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方法文章

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

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DOI：

10.3791/53568

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2015年12月28日

 ,  ,  ,  , 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

本文内容

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摘要

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。

摘要

制备具有复杂翻译后修饰的重组蛋白是结构与功能研究中面临的主要挑战之一。通过瞬时转染哺乳动物细胞系实现快速建立并获得高表达量，可有效克服这一障碍，尤其适用于天然经由内质网和高尔基体介导的分泌途径转运的蛋白质表达。本文介绍一种利用人源HEK293F和HEK293S细胞系表达蛋白的方案，该方法采用专为高产量蛋白表达设计的哺乳动物表达载体。该系统的适用性通过三种代表性糖蛋白的表达得以验证，每升培养液可纯化获得95–120 mg蛋白。这些蛋白包括人FcγRIIIa和大鼠α2-6唾液酸转移酶ST6GalI（两者均带有N端GFP融合标签），以及未经修饰的人免疫球蛋白G1 Fc片段。该高效表达系统采用无血清培养基，适用于制备用于质谱和核磁共振波谱结构研究的同位素标记蛋白与糖类。此外，通过添加小分子化合物可调控N-聚糖的组成，以阻止特定的糖链修饰，且不影响蛋白表达产量。

引言

要获得大量正确折叠且经过适当翻译后修饰的人类蛋白质，以进行结构与功能的详细分析，仍然是一个重大挑战。目前已有多种表达系统可用于生产具有天然样功能和行为的重组蛋白。其中，细菌表达系统（主要是大肠杆菌Escherichia coli菌株）由于其操作简便，成为科研领域中最易获取且最常用的工具，尽管也已有酵母、植物、昆虫和哺乳动物表达系统的相关报道1-4。然而，这些系统中的大多数无法对目标蛋白进行恰当的翻译后修饰。Barb 和 Moremen 实验室的一个核心研究兴趣是生产具有正确糖基化修饰的真核蛋白。许多人类蛋白需要正确的糖基化才能发挥正常功能（见5）。

真核生物的糖基化机制十分复杂，能够进行多种修饰，包括天冬酰胺（N）连接和丝氨酸/苏氨酸（O）连接的复杂聚糖6。据估计，超过>50%的人类蛋白质具有N-糖基化修饰7。聚糖是许多蛋白质的重要组成部分，例如治疗性单克隆抗体、促红细胞生成素以及凝血因子IX等。尽管目前已存在多种制备适当N-糖基化蛋白质的方法，范围从完全化学合成8-10、化学-酶法合成11-14，到从基因工程重组系统中回收获得15-20，但毫不意外的是，人类表达系统迄今为止仍被证明是生成人源蛋白质最可靠的方法。

许多治疗性人类糖蛋白是利用哺乳动物细胞的重组系统生产的。常用的系统包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、小鼠骨髓瘤（NS0）细胞、幼年仓鼠肾（BHK）细胞、人胚胎肾（HEK-293）细胞以及人视网膜细胞系，这些细胞系可通过贴壁培养或悬浮培养用于蛋白质生产4,21,22。然而，哺乳动物蛋白表达系统需要建立稳定细胞系，使用昂贵的培养基，并依赖基质辅助的转染方法23。

借助多种试剂可实现哺乳动物细胞转染，这些试剂包括磷酸钙24,25、阳离子聚合物（DEAE-葡聚糖、聚凝胺、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺（PEI））或带正电荷的阳离子脂质体26-29。PEI 是一种多聚阳离子、带电荷的线性或支化聚合物（25 kDa）26，可与 DNA 形成稳定的复合物，并通过内吞作用进入细胞。当内体酸化后，PEI 被认为会膨胀，导致内体破裂，从而将 DNA 释放到细胞质中26,30。

直到最近，悬浮培养中的瞬时转染仍需先形成DNA/PEI复合物，再将其加入细胞培养物中29。然而，Würm及其同事报道了一种在HEK293细胞中优化用于重组蛋白表达的高效方案，该方案在细胞培养体系中就地（in situ）形成DNA/PEI复合物31,32。这种方法避免了复合物的预先制备、灭菌以及缓冲液置换至培养基的步骤。通过进一步优化，加入可增强表达的质粒，显著提高了表达产量33。本文所述方法在此基础上发展而来，具有广泛的适用性。此外，还可通过改变表达条件来影响N-糖链的组成。

