在生物安全等级4级（BSL-4）实验室中进行病毒实验比在生物安全等级2级（BSL-2）实验室中更为复杂，因为需要采取额外的安全防护措施。本文概述了在BSL-4实验室内部所采用的操作规范和流程，包括正确使用II级生物安全柜、废物管理与处置，以及样本移出的方法。
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摘要
摘要
在生物安全四级（BSL-4）密闭实验室中工作需要耗费大量时间，并且必须高度关注细节。在BSL-2实验室中针对非高致病性病原体所进行的相同操作，在BSL-4环境中将显著延长耗时。这种时间需求的增加源于多种因素，旨在保护研究人员免受实验室获得性感染、防止工作环境受到潜在污染，以及避免高致病性病原体向当地社区泄露。在实验室内，由于必须穿戴连接供气软管的全身式安全防护服，人员活动受到限制。此外，所有从II级生物安全柜（BSCs）中移出的物品均需进行消毒处理。实验室专业人员必须接受BSL-4实验室操作规范的培训，并展现出高水平的操作技能。本文的重点是通过一个标准的病毒蚀斑实验作为示例，概述确保实验室生物安全和实验准确性的正确操作流程与技术。特别地，本文将通过可视化方式重点强调在BSL-4环境中安全开展实验的正确技术，包括：为实验准备II级生物安全柜、实验结束后对II级生物安全柜进行正确清洁、BSL-4实验室内的废物管理及废弃物的安全处置，以及将灭活样本从BSL-4实验室安全转移至BSL-2实验室的操作方法。
引言
由于处理高致病性病原体（无感染预防措施或治疗手段）的实验室人员的安全至关重要，美国卫生与公共服务部已从生物安全角度制定了关于生物医学和临床实验室中病原体操作的安全工作规范以及设施建造的指导方针1。通过立法和法规，许多操作规程已成为强制性要求，必须在涉及这些病原体的工作中严格遵守。在美国，那些易于人际传播、导致高病死率和/或可能对公共卫生和生物恐怖主义产生重大影响的病原体，被归类为美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）优先级A病原体，或美国疾病控制与预防中心（CDC）生物恐怖主义A类制剂2。此外，若高致病性病原体具有成为生物恐怖主义制剂的潜力，可能造成大规模伤亡，或对经济、关键基础设施及公众信心造成毁灭性影响，则被列为一级选择性管制制剂（Tier 1 Select Agents）3。
与BSL-2/3操作相比，BSL-4操作（包括进入设有BSL-4实验室的机构）受到更严格的管控。例如，由于需要完成大量的正压防护服培训、严格的导师指导要求以及额外的医学生物安全先决条件，获得BSL-4实验室准入资格远比进入BSL-2或BSL-3实验室困难得多。此外，BSL-4设施通常比BSL-2或BSL-3设施具备更多的物理安全屏障4-6。正如我们在首篇关于BSL-4进出程序的文章中所述，实验室工作人员必须接受 extensive 培训和心理筛查，方可获得进入BSL-4实验室的资格
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方案
1. 实验室进入
- 从BSL-2实验室收集实验所需的所有用品（例如，在进入BSL-4实验室之前，细胞、培养基和耗材）
- 完成BSL-4进入程序（详见参考文献）7).
2. BSL-4 实验室中 II 级生物安全柜的准备
- 进入BSL-4实验室后，确保已完成每日内部检查表（图1）。如果尚未填写该检查表，则完成填写，并注明将使用的病毒种类；如果检查表已经完成，则在列表中添加姓名及将使用的病毒种类。
- 使用5%双链季铵盐消毒剂溶液（例如，烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵，或其他适用于所用病原体的消毒剂）喷洒生物安全柜（BSC）内部全部区域（包括视窗），然后用纸巾擦拭10,11。随后在柜内及视窗处喷洒70%乙醇溶液，以去除残留的黏性消毒剂。
- 如采用坐姿操作，应将椅子置于II级生物安全柜前方，调整至合适高度，确保能够触及柜体后部，同时实验人员面部位于前开口上方（图2）11。
- 为生物安全柜准备一个废液容器，确保废液容器中双链季铵盐消毒剂的最终浓度不低于5%。应提前规划，配制10%的消毒剂溶液，以便加入废液后仍能维持有效浓度。此外，在II级生物安全柜内放置一个装有5%双链季铵盐....
