通过溶解动态核极化（DNP）实现的灵敏度提升，使得利用核磁共振（NMR）和磁共振成像（MRI）实时追踪代谢过程成为可能。本文讨论了一种专用于研究酶促反应的溶解DNP装置的特性与性能。
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本文内容
摘要
摘要
基于核磁共振（NMR）研究的主要局限性在于灵敏度较低，这导致需要较长的采集时间，从而无法实现对代谢转化过程的实时NMR检测。通过溶解态动态核极化（dissolution DNP）实现的超极化技术，借助电子自旋向核自旋的极化转移所产生的显著非平衡态核磁化，部分克服了灵敏度问题。由此获得的高强度NMR信号可用于实时监测化学反应。然而，超极化NMR的缺点在于信号采集的时间窗口有限，通常仅为核自旋纵向弛豫时间常数的数量级。 T1，或者在有利情况下，接近耦合核单重态的弛豫时间常数的数量级 TLLS细胞对内源性分子的摄取及代谢速率可为肿瘤发生发展和药物反应提供重要信息。大量既往的超极化核磁共振研究已证实丙酮酸作为代谢底物在监测酶活性方面的相关性 体内本研究详细描述了利用超极化核磁共振（NMR）技术研究酶促反应（特别是乳酸脱氢酶（LDH）存在下丙酮酸向乳酸转化速率）所需的实验装置与方法。
引言
动态核极化（DNP），1,2 一种旨在增强核自旋极化的技术 即“上”自旋与“下”自旋布居数之间的不平衡（P = [N↑ - N↓] / [N↑ + N↓])，于20世纪50年代首次被引入。核自旋如 13C 可被极化至高达 P = 10-1 在有利条件下，通常在约1 K的温度和3.357 T的磁场中。3,4 21世纪初，溶解性动态核极化（dissolution DNP）技术的问世为生物应用带来了突破。该技术通过将冷冻的极化样品溶解于过热水中，同时保持低温下获得的高核极化水平，从而实现极化信号的显著增强。5 液态核磁共振信号增强了10倍3-104 与常见的热极化常温核磁共振（RT NMR）条件相比，溶解态动态核极化（dissolution DNP）因此提供了一种非侵入性测量生化反应速率的方法 原位 实时进行，允许通过核磁共振以1秒或更短的时间分辨率监测动态变化。6-10 还能够检测极低浓度的分析物。11
在非侵入性....
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方案
注意：所有数据分析均使用商业软件完成。
1. 准备偏振溶液
- 制备 2 ml 的 1.12 M 溶液 13C-标记的丙酮酸钠（Na+[CH3-CO-13COO]-，掺有33 mM TEMPOL自由基（4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基，极化剂）的底物溶液4 2:1 D2O/d6-乙醇用于 13C 观察。注意：由于二甲苯具有易燃性，操作时必须采取防护措施。6-乙醇
- 验证自由基浓度在所实现的极化水平上是否处于最佳状态。
- 略微改变第1.1点溶液中的自由基浓度例如，至 30 mM 或 35 mM。
- 通过迭代法确定固态增强倍数（见步骤3），并找出产生最大增强效果的自由基浓度。
2. 偏振
- 通过降温程序降低 DNP 冻存仪的温度。点击冻存仪软件界面上的“Cooldown”按钮（图 2D）。
- 通过填充程序在 DNP 冻存仪中收集液氦。点击冻存仪软件界面上的“Filling”按钮（图 2D）....
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结果
利用溶解DNP增强NMR信号
DNP效应是指在微波照射样品的条件下，将未配对电子自旋（通常来自稳定的自由基分子）的高极化度转移至NMR活性核的过程。最常用的自由基为TAM(OXO63)和TEMPOL4。使用TEMPOL进行极化时，可通过“交叉极化”方法优化极化过程25。
为了在固态下获得最大的核极化，优化稳定自由基的浓度对该技术的成功至关重要。在本研究的实验条件下，TEMPOL 的最佳浓度为 33 mM。该底物的极化程度足以实时监测其酶促转化过程。
巴黎笛卡尔大学安装的极化器的磁场为 B0 = 3.35 T，该系统的各组件如上文所述（图 1–图 3）。低温恒温器的设计确保最终.......
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讨论
溶解DNP NMR实验的关键因素包括：（i）底物所达到的极化水平，这决定了实验所需的最低产物浓度以及可进行的信号采集次数；（ii）磁化寿命，需与从极化位点到检测位点的转移时间以及底物转化速率相比较。本文所述的溶解DNP装置的注射系统可在短短3–4秒内完成样品转移。尽管该转移速度不及S. Bowen和C. Hilty提出的方法迅速26，但由于低磁场下纵向弛豫较为缓慢，丙酮酸盐的极化损失仍受到限制。[1-13C]丙酮酸盐因其羧基核具有较长的T1弛豫时间，可在低至10-3 U/ml的浓度下测量乳酸脱氢酶（LDH）的通量。
采用溶解态动态核极化（DNP）获得的高信噪比表明，即使对于更低浓度的[1-13C]丙酮酸以及更低的酶促转化速率，仍具有检测灵敏度。当前达到的极化水平使得在液态核磁共振波谱仪中使用小翻转角 α = 10° 时，可获得超过200次具有显著信噪比的实验信号。这为重复时间与翻转角的进一步优化提供了空间。在固态极化建立过程中，某些分子与.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益
致谢
作者感谢 J. J. van der Klink 博士在设备选型与组装方面提供的帮助，同时感谢 F. Kateb 博士和 G. Bertho 博士的有益讨论。A.C. 受瑞士国家科学基金会（项目编号 PPOOP2_157547）资助。我们感谢巴黎索邦城市大学（NMR@Com、DIM Analytics、巴黎市政府）、法国医学研究基金会（FRM ING20130526708）以及布兰库西—休伯特合作伙伴计划（Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK）提供的经费支持。我们的团队隶属于 Equipex 项目 Paris-en-Résonance 和 CACSICE。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNP 极化仪 | Vanderklink s.a.r.l (瑞士) | /// | 用于样品极化的低温恒温器及电子设备 |
| 真空系统组件 | Edwards vacuum (法国) | 各种 | - 涡轮分子泵系统 - 隔膜泵系统 - 高容量罗茨泵系统 - 真空接头及组件 |
| DNP 3.35T 磁体 | Bruker (法国) | ||
| 500 MHz 核磁共振波谱仪 | Bruker (法国) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (美国) | 数据分析软件 | |
| 化学品 | |||
| 1-13C 标记丙酮酸钠，13C 原子丰度 99% | Sigma Aldrich (法国) | 490709 | |
| 氘代乙醇-D6，无水，氘原子丰度 99.5% | Sigma Aldrich (法国) | 186414 | |
| 4-羟基-TEMPO，纯度 97% | Sigma Aldrich (法国) | 176141 | |
| 重水 | Sigma Aldrich (法国) | 151882 | |
| 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH） | Sigma Aldrich (法国) | ||
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma Aldrich (法国) | ||
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich (法国) | ||
| 磷酸盐缓冲液，pH = 7.0 | Sigma Aldrich (法国) | ||
| 乳酸脱氢酶（LDH） | Sigma Aldrich (法国) | L-2500 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich (法国) |
参考文献
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).
- Wolber, J., Ellner, F., et al.
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重印与许可