HEK293S 细胞系携带一个基因缺失，可使 N-聚糖的加工过程停滞在中间阶段，从而表达出具有均一 N-聚糖的蛋白质，其结构包含 2 个 N-乙酰葡糖胺残基和 5 个甘露糖残基（Man5GlcNAc2）34,35。这些细胞缺乏 N-乙酰葡糖胺基转移酶 I（GntI）基因，而该基因是下游 N-聚糖加工所必需的36,37。使用糖基转移酶抑制剂（包括千金藤素、唾液酸类似物、岩藻糖类似物 2-脱氧-2-氟-岩藻糖）也可产生类似效果，限制 N-聚糖的加工过程38-41。

本方案采用如图142,43所示的pGEn2载体，通过PEI辅助的瞬时转染法将质粒转入哺乳动物细胞系（HEK293F或HEK293S细胞），并获得大量正确糖基化的蛋白产物。该系统具有良好的稳定性，可适用于多种因素的调控，包括同位素标记和糖链工程，以实现高滴度重组蛋白的生产。

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方案

本方案适用于使用HEK293F或HEK293S细胞进行表达。 

1. 细胞建立 

  1. 培养物接种
    注意：所有细胞培养操作均须在生物安全二级（BSL-2）设施中进行，所有带入生物安全柜的物品必须用70%乙醇水溶液喷洒消毒。
    1. 在135 rpm、80%湿度和8.0% CO₂条件下操作培养摇床2 和 37 °C。转动 "开启" 在操作前至少1小时开启生物安全柜的紫外灯。将密封的A培养基和B培养基瓶置于37 °C水浴中预热1小时。
    2. 用70%乙醇水溶液喷洒125 ml带通气盖的锥形培养瓶、移液器、移液枪和预热的培养基瓶进行消毒。将这些物品放入生物安全柜中。注意：仅对125 ml锥形培养瓶外层的塑料包装进行消毒，且仅在将其移入生物安全柜后方可拆除包装。
    3. 对于30 ml培养液，吸取26 ml培养基A和3 ml培养基B（占最终培养液体积的10%），转移至125 ml锥形培养瓶中，轻轻振荡混匀（此后称为新鲜培养基）。
    4. 将一管在 -80 °C 冻存的 HEK293F 细胞置于冰上，转移至细胞培养室。注意：HEK293F 细胞的提供密度为 1 × 107 细胞/毫升
    5. 将冻存管在37 °C水浴中轻轻温育，以部分解冻细胞（约需1分钟，细胞不应完全解冻）。用70%乙醇水溶液擦拭冻存管外壁进行消毒，然后将其转移至生物安全柜中。
    6. 使用1 ml移液器吸取细胞悬液（约0.7 ml），转移至含有29 ml新鲜培养基的125 ml锥形瓶中。盖紧培养瓶盖，将其放入恒温摇床中。
  2. 细胞培养维护：检测细胞密度、活力及传代次数
    1. 解冻培养物24小时后，按照以下方案检测细胞密度。注意：解冻后需将细胞培养24小时，以确保细胞正常生长及存活率 >80%.
    2. 用70%乙醇水溶液对培养瓶进行消毒，并将其移入生物安全柜中。
    3. 使用1 ml移液器和移液器，缓慢吸取100 μl悬浮培养液，转移至无菌的0.5 ml离心管中。盖好管盖，并尽快将培养瓶放回摇床。
    4. 将7.5 μl台盼蓝溶液与7.5 μl细胞混合。取7.5 μl细胞/台盼蓝混合液，充分混匀后转移至计数载玻片。
    5. 打开自动细胞计数仪，将计数载玻片放入加载室。自动读取器将被激活，自动计数细胞，结果以每毫升细胞数量和细胞活力百分比表示。
    6. 确定在细胞密度为 0.3 x 10 时，将供体培养物转移至新鲜培养基所需的体积6 活细胞/毫升
      注：参见补充材料中的示例计算。
    7. 重复步骤 1.1.2 和 1.1.3 的 "1.1 培养物接种" 参照上述方案准备新鲜培养基所需的材料。
    8. 将培养基A（23 ml）和培养基B（3 ml）转移至一个新的125 ml培养瓶中。将培养基A和培养基B的储备瓶从生物安全柜中移出。
      注意：培养基瓶的储备不应与HEK 293F细胞同时存放于生物安全柜中，以降低污染储备培养基瓶的风险。
    9. 从培养箱中取出HEK293细胞培养物，用70%乙醇水溶液喷洒消毒。使用新的移液管，从培养物中吸取细胞分装液（4 ml，该体积根据步骤1.2.6确定），转移至含有新鲜培养基的培养瓶中。
    10. 将两种培养物从生物安全柜转移至按照1.1.1节设定的摇床培养箱中。培养细胞至密度约为2-3 × 10⁶ 个/mL。6 活细胞/毫升
      注意：细胞的倍增时间约为32小时，达到此密度需要3-4天。在首次转染前，将细胞培养3-4代，以获得稳定的细胞生长模式。