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结果
在BSL-4实验室中遵循正确的操作规程，对于确保实验安全有效地完成至关重要。实验室工作人员通过参考已完成的每日内部检查清单（图1），确保所有设备处于完全正常运行状态。在生物安全柜（BSC）中央保持正确的身体位置，可确保实验在最佳气流条件下进行（图2）。对病毒样本进行连续稀释，以获得每板30–300个空斑的平板（图3A），并用于测定病毒滴度（图3B）。多种因素会影响空斑的形成，包括病毒对宿主细胞系的嗜性、接种技术、病毒生长条件、适当的稀释范围以及覆盖物的选择8。实验过程中在生物安全柜内产生的废弃物，在移出生物安全柜前需进行适当消毒，并在离开BSL-4环境前再次通过高压灭菌处理。通过遵循这些操作规程，IRF-Frederick在BSL-4研究期间从未记录到任何实验室获得性感染。
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讨论
在生物安全四级（BSL-4）实验室工作需要耗费大量时间，并需格外关注细节。在此类环境中开展任何类型的工作，均要求操作人员经过良好培训、具备严谨态度和高度责任心。标准的病毒蚀斑实验为在BSL-4实验室中操作高致病性病原体的常见流程提供了准确的范例，因为该实验涉及多个实验室工作人员必须接受培训的核心概念。
第一个重要概念是在 II 级生物安全柜（BSC）中正确使用和实施安全操作规范，II 级生物安全柜可作为高危害性病原体的主要防护屏障。了解 II 级生物安全柜的工作原理，有助于制定有效降低人员暴露风险的操作规范。在 II 级生物安全柜的工作区域内，实验操作应遵循从洁净区域（"洁净侧"）到污染区域（"污染侧"）的工作流程，以避免交叉污染11。洁净物品与污染物品及耗材应严格分开，以限制污染物品在洁净物品上方移动。
第二个主要概念是物理性和生物性废物的管理。正确处理这两类废物的步骤对于确保实验室专业人员的安全以及防止环境污染至关重要。实验过程中的步骤旨在使病原体失活，并在样本带出生.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部（DHHS）或与作者相关的机构和公司的观点或政策。本工作部分通过巴特尔纪念研究所与美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）签订的主合同（合同号：HHSN272200700016I）获得资助。M.R.H.、D.P.、L.B.、K.J. 和 J.W. 以巴特尔纪念研究所雇员的身份完成了此项工作。参与本工作的巴特尔纪念研究所分包商包括：S.M.（MRI Global 公司雇员）；M.G.L.（Lovelace 呼吸系统研究所股份有限公司雇员）；以及 J.H.K.（Tunnell 政府服务股份有限公司雇员）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Micro-Chem Plus | 国家化学实验室 | 255 | |
| 乙醇 | 费希尔 | BP2818500 | |
| 2 ml 96-深孔板 | 费希尔 | 278743 | |
| 10 ml 血清移液管 | 费希尔 | 13-678-11E | |
| 25 ml 血清移液管 | 费希尔 | 13-678-11 | |
| 6-孔板 | 费希尔 | 140675 | |
| 结晶紫 | 西格玛 | HT90132-1L | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | 费希尔 | 22-050-105 | |
| 西黄芪胶 | 费希尔 | 50-702-2000 | |
| 20 μl 移液器吸头 | 费希尔 | 21-402-550 | |
| 200 μl 移液器吸头 | 费希尔 | 21-402-561 | |
| 1,000 μl 移液器吸头 | 费希尔 | 21-402-581 | |
| DMEM | 隆扎 | 12-604Q | |
| FBS | 西格玛 | F2442-500mL | |
| 青霉素/链霉素 | 隆扎 | 17-602E | |
| 2x EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| 移液器 | 德拉蒙德 | 4-000-101 | |
| 1,000 μl 移液器 | 雷宁 | L-1000XLS+ | |
| 200 μl 移液器 | 雷宁 | L-200XLS+ | |
| 12通道 200 μl 多通道移液器 | 雷宁 | L12-200XLS+ | |
| 8通道 1,000 μl 多通道移液器 | 雷宁 | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| 高压灭菌器 | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| 高压灭菌袋 | 费希尔 | 01-828E | |
| 2,000 ml 烧杯 | 费希尔 | 02-591-10H | |
| 高压灭菌托盘 | 费希尔 | 13-359-20B | |
| 移液管托盘 | 费希尔 | 13-361-5 | |
| 37 °C 培养箱 | 费希尔 | WU-39321-00 | |
| 生物危害桶 | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| 高压灭菌指示胶带 | 费希尔 | 15-903 | |
| 高压灭菌棒 | IRF 设施自制 | N/A | |
| 光源箱 | 费希尔 | S11552 | |
| 热封仪 | 费希尔 | NC9793612 | |
| 热封袋 | 费希尔 | 01-812-25H | |
| 生物危害袋 | 费希尔 | 01-828E |
参考文献
- Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
- Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
- Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biologi....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
One of the authors names was corrected from:
Nicole Joselyn
to:
Nicole Josleyn
