在此，我们介绍一种构建三维的方案 体外 由原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞与细胞外基质分层构建的腹膜腔内衬模型，用于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。
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本文内容
摘要
摘要
卵巢癌的转移模式与大多数其他上皮性肿瘤显著不同，因其极少通过血行转移。相反，原发肿瘤脱落的卵巢癌细胞随腹腔液流动，播散至腹腔内的转移部位。这些部位尤其是腹膜和大网膜，均为被间皮层覆盖的器官。为研究卵巢癌扩散的过程，我们构建了一种复杂的三维培养系统，用以重建腹腔内壁结构 体外原代人成纤维细胞和间皮细胞从人网膜组织中分离获得。随后将成纤维细胞与细胞外基质混合，并在其表面覆盖一层原代人间皮细胞，以模拟转移性卵巢癌细胞所接触的腹膜和网膜表面。如图所示，该类器官模型用于研究卵巢癌扩散的早期阶段，包括癌细胞的黏附、侵袭和增殖。该模型已在多项研究中被用于探讨微环境（细胞成分与非细胞成分）在卵巢癌早期扩散过程中的作用。此外，该模型已成功应用于高通量筛选，并用于鉴定和验证卵巢癌转移的抑制剂。
引言
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤1大多数患者在癌症已扩散至整个腹膜腔后才得以确诊。一旦癌症在腹膜腔内广泛扩散，减瘤手术和化疗通常不足以防止癌症复发和产生化疗耐药性，导致五年生存率不足30%。卵巢癌的转移主要局限于腹膜腔，其他多种癌症类型，包括胃癌、胰腺癌和结肠癌，也会转移至腹膜腔内的相同解剖部位。通常情况下，卵巢癌细胞会从原发肿瘤脱落 原位 输卵管癌或原发性卵巢肿瘤细胞以单细胞或球状体形式随腹腔液播散，并附着于大网膜、肠管及腹壁的间皮细胞表面2.
肿瘤微环境在多种癌症的疾病进展和化疗耐药性中起着重要作用3-6。腹腔是一个独特的微环境，其大部分表面被单层间皮细胞覆盖（图1A）7。间皮层作为屏障，形成低摩擦表面，通常可防止癌细胞黏附8。在间皮层下方紧邻的是一层主要由成纤维细胞和细胞外基质（ECM）构成的结构，该结构促进癌细胞的黏附和侵袭8。卵巢癌细胞分泌多种因子，诱导间皮细胞层发生改变，从而增强卵巢癌细胞的黏附、侵袭和转移能力9,10。卵巢癌细胞通过整合素和CD44介导的机制黏附于间皮表面（图1B）11-16。
历史上，已开发出多种三维模型用于研究卵巢癌与微环境之间的相....
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方案
所述的所有研究方案均经过芝加哥大学机构审查委员会（IRB）的审查。在手术前已从每位患者处获得知情同意，且本研究已获芝加哥大学IRB批准。处理人体组织时，应使用II级生物安全柜和手套，以提供保护并降低细胞污染的风险。
1. 原代未转化间质细胞的分离与培养
- 人体组织的采集与制备
- 获取2 cm的人体大网膜标本3，于腹部手术中取出后，立即将组织浸入室温磷酸盐缓冲液（PBS）中（图2A一块3 cm × 2 cm大小的大网膜通常可获得100万个原代人腹膜间皮细胞（HPMC）和20万个原代人成纤维细胞或正常大网膜成纤维细胞（NOF）。
- 将组织浸泡过的 PBS 以 0.5 × g 离心 3 分钟 采集后应尽快进行< 2 小时，PBS）后，将组织转移至含有 20 ml 新鲜 PBS 的 50 ml 锥形管中。将组织切成 5 mm3 用手术刀在直径15 cm的无菌培养皿中切碎成小块（图2B).
- 原代人腹膜间皮细胞的分离8
- 将切碎的组织转移至50 ml锥形管中，静置1分钟，以分离HPMC 使固体碎片浮至顶部（图2C & D）。底部液体中将含有 HPMC 和红....