2. 准备转染所需材料

  1. 准备 HEK293 细胞（第 1 天）
    1. 根据步骤 1.2，在转染前 24 小时，将细胞传代至新鲜的培养基 B 中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/ml。
      注意：转染培养的体积取决于细胞数量。较大体积的转染培养（>20 ml）在此阶段需要更大体积的细胞培养物。
  2. 准备材料储备液
    1. 配制线性聚乙烯亚胺（PEI）的储备液，浓度为 1 mg/ml，溶剂为含 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 150 mM NaCl 的缓冲液（pH 7.5）。充分溶解 PEI，此过程在室温下可能需要 30–60 分钟。通过 0.22 μm 滤器过滤除菌，长期保存置于 -20 °C。
    2. 制备无菌质粒 DNA（根据步骤 2.2.2.1–2.2.2.4）。质粒构建方法在其他文献中有描述42。此处简要说明 DNA 制备流程：
      1. 将含有 pGEn2 载体的化学感受态 Escherichia coli 细胞接种于 1 L LB 培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L）中，并添加 100 μg/ml 氨苄青霉素。在非加湿、振荡培养箱中于 37 °C 培养 E. coli。
      2. 根据生产商的 DNA 纯化方案，纯化编码目标质粒 DNA 的 pGEn2 载体。
      3. 为确保质粒 DNA 完全无菌，应在生物安全柜内完成 DNA 提取过程中的最终异丙醇沉淀和重悬步骤。
      4. 向洗脱的 DNA 中加入质粒提取试剂盒中指定体积的异丙醇，于 10,000 × g 离心 10 分钟。用 70 % 乙醇水溶液对外部 DNA 容器进行消毒后，转移至生物安全柜内。使用移液器弃去上清异丙醇，空气干燥 DNA 沉淀。干燥后，将沉淀重悬于无菌的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8.0）中。
    3. 配制 220 mM 丙戊酸（VPA）水溶液储备液，并通过无菌 0.22 μm 滤器过滤除菌。溶液保存于 -20 °C，待后续使用。

