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生物安全四级（A）实验室中的安全预防措施与操作规程：2. 通用规范

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DOI：

10.3791/53600

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2016年10月3日

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1Integrated Research Facility at Frederick, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH)

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摘要

在生物安全等级4级（BSL-4）实验室中进行病毒实验比在生物安全等级2级（BSL-2）实验室中更为复杂，因为需要采取额外的安全防护措施。本文概述了在BSL-4实验室内部所采用的操作规范和流程，包括正确使用II级生物安全柜、废物管理与处置，以及样本移出的方法。

摘要

在生物安全四级（BSL-4）密闭实验室中工作需要耗费大量时间，并且必须高度关注细节。在BSL-2实验室中针对非高致病性病原体所进行的相同操作，在BSL-4环境中将显著延长耗时。这种时间需求的增加源于多种因素，旨在保护研究人员免受实验室获得性感染、防止工作环境受到潜在污染，以及避免高致病性病原体向当地社区泄露。在实验室内，由于必须穿戴连接供气软管的全身式安全防护服，人员活动受到限制。此外，所有从II级生物安全柜（BSCs）中移出的物品均需进行消毒处理。实验室专业人员必须接受BSL-4实验室操作规范的培训，并展现出高水平的操作技能。本文的重点是通过一个标准的病毒蚀斑实验作为示例，概述确保实验室生物安全和实验准确性的正确操作流程与技术。特别地，本文将通过可视化方式重点强调在BSL-4环境中安全开展实验的正确技术，包括：为实验准备II级生物安全柜、实验结束后对II级生物安全柜进行正确清洁、BSL-4实验室内的废物管理及废弃物的安全处置，以及将灭活样本从BSL-4实验室安全转移至BSL-2实验室的操作方法。

引言

由于处理高致病性病原体（无感染预防措施或治疗手段）的实验室人员的安全至关重要，美国卫生与公共服务部已从生物安全角度制定了关于生物医学和临床实验室中病原体操作的安全工作规范以及设施建造的指导方针1。通过立法和法规，许多操作规程已成为强制性要求，必须在涉及这些病原体的工作中严格遵守。在美国，那些易于人际传播、导致高病死率和/或可能对公共卫生和生物恐怖主义产生重大影响的病原体，被归类为美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）优先级A病原体，或美国疾病控制与预防中心（CDC）生物恐怖主义A类制剂2。此外，若高致病性病原体具有成为生物恐怖主义制剂的潜力，可能造成大规模伤亡，或对经济、关键基础设施及公众信心造成毁灭性影响，则被列为一级选择性管制制剂（Tier 1 Select Agents）3。

与BSL-2/3操作相比，BSL-4操作（包括进入设有BSL-4实验室的机构）受到更严格的管控。例如，由于需要完成大量的正压防护服培训、严格的导师指导要求以及额外的医学生物安全先决条件，获得BSL-4实验室准入资格远比进入BSL-2或BSL-3实验室困难得多。此外，BSL-4设施通常比BSL-2或BSL-3设施具备更多的物理安全屏障4-6。正如我们在首篇关于BSL-4进出程序的文章中所述，实验室工作人员必须接受 extensive 培训和心理筛查，方可获得进入BSL-4实验室的资格7。在BSL-4实验室内部，通过遵循既定操作规程来避免或降低感染风险和操作失误。研究工作必须谨慎、有条不紊地进行，尽量减少多任务操作或外界干扰。穿着正压防护服时弯腰十分困难，面罩也可能限制显微镜等操作的视野。厚重的手套会妨碍精细动作的执行，例如操作小型物品或标记试管。为尽量减少在BSL-4实验室内的停留时间，实验室专业人员应提前审查实验流程，识别出可在BSL-2实验室预先完成的步骤，并将相关材料转移至BSL-4实验室以完成后续操作。当需要将材料移出BSL-4实验室并在BSL-2实验室进一步处理时，这些材料必须经过固定，并置于密封的次级容器中带出。可能需要移出的样本示例包括：已固定的感染性材料平板或试管，用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析（IFA）或聚合酶链式反应（PCR）检测。

