞表面标志物18来控制输入的细胞群体，从而分离出分化过程中的心肌细胞成分。虽然最初仅由心肌细胞构成的组织看似理想，但实际上并非如此；完全由心肌细胞组成的人工工程化心脏组织（hECTs）无法有效致密化形成功能性组织，一些研究发现当心肌细胞与成纤维细胞的比例为3:1时，产生的收缩力最强8。通过多种细胞筛选方法，包括利用表面标志物对活细胞进行分选，可以构建具有明确细胞组成的hECTs。尽管非心肌间质细胞的标志物已存在较长时间，例如假定的成纤维细胞标志物CD9019,20，但心肌细胞的表面标志物却较难鉴定。SIRPα是最早被鉴定出的人类心肌细胞表面标志物之一18，并已被证明对心肌谱系具有高度特异性。近期我们发现，对SIRPα+和CD90-细胞进行双重分选可获得近乎纯化的心肌细胞，而CD90+细胞群则表现出类似成纤维细胞的表型（Josowitz，未发表观察结果）。基于上述研究结果，本文描述了采用3:1比例的SIRPα+/CD90-心肌细胞与CD90+成纤维细胞组合构建hECTs的方法。

构建完全明确的人类心肌组织的能力不仅对于创建可靠的筛选工具至关重要，而且对于开发用于研究新兴细胞和基因心脏疗法的模型系统也必不可少。特别是，多种针对心力衰竭的细胞疗法已在临床试验中进行了测试，所使用的细胞类型包括间充质干细胞（MSC）21、心脏干细胞22以及骨髓单个核细胞23-25。尽管许多早期结果令人鼓舞21,23,25，但初始疗效往往随时间推移而减弱26-29。类似趋势也在小鼠工程化心肌组织中被报道，这些组织因补充间充质干细胞而表现出显著的功能改善，但这种益处在长期培养过程中无法维持1。导致疗效欠佳的根本原因在于我们对细胞疗法作用机制的认识仍然有限。更深入地理解治疗性细胞如何发挥其有益作用，以及心肌细胞与非心肌细胞相互作用可能带来的负面影响，将有助于开发出更优的疗法，从而为心力衰竭患者带来具有临床意义且持久的疗效，并将副作用降至最低。

本文描述了利用成分明确的人类工程化心脏组织（hECT）来探究细胞治疗机制的方法。可控的组织组成对于鉴定影响心肌细胞功能的特定因子至关重要。通过直接向hECT中添加感兴趣的治疗性细胞类型（例如，间充质干细胞，MSCs），可揭示其对心肌细胞功能的影响，我们在大鼠工程化心脏组织（ECT）中的研究已证实了这一点1。

以下多步骤方案首先进行定向心脏干细胞分化，随后构建多组织生物反应器，最后描述组织构建及功能分析。我们的实验采用美国国立卫生研究院（NIH）批准的H7人胚胎干细胞（hESC）系。然而，以下方案也已在另一株hESC系以及三株诱导性多能干细胞（hiPSC）系中进行测试，结果相似。我们发现，心肌细胞分化的效率以及hECT构建的成功率可能依赖于细胞系，尤其是来源于不同个体患者的hiPSC系。按照本方案操作，可将总计168万个hESC（每孔14万个细胞）接种于两块6孔板中，经20天分化和分选后，可获得约250万个心肌细胞，足以制备六份定义明确的组织样本。

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方案

注意：所有细胞操作均须在使用HEPA过滤的II级生物安全柜的无菌条件下进行，并通过0.2 µm滤膜过滤对所有溶液进行灭菌。组织构建和功能检测应在相同的无菌条件下或在层流罩中进行。