3. 建立瞬时转染 

  1. 转染（第0天）
    1. 通过执行步骤 1.2.2 至 1.2.5 检查细胞密度 "1.2. 细胞培养维持" 上述。确定用于转染的细胞数量（2.5–3.0 × 106 活细胞数/mL，存活率 >95%）。参见补充材料中的示例计算。
    2. 使用无菌血清移液管，将上一步计算出的悬浮培养细胞体积（此处为67 ml）转移至250 ml离心管中。在100 × g条件下离心5分钟，收集细胞。
    3. 同时，根据步骤 1.1.3 配制新鲜的转染培养基 "1.1 培养物接种" 如上所述。参见补充材料中的示例计算。同时，将5 ml新鲜培养基转移至无菌15 ml离心管中，备用。
    4. 将含有细胞沉淀的离心管转移至生物安全柜中，先用70%乙醇水溶液对外管壁进行消毒，然后使用无菌移液管弃去含有用过的培养基的上清液。
    5. 用10 ml新鲜培养基通过移液吹打重悬沉淀细胞，充分混匀后转移至含有新鲜转染培养基（按步骤3.1.3制备）的培养瓶中。拧紧通气细胞培养瓶的瓶盖，将培养瓶放入已设定好的培养箱（如1.1.1所述）中，在振荡条件下孵育15分钟至1小时。
    6. 在此期间，使用新鲜培养基（取自上述步骤 3.1.3 中移出的 5 ml 培养基）将质粒 DNA 和 PEI 储液稀释至终浓度为 0.5 μg/μl。参见补充材料中的示例计算，以确定 DNA 和 PEI 的使用量。将含有分散细胞的培养瓶转移至生物安全柜中。
    7. 加入质粒DNA（300 μl，0.5 μg/μl），使用微量移液器混匀，轻轻手动摇动混合。加入PEI（900 μl，0.5 μg/μl），轻轻摇动混合。加入3.8 ml步骤3.1.3中准备的新鲜培养基，将培养瓶转移至摇床培养箱中，培养24小时。
    8. 按照步骤1.1清洁生物安全柜。
  2. 稀释（第1天）（适用于50 ml转染体积）
    1. 将转染后的细胞培养物孵育24小时。
    2. 使用无菌的1 ml刻度吸管吸取1 ml预热的220 mM丙戊酸（VPA；按步骤2.2.3制备），转移至无菌的50 ml离心管中。
    3. 用无菌血清移液管吸取5.0 ml预热的培养基B和44 ml预热的培养基A，加入VPA溶液中，配制50 ml新鲜培养基，VPA终浓度为4.4 mM。
    4. 将转染后的培养物移至生物安全柜中，用70%乙醇水溶液擦拭锥形瓶外表面进行消毒，加入预先配制的稀释培养基，然后将锥形瓶转移回摇床培养箱中。
  3. 表达与收获（第2-6天）
    1. 将细胞继续培养4-5天（转染后总计5-6天）。
    2. 在完成1.2.2至1.2.5步骤后，取出等量培养基样品。 "1.2. 细胞培养与维持" 使用无菌的1 ml血清移液管吸取上清液，以监测细胞活力，并保存等分试样，用于通过SDS-PAGE分析每日的蛋白表达（见下文第5节）。
    3. 在培养5-6天后，将细胞连同培养基在1,000 g离心5分钟以收集细胞。此外，若细胞活力低于50%，还需收集上清液（见步骤1.2.2–1.2.5）。
    4. 倒掉含有分泌蛋白的上清液。向HEK细胞沉淀中加入5 ml 10%次氯酸钠溶液，按生物危害物处理并丢弃。

4. 蛋白质纯化

  1. 准备一个含有5 ml Protein-A Sepharose的层析柱。用5个柱体积的缓冲液A（20 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS），pH 7.4，100 mM NaCl）平衡层析柱。
  2. 将收集的含表达蛋白的上清液高速离心（14,000 g，10分钟），以去除残留的细胞碎片。倾倒上清液至新离心管中收集。将沉淀作为生物危害物丢弃。
  3. 取10 μl上清液作为等分试样，并在每个蛋白纯化步骤中额外收集少量样品，用于后续SDS-PAGE分析（见第5节）。将澄清后的上清液上样，并收集穿流组分。
  4. 用3个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱，然后用5个柱体积的100 mM甘氨酸（pH 3.0）洗脱蛋白。将洗脱液收集于含有等体积1 M TRIS缓冲液（pH 8.0）的收集管中，以迅速中和pH。
  5. 用10个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱，随后保存以供后续使用。
  6. 使用10 kDa分子量截留的离心过滤器，将洗脱的蛋白置换至至少10倍体积过量的缓冲液A中。注意：不要将洗脱样品浓缩至极低体积（<2 ml）的洗脱缓冲液中。应使用离心过滤器完成缓冲液置换至缓冲液A。
  7. 将纯化的蛋白于4 °C保存，直至后续使用。
    注意：在上清液中表达的蛋白可根据蛋白特性或使用亲和标签选择相应的亲和层析柱进行纯化。典型的纯化方法中，IgG或Fc片段可使用Protein A柱，而带有聚组氨酸标签的蛋白则可使用镍柱。此处以Protein A柱纯化IgG1-Fc为例，描述其纯化步骤。