与BSL-2实验室相比，BSL-4实验室不仅因需要穿戴个人防护装备而带来更大的身体活动限制，而且对细胞培养板中高危害性病原体的灭活以及废弃物处理的程序也更为严格，必须高于针对BSL-2实验室中研究的低致病性病毒所采用的标准。这些方法至少应满足美国疾病控制与预防中心（CDC）的要求。例如，受污染的细胞培养板及其他材料可用化学试剂（如中性缓冲甲醛）进行灭活处理。处理后的细胞培养板或试管应放入含有甲醛的热封袋中，并通过装有液体消毒剂的浸没槽带出实验室。实验过程中产生的废弃物临时存放、手套消毒、生物安全柜表面及仪器清洁，分别使用盛有消毒液的废物桶和喷雾消毒剂完成。据Barr J（个人通讯，2015年）指出，所列浓度的季铵盐类消毒液被视为美国所有BSL-4实验室的金标准。废物桶中的固体废弃物需经高压灭菌处理，以彻底消除潜在污染风险。

为了直观展示通用BSL-4操作流程及其局限性，我们以标准的病毒蚀斑实验作为常用病毒学操作的示例。尽管文中对病毒检测流程进行了总体描述，但我们重点强调本方案中为保障实验室人员安全所采用的生物安全操作规程。有关蚀斑实验技术的更多背景信息，请参阅此前发表的经典蚀斑实验可视化文献8,9。

本文所述程序遵循美国疾病控制与预防中心（CDC）提出的《生物安全微生物和生物医学实验室准则》（BMBL）的规定1。然而，所介绍的实验方案仅适用于IRF-Frederick实验室。每个生物安全四级（BSL-4）设施均有各自不同的标准操作程序（SOP）和运行方法，这些差异会影响在BSL-4实验室中实验的实施。废物处理流程和空斑实验操作的替代方案可能因各实验室的管理和运行方式不同而有所差异。尽管如此，对BSL-4防护服实验室的基本布局以及在BSL-4环境中使用II级生物安全柜进行操作的通用流程有所了解，将有助于科研人员理解在开展高致病性病原体研究时所面临的技术限制和安全要求。提高外部合作者对在BSL-4实验室中工作所面临困难的认识，有助于调整预期，并促进科研界更顺利地开发医学对策措施。

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方案

1. 实验室进入

  1. 从BSL-2实验室收集实验所需的所有用品（例如，在进入BSL-4实验室之前，细胞、培养基和耗材）
  2. 完成BSL-4进入程序（详见参考文献）7).

2. BSL-4 实验室中 II 级生物安全柜的准备

  1. 进入BSL-4实验室后，确保已完成每日内部检查表（图1）。如果尚未填写该检查表，则完成填写，并注明将使用的病毒种类；如果检查表已经完成，则在列表中添加姓名及将使用的病毒种类。
  2. 使用5%双链季铵盐消毒剂溶液（例如，烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵，或其他适用于所用病原体的消毒剂）喷洒生物安全柜（BSC）内部全部区域（包括视窗），然后用纸巾擦拭10,11。随后在柜内及视窗处喷洒70%乙醇溶液，以去除残留的黏性消毒剂。
  3. 如采用坐姿操作，应将椅子置于II级生物安全柜前方，调整至合适高度，确保能够触及柜体后部，同时实验人员面部位于前开口上方（图2）11。
  4. 为生物安全柜准备一个废液容器，确保废液容器中双链季铵盐消毒剂的最终浓度不低于5%。应提前规划，配制10%的消毒剂溶液，以便加入废液后仍能维持有效浓度。此外，在II级生物安全柜内放置一个装有5%双链季铵盐消毒剂溶液的喷雾瓶，用于在取出物品前以及实验过程中和结束后对戴手套的手部进行喷洒消毒。
  5. 将整个实验所需的所有适当材料尽可能放置在II级生物安全柜后部，以避免反复向柜内引入材料，干扰气流11。