1. 心脏分化前H7 hESC的接种

  1. （第1天）制备基底膜基质
    1. 将150 µl hESC级基底膜基质在冰上于4 °C过夜解冻。
  2. （第0-4天）在包被板上接种hESC
    1. 将解冻的基质加入12 ml预冷的DMEM/F12培养基中稀释，并充分混匀。
    2. 将1 ml DMEM/F12-基质溶液转移至6孔组织培养板的每个孔中。每份基质溶液可包被两块6孔板。
    3. 将包被好的培养板在室温下孵育至少1小时。
      注意：根据我们的经验，用石蜡密封的包被培养皿可在4 °C的基质溶液中保存最多10天后再使用。
    4. 当细胞融合度约为75%时，使用6 ml非酶解离试剂从10 cm培养皿中解离H7 hESC。5分钟后，用一次性细胞刮轻轻刮下细胞，并将细胞悬液转移至无菌15 ml离心管中。
    5. 从15 ml离心管中取出含细胞的0.5 ml解离液，转移至新的无菌15 ml离心管中（保留5.5 ml解离液用于进一步解离hESC），用于干细胞系的传代。
    6. 在20 °C下以300 x g离心5分钟，收集0.5 ml细胞，弃去上清液，用8 ml含1%青霉素-链霉素的多能干细胞培养基轻柔重悬，然后转移至新的包被10 cm组织培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养以维持干细胞系。
      注意：在更换培养基时，应将多能干细胞培养基置于冰上保存。
    7. 同时，在剩余的5.5 ml解离液中加入5.5 µl 10 mM ROCK抑制剂Y-27632，继续在室温下孵育5-10分钟。用5 ml移液管轻柔混匀细胞。继续孵育直至形成单细胞悬液，然后在室温下以300 x g离心5分钟收集细胞。
    8. 用5 ml多能干细胞培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
    9. 以每孔140,000个细胞的密度接种6孔板的每个孔。接种两块6孔板，共形成六个确定的组织。接种完成后，弃去剩余细胞。
    10. 每孔补加培养基至1 ml，于37 °C、5% CO2条件下孵育。24小时后，弃去原培养基，每孔加入2 ml新鲜多能干细胞培养基（图1A）。
    11. 每天观察培养板的细胞融合度，当细胞融合度达到约75%时开始诱导分化（图1B-D）。

2. （第4-24天）人类胚胎干细胞向心肌细胞的分化30,31

  1. （第4-7天，分化第0-3天）中胚层诱导
    1. 通过将500 ml RPMI 1640与10 ml B27补充剂（不含胰岛素）和5 ml青霉素-链霉素储备液（10,000 IU/ml青霉素；10,000 µg/ml链霉素）混合，制备RPMI分化培养基I（表1）。分装至50 ml离心管中，置于冰上，并于4 °C保存。
    2. （第4天，分化第0天）通过向12 ml RPMI分化培养基I中加入2.4 µl小分子GSK3抑制剂CHIR99021（10 mM储备液，终浓度6 µM）制备中胚层诱导培养基。吸去每孔中的多能干细胞培养基，每孔更换2 ml中胚层诱导培养基。将培养板放回培养箱。
      注意：加入CHIR99021后通常会出现明显的细胞死亡（图1E）。单层细胞将逐渐恢复，但重要的是使用DMEM/F12清洗液去除死亡细胞。
    3. （第5天，分化第1天）按上述方法制备新鲜的中胚层诱导培养基。吸去每孔中的旧培养基，每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次。每孔加入2 ml新鲜中胚层诱导培养基。
      注意：在第0至第10天每天进行清洗可显著提高心肌细胞的产量和纯度。
    4. （第6天，分化第2天）吸去心脏诱导培养基，每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次。每孔加入2 ml RPMI分化培养基I（不添加小分子，但仍含B27（不含胰岛素）补充剂），并将培养板放回培养箱。
  2. （第7-13天，分化第3-10天）心脏中胚层诱导
    1. （第7天，分化第3天）通过向12 ml RPMI分化培养基I中加入6 µl小分子Wnt抑制剂IWR-1（10 mM储备液，终浓度5 µM）制备心脏中胚层诱导培养基。
    2. 吸去每孔中的培养基，每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次，每孔更换2 ml心脏中胚层诱导培养基。
    3. （第8天，分化第4天）按上述方法额外制备12 ml心脏中胚层诱导培养基。吸去前一天加入的培养基，每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次，每孔更换2 ml新鲜的心脏中胚层分化培养基，并将培养板放回培养箱。
    4. （第9-10天，分化第5-6天）在这两天，吸去心脏中胚层诱导培养基，每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次。
    5. 每孔加入2 ml新鲜RPMI分化培养基I（不添加小分子，但仍含B27（不含胰岛素）补充剂），并将培养板放回培养箱。
  3. （第11-24天，分化第7-20天）人胚胎干细胞来源心肌细胞的组织化/成熟
    1. 通过将500 ml RPMI 1640与10 ml B27补充剂（含胰岛素）和5 ml青霉素-链霉素储备液混合，制备RPMI分化培养基II（表1）。分装至50 ml离心管中，置于冰上，并于4 °C保存。
    2. （第11天，分化第7天）吸去每孔中的RPMI分化培养基（不含胰岛素），每孔用1 ml DMEM/F12清洗一次。每孔更换2 ml新的RPMI分化培养基II（含胰岛素），并将培养板放回培养箱。
      注意：自发性搏动通常在第7至第10天之间首次出现。若在此期间未观察到搏动，通常表明分化效率较低。可继续培养至第15天以尝试观察搏动，但若至第15天仍未观察到搏动，则建议重新开始一次分化。
    3. （第12-24天，分化第8-20天）每天吸去旧的分化培养基，每孔更换2 ml新鲜RPMI分化培养基II，以促进细胞成熟及搏动单层的组织化（图1F，视频图1）。
      注意：根据残留的细胞死亡情况，可能需要在分化至第10天期间用1 ml DMEM/F12进行清洗。