5. 通过SDS-PAGE分析蛋白质

  1. 将每个样品的等分试样（7.5 μl）与等体积的2倍上样缓冲液（0.125 M Tris，pH 8.0，4% SDS，10% β-巯基乙醇，20% 甘油和0.01% 溴酚蓝）混合稀释。
  2. 使用加热块或水浴在90 °C下煮沸混合物5分钟。将样品在10,000 g下离心1分钟。使用带一次性吸头的20 μl移液器，向制备好的凝胶中加入5 μl蛋白标记物和14 μl样品进行分析。
  3. 以25毫安电流运行一块凝胶60分钟。电泳步骤完成后，将凝胶转移至含有1 L水的容器中，并微波加热5分钟。
  4. 用染色液（40%乙醇，10%乙酸和0.1%考马斯亮蓝）染色2小时，然后用水脱色。

6. 质谱法分析糖类

  1. 按先前所述方法分析糖链44。简言之，将75 μg IgG1-Fc进行胰蛋白酶消化，然后用PNGaseF处理以释放糖链45。释放的糖链经完全甲基化后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）进行分析。

7. 特殊情况下的方案调整

  1. 使用15N标记的氨基酸对蛋白质进行标记（适用于50 ml转染体积）
    1. 将每种氨基酸各5 mg分装至一个无菌玻璃小瓶中，加入4 ml经高压灭菌的水重悬（注意：酪氨酸（Tyr）不会完全溶解，而赖氨酸（Lys）和苯丙氨酸（Phe）则可完全溶解）。在121 °C下高压灭菌15分钟以灭菌溶液。待溶液冷却至约50–60 °C。
    2. 对于50 ml的转染体积，按照"3.1 建立瞬时转染"中的步骤3.1.3操作。适当体积的示例请参见补充材料部分。
    3. 进行转染时，使用上述制备的含标记氨基酸残基的新鲜培养基，按照"3. 建立瞬时转染"中的步骤操作。
    4. 转染24小时后，在进行培养物稀释当天，取5.0 ml预热的B培养基、40 ml预热的A培养基，以及4 ml新近高压灭菌的氨基酸混合物（按上述步骤7.1.1制备），并加入1 ml预热的VPA储备液，配制成50 ml新鲜稀释培养基，其中VPA的终浓度为4.4 mM。使用无菌移液管将该培养基加入转染培养物中。
    5. 用70%乙醇水溶液对外部消毒后的培养瓶进行灭菌处理，然后将其转移至生物安全柜中，加入已配制的稀释培养基，再将培养瓶放回恒温摇床中继续培养。
      注：A培养基为化学成分明确、无血清的培养基，因此可配制不同配方。可联系供应商获取不含特定氨基酸的定制A培养基。虽然可以去除所有氨基酸，但我们更倾向于使用仅缺失少数特定氨基酸的培养基，因为完全缺失氨基酸的培养基在补充后需调整渗透压。我们选用的是缺失Lys-Tyr-Phe的A培养基，该培养基可直接补充且无需调整渗透压。此外，A培养基供应商未公开提供培养基组分的具体浓度；我们曾成功使用Lys、Tyr和Phe各100 mg/L的浓度。转染和表达培养基的体积需根据所添加的氨基酸进行相应调整。以下是上述方案中用于同位素标记的调整说明
  2. 向转染体系中补充小分子
    1. 使用高压灭菌水配制100 mM的2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖（2-deoxy-2-fluoro-l-fucose）储备液，并用0.22 μM滤器对该溶液进行除菌处理。
    2. 对于50 ml培养体系，向转染和稀释培养基中各加入125 μl（终浓度250 μM）的岩藻糖类似物溶液。注：由于在此浓度下添加该替代物仅占总培养体积的0.25%，因此我们未进行额外的体积校正。可通过糖链加工的小分子抑制剂来调控蛋白表达。此处描述的是添加2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖（一种糖链岩藻糖基化抑制剂）的实验条件。我们发现，在转染和稀释培养基中以250 μM浓度添加该岩藻糖类似物，可使岩藻糖基化水平降低>90%。

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结果

高水平的蛋白表达与纯度

该优化表达系统可高效产出糖基化蛋白。图中展示了IgG1-Fc表达的典型模式（图1）。在此情况下，第0天为转染日，随后为第1天（稀释）及持续培养至第5天。通过粗培养基中的可溶性表达组分分析蛋白表达。在第1天观察到极少量的蛋白表达，因为培养物稀释后3小时即取样。若使用GFP标记的蛋白，则可通过培养基中明显的绿色更直观地观察表达情况。从第2天到第5天，GFP-FcγRIIIa和GFP-ST6GalI的表达均呈现此类上升趋势。在第4天与第5天之间未观察到表达量的显著增加。第5天时，细胞被 <50% 存活率，因此收获培养物以限制蛋白水解。使用 Protein A 柱对 IgG1 Fc 进行亲和纯化，或使用镍柱对 GFP-FcγRIIIa 进行亲和纯化，均获得高纯度蛋白（>99%; 图2），产率（表1）以及完全的糖基化（数据未显...