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结果
通过将原代人成纤维细胞与I型胶原蛋白混合，然后在其上接种数量为成纤维细胞5倍的间皮细胞，构建出类器官培养体系。在加入卵巢癌细胞以研究其黏附、侵袭或增殖之前，该培养体系需孵育至少18小时。每项实验均使用来自不同患者的多个（n=3–5）三维（3D）类器官培养物重复进行，并在每种条件下测试多个孔以完成黏附（n=5）、增殖（n=5）和侵袭实验（n=3）。卵巢癌细胞在4小时后黏附于三维类器官培养物（图4），在72小时后在培养物上增殖（相当于HeyA8细胞倍增时间的6倍）（图5），并在24小时后发生侵袭（图6）。HeyA8卵巢癌细胞的黏附、增殖和侵袭均依赖于整合素（图4–6）。具体而言，RGD肽以及针对α5-整合素、β1-整合素和αvβ3-整合素的阻断性抗体可抑制卵巢癌细胞在类器官培养物上的黏附，而RAD肽、对照抗体及β4-整合素抗体则无此抑制作用（图4）10
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讨论
建立了腹膜微环境的类器官模型，以评估微环境中细胞组分和固有组分在卵巢癌扩散过程中各自的及协同的功能。文中提供了用于铺板及定制三维类器官培养体系以研究卵巢癌细胞黏附、增殖和侵袭的具体实验方案。原代人网膜间皮细胞和成纤维细胞取自患者，并在早期代次中使用，以保持其正常形态及患者间的个体差异。在该模型中，将正常网膜成纤维细胞和细胞外基质（通常为I型胶原）与原代人间皮细胞单层共同分层培养。该模型在组织学上模拟了腹膜内衬结构，使我们能够重现并研究卵巢癌转移过程中的关键事件，包括卵巢癌细胞的黏附、增殖和侵袭8,27。
此前，用于研究卵巢癌与微环境相互作用的3D模型较为有限13,14,21-25，而该3D类器官模型是首个成功重建腹膜腔间皮衬层结构的模型。人网膜组织来源于不同年龄和健康状况的患者。组织的健康状况直接影响间皮细胞和成纤维细胞的分离效果。健康组织颜色较浅，小叶较小（1–3 mm），而颜色偏橙、伴有较大脂肪小叶（>5 mm）的组织则健康程度较低。当组织从手术室转移至实验室时，大部分HPMC会在初始PBS冲洗中脱落。然而，组织越健康，HPM.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢所有住院医师和主治医师，特别是芝加哥大学妇产科的 A.F. Haney 博士，为收集大网膜活检样本提供的帮助。同时，我们感谢 Stacey Tobin 和 Gail Isenberg 对本文稿的细致编辑。本研究由芝加哥熊人橄榄球俱乐部的慈善受益机构 Bears Care、美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）R21 NS075702 项目以及美国国家癌症研究所 R01 CA111882 项目（授予 E.L.）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. 原代细胞的分离与培养 | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| 单刃剃须刀片 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm 培养皿 | BD Biosciences | 353025 | |
| 玻璃烧瓶 | ? | ? | |
| 胎牛血清（FBS） | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| 含 L-谷氨酰胺的 DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| MEM 维生素 | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM 非必需氨基酸 | Corning | 25-025-CI | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 摇床 | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5702 | |
| 培养箱 | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| 胰蛋白酶 EDTA，1× (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| 透明质酸酶 | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 培养瓶 | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 培养瓶 | BD Biosciences | 353112 | |
| 移液器吸头 | Rainin | P2, P10, P20, P200 和 P1000 | |
| 移液器吸头 | Corning | 带滤芯吸头 P2, P10, P20, P200 和 P1000 | |
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 2. 三维培养接种 | |||
| 细胞计数仪 | Invitrogen | Countess | |
| Countess 细胞计数板载玻片 | Invitrogen | C10313 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| I 型胶原蛋白（大鼠尾部来源） | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 孔板，透明底，黑色 | BD Biosciences | 353219 | |
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 3. 黏附实验 | |||
| 多通道移液器 | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | Minimax | |
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 5. 侵袭实验 | |||
| 细胞培养小室（8 µm，24 孔） | BD Biosciences | 353097 | |
| 棉签 | Q-tips | cotton swabs | |
| 显微镜 | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | 公共领域 | ||
| 24 孔板 | BD Biosciences | 353047 | |
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 6. 抗体 | |||
| 抗整合素 αVβ3 抗体，克隆号 LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
参考文献
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
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重印与许可