3. （第24天，分化第20天）心肌细胞和成纤维细胞样细胞的分离

  1. 从单层培养物中解离细胞
    1. 移除分化培养基，并用 1 ml PBS 冲洗一次。
    2. 用1 ml酶解消化液（0.04%胰蛋白酶/0.03% EDTA）处理各孔，使单层细胞解离。
    3. 将培养板放入培养箱中孵育10分钟。同时，向6 ml胰蛋白酶中和溶液中加入12 µl ROCK抑制剂。
    4. 向每孔中轻柔加入含有ROCK抑制剂的1 ml胰蛋白酶中和溶液，以中和胰蛋白酶溶液。
    5. 使用无菌移液管轻轻混匀各孔，以分散细胞团块。
    6. 将6孔板中的全部12 ml液体转移至15 ml离心管中。
      注意：由于本实验方案中使用了两块6孔板，因此需要两个15 ml离心管。
    7. 将3 ml PBS转移至培养板的一个孔中，随后将这3 ml PBS依次转移至后续各孔，以收集培养皿中残留的细胞。将最后孔中剩余的3 ml液体转移至含有细胞的同一15 ml离心管中。
    8. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
  2. 通过流式细胞术对活细胞进行分选前的细胞准备
    1. 在冰上将 5 ml 胎牛血清和 50 µl ROCK 抑制剂加入 45 ml PBS 中，配制染色缓冲液。
    2. 移除细胞沉淀（3.1.8）中的上清液，并用 1.2 ml 染色缓冲液重悬。
    3. 将200 µl细胞悬液转移至冰上预冷的新的50 ml离心管中。此为阴性染色对照。
    4. 将剩余的1 ml细胞悬液转移至冰上预冷的新的50 ml离心管中，加入2 µl SIRHα-PE/Cy7（1:500稀释）和4 µl CD90-FITC（1:250稀释）。用移液管轻轻混匀细胞悬液，然后放回冰上。
    5. 将阴性对照和样品置于冰上，在4 °C条件下，于摇床中孵育1小时。
    6. 在两个15 ml离心管中加入3 ml RPMI培养基（含胰岛素），以准备样品收集管。每管加入3 µl ROCK抑制剂，置于冰上保存。
    7. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 5 分钟收集染色后的细胞，并用预冷的 PBS 每次至少 10 ml 重复洗涤两次。
    8. 加入1 µl DAPI（1 µg/ml）至5 ml染色缓冲液中。用移液管加入1–3 ml含DAPI的染色缓冲液，轻轻重悬样品沉淀。
    9. 向阴性对照中加入 500 µl 染色缓冲液（不添加 DAPI）。
    10. 将阴性对照和样品轻轻通过40 µm细胞滤网，以去除细胞团块，并转移至预冷的聚苯乙烯FACS管中，置于冰上。立即送至流式细胞分选仪进行分选。
    11. 类似于已建立的活细胞分选方法18，使用阴性对照设置圈门，选择活细胞（DAPI 阴性），并同时收集 FITC+ (即CD90+ 成纤维细胞）和PE/Cy7+ (即SIRPα+ 心肌细胞）群体在20 psi下独立分离图2).
      注意：设门后，可将阴性对照用4% PFA固定，通过心肌肌钙蛋白T染色确定分化效率。
      注意：一些研究者倾向于使用同型对照而非未染色对照来设门，以补偿非特异性抗体结合。所谓的荧光减一（FMO）对照是另一种可选方案。由于FITC、DAPI和PE-Cy7信号呈现明显的双峰分布，我们从阳性群体设门，保守地将门设在明显阳性的区域，这可能会排除部分真实阳性细胞，但有助于最大限度减少假阳性。
  3. 用于组织工程的细胞再聚集
    1. 分选细胞后，将两个收集管中的细胞均离心成团，再重悬于1 ml含10%新生牛血清、1%青霉素-链霉素和0.2%两性霉素B的DMEM培养基（“NBS培养基”）中。
    2. 重组 SIRPα+ 和 CD90+ 以3:1的比例混合细胞，并将混合后的细胞以每60 cm² 200万个细胞的密度接种于未经组织培养处理的培养皿中2 （10 cm 培养皿）。加入 10 ml NBS 培养基和 10 µl ROCK 抑制剂 Y-27632。
    3. 将细胞悬液置于组织培养孵育箱中培养48小时，以使细胞重新聚集形成小细胞团。