3. 示例：噬斑实验

  1. 用手从储存位置取出含病毒样品和对照病毒，并在37 °C的培养箱中解冻材料。
  2. 根据计划的病毒稀释度，标记将要使用的6孔板的孔位。同时标记板盖和板体，以确保在盖子与板体分离时能够正确匹配。
  3. 将步骤3.1–3.2中的材料带入II级生物安全柜（BSC）。将未接触或不会接触病毒的所有物品放置在一侧（"清洁侧"），废弃物放置在另一侧（"污染侧"）。在可能产生气溶胶的操作过程中，尽量使"清洁物品"与"污染物品"保持至少30 cm的距离11。
  4. 操作时应尽可能靠近II级生物安全柜内部中心区域，因为该位置是设计上最有利于保护操作者的区域11。
  5. 吸取50 µl病毒样品和对照病毒，加入到含有2%胎牛血清的450 µl杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）中。根据需要继续进行系列稀释（图3A）。
  6. 在稀释过程中，使用移液器吸头缓慢而小心地至少吹打混匀病毒样品5次，同时尽量减少样品中气泡的产生。每次向下一稀释孔加样后均需更换新的吸头。
  7. 在最后一次稀释中，混匀样品5次后，将50 µl病毒样品弃入废液容器，以确保各稀释孔体积相等。
  8. 丢弃吸头时，应先用废液桶中的消毒液冲洗每个吸头，使消毒液流经吸头内外表面，完成去污后再将吸头排入废液桶。
  9. 完成稀释后，将稀释孔暂时放置一旁，开始吸取细胞培养板各孔中的培养基，每孔保留500 µl培养基于6孔板中。
  10. 使用手动可调体积按钮式移液器，在用完吸头后，从废液桶中吸取消毒液至移液器顶部，以确保移液器内部得到充分去污。将吸头留在废液桶中直至实验结束。
  11. 在移除培养基后，向已预先标记的6孔板中每个对应孔内加入100 µl正确的样品，每孔设复孔，且每次更换样品时均需更换新的吸头。
  12. 完成蚀斑试验接种后，用消毒液喷洒手套表面，并使用浸有消毒液的纸巾擦拭所有培养板的外表面，然后手动将培养板放回培养箱。重复此操作直至所有培养板均放回培养箱。
  13. 以“8”字形轻轻摇动培养板，每15分钟一次，持续1小时，以确保样品在细胞表面均匀分布。
  14. 摇动结束后，将培养板连同2倍浓度的伊格尔最低必需培养基与1.6%刺梧桐胶的混合液一并放回II级生物安全柜。该半固体覆盖层比琼脂糖更易于操作，用于蚀斑试验的覆盖步骤。
  15. 向6孔板的每个孔中加入2 ml覆盖混合液，并再次以“8”字形轻轻摇动，使覆盖层在整个孔表面均匀分布。重复此操作，直至所有使用过的孔均被覆盖混合液覆盖。
  16. 在进行覆盖操作时，确保移液管尖端不接触孔内任何液体，以避免交叉污染。

4. 仪器和生物安全柜的废物处理与清洁

  1. 将所有废弃物完全浸没于废液桶内的5%消毒剂溶液中，作用时间至少10分钟。按照上述方法对移液枪头、血清移液管及其他废弃物进行消毒。此外，用5%消毒剂溶液喷洒废液桶内外表面，并让溶液与废液桶接触至少10分钟。
  2. 在等待废弃物达到足够作用时间的同时，将一张纸巾浸透5%消毒剂溶液，擦拭微量移液器等仪器，并将其从生物安全柜（BSC）中取出。在将戴着手套的手移出II级生物安全柜之前，先喷洒5%消毒剂溶液进行消毒。
    1. 将微量移液器从生物安全柜中取出后，使用另一张浸有70%乙醇溶液的纸巾擦拭仪器表面，以避免仪器表面产生黏性残留物。对于无法有效擦拭的仪器，应喷洒5%消毒剂溶液，并留在生物安全柜内作用10分钟。
  3. 在完成足够的作用时间后，将所有物品从生物安全柜中取出。将包括装有废弃物的废液桶在内的所有物品移至水槽处。对可重复使用的物品进行冲洗，以去除残留的消毒剂。将所有物品归还至其储存位置。
  4. 使用5%消毒剂溶液清洁II级生物安全柜的工作台面、柜体侧面与背面、玻璃内表面以及视窗1，随后再用70%乙醇溶液擦拭。
  5. 从废液桶中取出并排干血清移液管，将表面已消毒的血清移液管放入独立的移液管托盘中，准备高压灭菌（血清移液管可能造成锐器伤害，并可能刺破垃圾袋。在高压灭菌前应将这些移液管置于硬质容器中）。
  6. 将废液桶中的内容物倒入置于水槽底部的滤网中。
  7. 将内衬红色生物危害垃圾袋的生物危害废物容器移至水槽旁，将滤网中的内容物倒入红色生物危害垃圾袋中。切勿伸手进入滤网内取出可能粘附在滤网内壁的移液枪头。可通过敲击滤网内壁使枪头脱落，或将滤网沿废物容器内壁轻敲直至所有枪头脱落，也可使用镊子从滤网中取出枪头。
  8. 冲洗废液桶，并将其倒置放置在水槽旁的沥干架上晾干。