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讨论

本方案通过瞬时转染HEK293F或S细胞来实现蛋白表达。Barb和Moremen实验室建立的最优转染条件，采用细胞密度与试剂浓度的关键组合，以实现高效的转染效果。实施本方案时需考虑的关键因素包括：转染前维持稳定的细胞培养状态（保持一致的细胞倍增时间）；转染时使用生长活跃的细胞（通过在转染前24小时将细胞稀释至1 × 106 个细胞/ml获得），且细胞活力需高于95%；转染时的细胞密度应为每毫升2.5–3.0 × 106 个活细胞，细胞活力>95%（即转染密度），培养体系中含90%培养基A和10%培养基B；DNA的加入应先于PEI，两者的终浓度分别为3 μg/ml和9 μg/ml31；转染后24小时，用含有4.4 mM丙戊酸的培养基将培养物按1:1稀释，使稀释后培养物中丙戊酸浓度为2.2 mM；随后在37 °C、8% CO2条件下，于湿润摇瓶中继续培养4–5天以进行蛋白生产阶段。本文所述载体经过优化，是可溶性蛋白表达系统的一个重要特征32,42。

如果目标蛋白未能表达...

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披露

所有作者声明本稿件不存在竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助项目 K22AI099165（AWB）、P41GM103390（KWM）和 P01GM107012（KWM），以及爱荷华州立大学罗伊·卡弗生物化学、生物物理与分子生物学系（Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics & Molecular Biology at Iowa State University）资金的支持。本研究内容仅由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物安全柜 NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400II级A2型生物安全柜
恒温振荡培养箱INFORS HTMultitron Cell 
培养基A：FreeStyle表达培养基 Life Technologies12338-018
培养基B：ExCell 293无血清培养基 SIGMA14571C 
125 mL带通气盖的锥形瓶Corning Incorporated/Life Sciences431143
250 mL带通气盖的锥形瓶Corning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F细胞Life TechnologiesR790-07
1 mL一次性移液管Fisher Scientific13-676-10B
10 mL一次性移液管Fisher Scientific13-676-10J
25 mL一次性移液管Fisher Scientific13-676-10K
移液器（Pipet-Aid XP）Drummond Scientific161263
台盼蓝溶液 Thermo Scientific SV30084.01
细胞计数板 Bio-Rad145-0011
TC20全自动细胞计数仪 Bio-Rad 145-0102
聚乙烯亚胺（PEI）Polysciences Inc.23966用含25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和150 mM NaCl（pH 7.5）的缓冲液配制浓度为1 mg/mL的储存液。完全溶解PEI后，经0.22 μm针头滤器除菌，于-20 °C保存。
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm针头滤器，0.22 μmFisher Scientific09-719A
三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）Fisher ScientificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
胰蛋白胨Fisher ScientificBP1421-2
酵母提取物Fluka Analytical 92144
氯化钠BDH chemicalsBDH8014
质粒纯化试剂盒QIAGEN12145
丙戊酸（VPA）SIGMAP4543用水配制220 mM 的储存液，经无菌0.22 mm滤器过滤除菌后，于-20 °C保存
离心机Thermo Scientific EW-17707-65
蛋白A-Sepharose柱SIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）Fisher ScientificBP308-500
甘氨酸Fisher ScientificBP381-500
10 kDa截留分子量Amicon®超滤离心管 MilliporeUFC901096
十二烷基硫酸钠ALDRICHL3771
β-巯基乙醇ALDRICHM6250
甘油SIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue标准蛋白Bio-Rad161-0373
冰乙酸 Fisher Scientific64-19-7
考马斯亮蓝 Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N标记的L-酪氨酸ALDRICH332151
15N标记的L-赖氨酸ALDRICH592900
未标记的L-苯丙氨酸SIGMA-ALDRICHP2126
13C6-葡萄糖ALDRICH389374
2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖 SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

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Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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