4. 人类心脏组织工程

  1. 构建多组织生物反应器
    注意：为补充图3A中的示意图，作者可应要求提供包含详细生物反应器设计图纸的CAD文件。
    1. 通过在一块9 × 33 × 3.25 mm的聚四氟乙烯长方体上钻出六个等距分布、直径为0.5 mm的孔，加工出PDMS母模。
    2. 使用端铣刀从聚砜材料上加工出一个尺寸为25 × 35 × 11 mm3的框架。该框架的作用是使PDMS柱（由上述模具铸造而成）与底板上的孔位对齐。
    3. 使用1 mm端铣刀，在一块20 × 40 × 5 mm3的黑色聚四氟乙烯材料上加工出6个孔（6 × 1 × 1 mm3），孔间距为4 mm，形成底板。
    4. 按10:1（质量比）混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）的弹性体基础液与固化剂，加入定制的聚四氟乙烯模具（步骤4.1.1）中，制成两排共六个力传感柱；在80 °C下真空环境中孵育过夜。固化后，小心地从母模中取出PDMS，并用黑色永久性记号笔在每个柱顶端做标记，以增强对比度，便于实现自动实时柱偏转追踪。
      注意：聚四氟乙烯材质较软，容易损坏。在PDMS浇铸前清洁母模时应小心操作，以确保系统的使用寿命和PDMS柱几何形状的一致性。每次使用后可用0.5 mm金属丝清理柱孔，但注意不要刮伤孔内壁。
      注意：另一种方法是在室温下将PDMS在真空环境中脱气数小时，然后在常压下使其固化。此方法可能减少PDMS固化过程中残留气泡的形成。
    5. 将所有组件在蒸汽高压灭菌器中灭菌。
      注意：PDMS母模（步骤4.1.1）和聚砜框架（步骤4.1.2）均可重复使用。由该模具制成的PDMS柱（步骤4.1.4）也可重复使用，但大约仅限使用10次。不过，可根据需要使用母模重新制作更多PDMS柱。
  2. 收集重聚心脏细胞
    1. 从培养箱中取出重聚细胞，将全部10 ml重聚培养基转移至一个50 ml离心管中。
    2. 用3 ml PBS冲洗培养皿，并将冲洗液转移至含有重聚培养基的同一50 ml离心管中。
    3. 向10 cm培养皿中加入3 ml 0.04%胰蛋白酶/0.03% EDTA，放回培养箱中孵育5分钟。
    4. 5分钟后，在倒置显微镜下以10倍物镜观察培养皿，确认细胞是否完全从皿壁脱离。若仍有少量细胞团块附着，可轻轻晃动培养皿以促进脱落。若仍有残留，则放回培养箱继续孵育2–3分钟。总孵育时间不得超过10分钟，否则可能导致显著的细胞死亡。
    5. 待所有细胞完全脱离后，加入3 ml胰蛋白酶中和液，轻轻混匀中和液与含细胞的胰蛋白酶溶液，并转移至含有重聚培养基和PBS冲洗液的50 ml离心管中。
    6. 用5 ml PBS冲洗整个培养皿，并将冲洗液转移至同一含有细胞的50 ml离心管中。
    7. 在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。
    8. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml NBS培养基中，然后转移至1.5 ml微量离心管中。
    9. 在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。此时心脏细胞（CD90+基质细胞和SIRPα+心肌细胞）已准备好用于组织构建。
  3. （可选）收集感兴趣的补充细胞
    注意：除了仅包含SIRPα+心肌细胞和CD90+成纤维细胞样细胞的定义组织外，还可添加其他感兴趣的细胞类型，以研究其对组织功能的影响。例如，已有研究表明大鼠间充质干细胞（MSCs）可增强大鼠工程化心脏组织的功能1。以下可选步骤描述了为该定义系统收集补充细胞的方法。