5. 废物高压灭菌

  1. 从生物危害废物容器中取出生物危害袋，并将其放入手推车上的高压灭菌托盘中。
  2. 保持生物危害袋开口状态，并在外表面贴上一条高压灭菌指示胶带，将袋子两侧与高压灭菌托盘连接，以确保袋子固定在托盘内。
  3. 在血清学移液管吸头托盘上贴两条高压灭菌指示胶带，并用个人姓名首字母和日期进行标记。将该移液管托盘与高压灭菌托盘一同放置于手推车上。
  4. 打开高压灭菌器。将配备的高压灭菌装卸手推车连接至高压灭菌器，并拉出可伸缩的高压灭菌平台，使其平稳置于手推车上。
  5. 从高压灭菌器中取出金属杆并打开顶部。将含有嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）孢子的生物指示剂小瓶插入金属杆中，用于验证高压灭菌循环是否成功完成。
  6. 将金属杆放置于高压灭菌托盘内废物袋的中央位置，但需确保金属杆仍易于取出。
  7. 将装有废弃物的高压灭菌托盘以及血清学移液管吸头托盘放置到可伸缩的高压灭菌平台上，然后将其推回高压灭菌器内。
  8. 将高压灭菌装卸手推车从高压灭菌器上分离，并关闭高压灭菌器门。
  9. 启动高压灭菌器。
  10. 在灭菌循环开始前不得离开高压灭菌器。高压灭菌器的操作屏幕将显示本次运行的剩余时间。
  11. 高压灭菌程序完成后，取出生物指示剂，并通过在指定培养箱中加热以检测微生物生长情况。若生物指示剂中检测到生长，则需将废弃物重新进行高压灭菌处理，并更换新的生物指示剂再次评估；若未检测到生长，则可将废弃物移出实验场所。

6. 示例：蚀斑实验的固定与染色

  1. 在经过适当天数（取决于所用病毒）后，返回实验室，再次执行第1和第2节中的步骤。
  2. 小心地将步骤3.1.2中完成的噬斑分析平板从培养箱中取出，并手动放入II级生物安全柜中。
  3. 用移液器吸除所有培养基和覆盖物，将其排入消毒液容器中，然后加入10%中性缓冲甲醛和0.8%结晶紫的混合液12,13。让该混合液在平板上作用30分钟，以灭活平板上的病毒。
  4. 灭活后，小心移除中性缓冲甲醛/结晶紫混合液，并放入单独的废液容器中，在丢弃前进行中和处理。
  5. 用消毒剂喷洒戴着手套的手部，并在将平板移出II级生物安全柜之前，擦拭平板外表面，操作方式如上所述。
  6. 前往水槽处，冲洗平板以去除多余的染色剂，然后将平板放置于推车上晾干。
  7. 待平板完全干燥后，使用透射光灯箱计数噬斑。记录所有计数结果，并根据标准公式计算病毒滴度（图3B）。

7. 从BSL-4实验室中取出样本

  1. 在BSL-2实验室条件下操作前，对所有待处理的样本进行灭活。采用IRF-Frederick内部生物安全办公室批准的两种方法之一，使用10%中性缓冲甲醛溶液（NBF）或Trizol LS（苯酚、异硫氰酸胍、硫氰酸铵、乙酸钠、甘油）进行处理1,14。在生物安全柜外将样本转移至新的洁净管或板中，随后进行包装，准备从BSL-4实验室移出。
  2. 将已灭活的样本置于装有足量5%消毒液或固定液的热封袋中的试管或板内，进行热封，以确保袋内表面及样本管外表面在转移出BSL-4实验室前得到有效消毒。按照相同程序，将此袋再放入第二个热封袋中。
  3. 密封第二个热封袋，并将热封后的袋子浸入含有5%消毒液的浸渍槽中，至少浸泡10分钟，以彻底消毒热封袋的外部表面。
  4. 在实验室内填写浸渍槽日志本，详细记录试管数量与规格、管内体积、所用病原体、灭活方法以及样本将要转移至的房间信息。
  5. 与BSL-4实验室外的同事协调，由其从浸渍槽中取出热封袋，并将样本运送至BSL-2实验室。