    1. 使用0.25%胰蛋白酶/0.1% EDTA收集感兴趣的补充细胞类型（例如，间充质干细胞）。
    2. 在室温下以300 × g离心5分钟沉淀细胞，然后重悬于5 ml适用于该细胞类型的细胞培养基中。例如，对于MSCs，使用添加20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.2%两性霉素-B的DMEM培养基进行培养。
    3. 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后再次在室温下以300 × g离心5分钟沉淀细胞。
    4. 弃去上清液，将细胞重悬于1 ml细胞培养基中，并转移至1.5 ml微量离心管中。
    5. 在室温下以300 × g离心5分钟沉淀细胞。
    6. 弃去上清液。此时补充细胞已准备好用于组织构建。
      注意：若补充细胞的添加量为组织总细胞数的10%，则对于定义组织而言，每份组织需添加50,000个补充细胞（因每份组织含有500,000个心脏细胞，包括CD90+基质细胞和SIRPα+心肌细胞）。
  4. 构建人源工程化心脏组织
    注意：所有溶液需冰上保存，细胞置于室温。以下所列体积均为每份组织所需。通常，两个6孔板的心脏分化细胞可构建约六份组织。
    1. 将60.0 µl的5 mg/ml胶原蛋白储备液用1.5 µl 1 M NaOH、9.6 µl 10× PBS和24.9 µl无菌超纯去离子水稀释至3.125 mg/ml。
      关键步骤：配制过程中应避免引入气泡，因气泡会干扰组织的正常形成。
    2. 向稀释后的胶原蛋白溶液中加入各12.0 µl的10× MEM和0.2 N HEPES（pH 9），混匀形成胶原混合液。为避免引入气泡，应沿15 ml离心管管壁缓慢加入上述两种溶液。
    3. 向胶原混合液中加入基底膜基质，使其终浓度为0.9 mg/ml，混匀后置于冰上，形成最终的组织混合液。最终胶原蛋白浓度应为2 mg/ml。
    4. 向组织混合液中加入500,000个重聚细胞（心肌细胞与成纤维细胞总浓度为2000万个/ml），再用无细胞NBS培养基或50,000个感兴趣的补充细胞类型（例如，hMSCs）补足至每份组织25 µl的终体积，并充分混匀，形成均匀的细胞悬液。
      注意：补充细胞的数量可根据不同应用调整。此处采用10%的补充比例。
    5. 小心地将25 µl细胞悬液移入生物反应器底板的六个孔中，避免在孔内引入气泡。
    6. 将两排PDMS力传感器分别插入聚砜框架两侧，形成六对相对的柱，然后将框架倒置在底板上方，使每对柱分别插入含有细胞悬液的孔中。
      注意：聚砜框架上设有定位凸片，有助于PDMS柱的对齐。
    7. 小心地将生物反应器（底板朝下）放入60 mm培养皿中，再将该培养皿（不加盖）放入10 cm培养皿中，盖上10 cm皿盖，然后将整个生物反应器组件移入组织培养箱中，静置2小时以使组织凝胶化。
    8. 2小时后，从培养箱中取出生物反应器，向整个组件中加入14 ml NBS培养基，液面需覆盖底板。放回培养箱，并每天更换一半培养基。
    9. 48小时后，小心地逐侧轻轻移动底板，使其逐步脱离框架数毫米，更换培养基，然后将生物反应器（组织面朝下）放回培养基中。
    10. 继续每天更换一半NBS培养基。
      注意：组织的自发性收缩最早可在构建后第3天观察到，可测量的搏动张力最早在第5至7天出现。

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结果

为获得心肌细胞，采用略微改进的 Boheler 和 Lian 分化方法30,31。分化必须在细胞生长的对数期开始，同时起始细胞群体需达到足够高的融合度，以便在分选后获得可用数量的细胞（约75%融合度为最佳）。通常情况下，将 H7 hESCs 以每6孔板每孔140,000个细胞的密度接种于Essential 8培养基中，在37 °C、5% CO2的培养箱中培养4天后，可获得适合启动分化的融合度，如图1A-D所示。由于胰岛素会抑制分化过程中的心肌特化32，因此在分化的前10天使用无胰岛素培养基（分化培养基I，表1）。一旦通过添加GSK3抑制剂CHIR99021启动分化，将出现明显的细胞死亡（图1E）。因此，必须每天更换培养基。在分化第2天，将细胞从CHIR99021中移出，并在不含小分子添加物的分化培养基I中静置24小时。在分化培养基中静置24小时后，用IWR-1处理细胞48小时，随后细胞开始自组织形成细胞簇（图1F

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讨论

构建明确定义的人源工程化心肌组织（hECT）可提供一种更为一致且可靠的人类心肌细胞功能模型。关键在于，该系统中的所有细胞及细胞外成分均是已知的，并可根据需要进行操控，从而消除了由分化过程产生的其他未知细胞类型的干扰影响。为了平衡细胞快速生长与高产量，建议在人胚胎干细胞（hESCs）贴壁后第四天、达到约75%融合度时开始分化。此外，在细胞解离以及分选后的再聚集过程中使用ROCK抑制剂Y-27632，可显著提高细胞存活率。在分化过程中出现心肌细胞的自发性搏动，是评估分化效率与细胞健康状态的重要指标。若未观察到自发性搏动，可能提示分化效率低下，原因可能是试剂效果不佳或干细胞多能性的丧失。