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结果

在BSL-4实验室中遵循正确的操作规程，对于确保实验安全有效地完成至关重要。实验室工作人员通过参考已完成的每日内部检查清单（图1），确保所有设备处于完全正常运行状态。在生物安全柜（BSC）中央保持正确的身体位置，可确保实验在最佳气流条件下进行（图2）。对病毒样本进行连续稀释，以获得每板30–300个空斑的平板（图3A），并用于测定病毒滴度（图3B）。多种因素会影响空斑的形成，包括病毒对宿主细胞系的嗜性、接种技术、病毒生长条件、适当的稀释范围以及覆盖物的选择8。实验过程中在生物安全柜内产生的废弃物，在移出生物安全柜前需进行适当消毒，并在离开BSL-4环境前再次通过高压灭菌处理。通过遵循这些操作规程，IRF-Frederick在BSL-4研究期间从未记录到任何实验室获得性感染。

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讨论

在生物安全四级（BSL-4）实验室工作需要耗费大量时间，并需格外关注细节。在此类环境中开展任何类型的工作，均要求操作人员经过良好培训、具备严谨态度和高度责任心。标准的病毒蚀斑实验为在BSL-4实验室中操作高致病性病原体的常见流程提供了准确的范例，因为该实验涉及多个实验室工作人员必须接受培训的核心概念。

第一个重要概念是在 II 级生物安全柜（BSC）中正确使用和实施安全操作规范，II 级生物安全柜可作为高危害性病原体的主要防护屏障。了解 II 级生物安全柜的工作原理，有助于制定有效降低人员暴露风险的操作规范。在 II 级生物安全柜的工作区域内，实验操作应遵循从洁净区域（"洁净侧"）到污染区域（"污染侧"）的工作流程，以避免交叉污染11。洁净物品与污染物品及耗材应严格分开，以限制污染物品在洁净物品上方移动。

第二个主要概念是物理性和生物性废物的管理。正确处理这两类废物的步骤对于确保实验室专业人员的安全以及防止环境污染至关重要。实验过程中的步骤旨在使病原体失活，并在样本带出生...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部（DHHS）或与作者相关的机构和公司的观点或政策。本工作部分通过巴特尔纪念研究所与美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）签订的主合同（合同号：HHSN272200700016I）获得资助。M.R.H.、D.P.、L.B.、K.J. 和 J.W. 以巴特尔纪念研究所雇员的身份完成了此项工作。参与本工作的巴特尔纪念研究所分包商包括：S.M.（MRI Global 公司雇员）；M.G.L.（Lovelace 呼吸系统研究所股份有限公司雇员）；以及 J.H.K.（Tunnell 政府服务股份有限公司雇员）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Micro-Chem Plus国家化学实验室255
乙醇费希尔BP2818500
2 ml 96-深孔板费希尔278743
10 ml 血清移液管费希尔13-678-11E
25 ml 血清移液管费希尔13-678-11
6-孔板费希尔140675
结晶紫西格玛HT90132-1L
10% 中性缓冲福尔马林费希尔22-050-105
西黄芪胶费希尔50-702-2000 
20 μl 移液器吸头费希尔21-402-550
200 μl 移液器吸头费希尔21-402-561
1,000 μl 移液器吸头费希尔21-402-581
DMEM隆扎12-604Q
FBS西格玛F2442-500mL
青霉素/链霉素隆扎17-602E
2x EMEMQuality Biological115-073-101
移液器德拉蒙德4-000-101
1,000 μl 移液器 雷宁 L-1000XLS+
200 μl 移液器 雷宁 L-200XLS+
12通道 200 μl 多通道移液器雷宁L12-200XLS+
8通道 1,000 μl 多通道移液器雷宁LA8-1200XLS
AttestExpress Medical Supplies MMM12192
高压灭菌器GetingeGEB 2404 AMB-2
高压灭菌袋费希尔01-828E
2,000 ml 烧杯费希尔02-591-10H
高压灭菌托盘费希尔13-359-20B
移液管托盘费希尔13-361-5
37 °C 培养箱费希尔WU-39321-00
生物危害桶Rubbermaid CommercialFG614500 RED
高压灭菌指示胶带费希尔15-903
高压灭菌棒IRF 设施自制N/A
光源箱费希尔S11552
热封仪费希尔NC9793612 
热封袋费希尔01-812-25H
生物危害袋费希尔01-828E

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

One of the authors names was corrected from:

Nicole Joselyn

to:

Nicole Josleyn

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