在构建组织的过程中，PDMS 柱必须与基板中的通道精确对齐，以形成结构完整且能够维持足够长时间的组织，从而用于测量收缩功能。为了提高装置对准的便捷性，并增强组织在易断裂的柱周围形成时的牢固性，可以在通道末端增加额外宽度（每侧约一个柱体直径），如图 3A中“哑铃”形通道所示。若装置对准不当，组织要么在培养后不久从柱体上脱落，要么在移除基板时仍滞留在孔中。如果结构完整的组织...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究获得了以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）授予 T.J.C. 的项目（1F30HL118923-01A1）；NIH/国家心肺血液研究所（NHLBI）PEN 合同 HHSN268201000045C 授予 K.D.C. 的项目；香港研究资助局 TRS T13-706/11 项目（K.D.C.）；美国国立卫生研究院（R01 HL113499）授予 B.D.G. 的项目；美国心脏协会（12PRE12060254）授予 R.J. 的项目；以及中国香港特别行政区研究资助局（TBRS, T13-706/11）授予 R.L. 的项目。此外，T.J.C. 还获得了 NIH DRB 5T32GM008553-18 的额外资助，并获得美国国家儿童健康与人类发展研究所（NIDCR）跨学科系统与发育生物学及出生缺陷培训项目 T32HD075735 的培训资助。作者谨此衷心感谢纽约市立学院 Zahn 中心的 Arthur Autz 在生物反应器加工方面的协助，以及 Mamdouh Eldaly 提供的技术支持。我们还感谢 Kenneth Boheler 博士在心肌细胞分化方面的指导，以及 Joshua Hare 博士慷慨提供人源间充质干细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养公司货号备注
两性霉素BSigma-AldrichA2411用DMSO配制2.5 mg/ml的储存液，并通过滤膜除菌
含胰岛素的B27Life Technologies17505055
不含胰岛素的B27Life TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004配制6 μM的储存液，分装后于-20 °C保存。
Essential 8 培养基Life TechnologiesA1517001
H7人胚胎干细胞WiCellWA07
人胚胎干细胞专用基质，Corning MatrigelCorning354277在4 °C冰上过夜解冻，分装为每管150 μl，于-20 °C保存。
IWR-1Sigma-AldrichI0161配制10 mM的储存液并分装，于-20 °C保存
新生牛血清Life Technologies16010159
非酶解离试剂：温和细胞解离试剂Stem Cell Technologies7174
青霉素-链霉素Corning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093需冷藏保存
Y-27632（ROCK抑制剂）Stemgent04-0012重悬至10 mM的储存浓度，分装后于-20 °C保存。避免反复冻融。
细胞分选公司货号备注
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
酶解解离试剂：Cell Detach Kit I（含0.04%胰蛋白酶/0.03% EDTA、胰蛋白酶中和液和Hanks平衡盐溶液） PromoCellC-41200
胎牛血清Atlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
组织构建公司货号备注
0.25%胰蛋白酶/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CI可选：用于收集额外感兴趣的细胞
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS粉末Sigma-AldrichP3813
牛I型胶原蛋白Life TechnologiesA10644-01需置于冰上保存
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s改良Eagle培养基（DMEM），高糖Sigma-AldrichD5648
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow CorningSylgard 184
HEPES钠盐Sigma-AldrichH3784
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465
材料公司货号备注
1.5 ml 微量离心管Fisher ScientificNC0536757
15 ml 聚丙烯离心管Corning352096
5 ml 聚苯乙烯圆底试管Corning352235带一体化35 μm细胞筛网
50 ml 聚丙烯离心管Corning352070
6孔平底组织培养板Corning353046
一次性细胞刮刀Biologix70-2180
聚砜McMaster-Carr
聚四氟乙烯（特氟龙）McMaster-Carr
设备公司货号备注
解剖显微镜OlympusSZ-61或类似型号，必须具备可安装高速相机的支架
电刺激系统Astro-Med, IncGrass S88X Stimulator
高速相机PixelinkPL-B741U或类似型号，但必须能够以每秒100帧的速度进行准确的数据采集
培养板温度控制装置用于在数据采集期间维持培养基温度。
定制材料公司货号备注
LabView 后处理追踪程序可向作者申请获取

参考文献

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人源工程化心肌组织活细胞分选SIRPα标志物CD90成纤维细胞标志物胶原基质生物反应器系统间充质干细胞收缩力测量组织收缩FACS收集
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