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一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

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DOI：

10.3791/53655

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2016年3月3日

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

通讯作者： Ortwin Naujok <naujok.ortwin@mh-hannover.de>

本文内容

摘要

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。

摘要

多能干细胞（如胚胎干细胞，ESCs）具有分化潜能，因此在细胞替代治疗中具有潜在的治疗应用价值。终末分化的细胞类型可用于治疗多种退行性疾病。体外将这些细胞向肺、肝和胰腺等组织分化时，首先需要生成定型内胚层细胞。这一步骤是进一步分化为胰岛素生成性β细胞、肝细胞或其他内胚层来源的终末成熟细胞类型的限速环节。已定向进入内胚层谱系的细胞会高表达多种转录因子，如FOXA2、SOX17、HNF1B、GATA家族成员以及表面受体CXCR4。然而，目前的分化方案效率很少能达到100%。本文介绍了一种利用磁性微珠在分化为定型内胚层（DE）后对CXCR4+细胞群体进行纯化的方法。该纯化过程还可去除非目标谱系的细胞。这种温和的纯化方法快速且可靠，可能有助于提高后续实验应用及进一步分化的效率。

引言

多能干细胞（如胚胎干细胞，ESCs）能够分化为人体几乎所有类型的细胞。因此，可通过体外（in vitro）分化方案生成多种成体细胞类型，例如心肌细胞1、肝细胞2、β细胞3、肺上皮细胞4或神经元细胞5。这使得胚胎干细胞成为治疗多种退行性疾病的一种重要工具3。

这 体外 胚胎干细胞向肺、肝和胰腺等成体组织分化需要经历类似原肠胚形成的阶段，产生类似于定型内胚层（DE）的细胞6由于向上述体细胞类型的下游分化效率显著较低，因此高效的内胚层分化被视为限速步骤7已承诺向内胚层谱系分化的细胞会经历其基因表达谱的特征性变化。多能性主调控基因的表达下调，而其他转录因子如 FOXA2、SOX17、HNF1B、GATA 家族成员以及表面受体 CXCR4 的表达则显著上调。6, 8, 9CXCR4 已知可被 Nodal/TGF-β 信号通路下游的 SMAD2/3 及 SOX17 转激活，因其启动子区域存在特异性结合位点10因此，它是一种非常适合作为多种报告中使用的标记物6, 8, 11-13这些表达变化反映了一个拟原肠胚形成事件，其中胚胎干细胞首先获得类似原始条带细胞群体的特征，随后定型为内胚层种系6.

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方案

1. 人类胚胎干细胞向定型内胚层的分化

  1. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养人类胚胎干细胞（ESCs）2.
  2. 用1 ml基底膜基质包被一个新的6孔细胞培养板，并在室温下孵育培养器皿至少30分钟。具体操作细节请参考相应生产商的说明书。
  3. 在显微镜下使用低倍镜观察，确认培养的人类胚胎干细胞（ESCs）已达到80%–90%的融合度例如， 4倍体积）。使用无菌玻璃巴斯德吸管吸出各孔中的培养基。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次：每孔加入2 ml PBS，轻轻摇动培养板，然后吸去液体，以去除死细胞和细胞碎片。
  4. 加入1 ml无酶细胞传代溶液试剂，以轻柔解离细胞簇。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 直到细胞明显破裂成小簇状。
    注意： 孵育时间取决于所用试剂。对于材料部分提到的无酶消化液，孵育时间约为7 min。
  5. 加入1 ml DMEM/F-12培养基，用1 ml移液枪头反复吹打，将残留的细胞团块分散为单细胞。用此液体冲洗培养表面，并将细胞转移至离心管中。为回收全部细胞，用1 ml DMEM/F-12培养基洗涤每个孔，并将洗涤液加入离心管中。
  6. 离心细胞5分钟，300 × g。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml含10 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂的ES细胞培养基中。
  7. 在显微镜下....

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结果

分化后 ESC在基因和蛋白质表达方面会发生显著变化。 图1 展示了可用于验证内胚层分化是否成功的典型标记基因。基因表达分析的主要靶基因为 GSC, FOXA2 和 SOX17 在相对基因表达分析中尤其 FOXA2 和 SOX17 增加 > 与未分化的ESC相比，增加2,000倍。 GSC 在原条形成后24小时内已开始早期表达，但仍可被诱导 > 第4天增加100倍。因此，在使用CXCR4表面标志物分选后，这些基因的表达水平随之升高6. 多能性主调控因子，例如 OCT3/4 （POU5F1）和 NANOG 显著下调，尽管这些基因在处理四天后仍可检测到表达。这表明部分细胞对CHIR-99021和激活素A的处理方案反应不足。 SOX7 基因表达通常用于区分胚外内胚层的形成与定型内胚层（DE）。在前一种情况下 SO.......

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讨论

目前使用的分化方案很少能够实现100%的细胞完全分化。由于某些尚未明确的原因，部分细胞会抵抗分化过程。根据所用分化方案的效率以及胚胎干细胞系的分化倾向，即使在分化为定型内胚层后，通常仍会残留一定数量的多能性细胞。这些残留细胞可能会影响后续的分化过程或进一步的分析，例如转录组学、蛋白质组学和miRNA表达分析。残留的多能性细胞或其他不需要的细胞谱系还可能产生旁分泌效应，干扰预期的分化目标。因此，去除这些细胞可能有助于提高实验的可重复性。

在分化后对表达CXCR4+的内胚层细胞进行纯化，可用于富集这些细胞群体，并去除抵抗分化过程的细胞。表面内胚层标志蛋白CXCR4可用于内胚层细胞的特异性纯化。本MACS纯化方案可在2小时以内完成，且可在任何细胞培养实验室中以简单的台面操作方式进行，无需昂贵的实验设备。FACS纯化是一种常用技术，但其操作条件较为剧烈。在FACS纯化过程中，细胞通常需长时间保持在悬浮状态，并暴露于其他严苛因素下，例如 FACS仪器喷嘴中的高压环境。相比之下，MACS方法更为快速且温和，有助于细胞在纯化后重新接种时更好地贴壁。为进一步促进细胞贴壁，可在纯化.......

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Jasmin Kresse 提供娴熟的技术协助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Hues8 人胚胎干细胞系哈佛大学干细胞系 &与再生生物学适用于内胚层生成的细胞系
Hes3 人胚胎干细胞系ES Cell International适用于内胚层生成的合适且稳定的细胞系
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC 培养基
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC，人Miltenyi Biotec130-098-357
抗APC微珠Miltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-109磁场
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK抑制剂
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
温和细胞解离试剂Stemcell Technologies7174无酶消化液，替代方案：胰蛋白酶/EDTA
Matrigel*康宁354277基底膜基质
* 溶解后分装，并于 -80 保存 °C，按照供应商说明书操作。使用时在冰上解冻，用25 ml预冷的Knockout DMEM/F-12稀释。
向6孔板的每孔中加入1 ml，室温孵育45分钟。
去除基质胶并立即使用。
MS 柱Miltenyi Biotec30-042-201
MACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302
人 FOXA2 正向引物
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
人 FOXA2 反向引物
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
人类 GSC 正向引物
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Technologies
人类 GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan 检测Applied BiosystemsHs00751752_s1
人 SOX7 正向引物
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
人类 SOX7 反向引物
tgcgcggccggtacttgtag		Life Technologies
人类 POU5F1 正向引物
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies
人类 POU5F1 反向引物
ctgcagtgtgggtttcgggca		Life Technologies
人类 Nanog 正向引物
ccgagggcagacatcatcc		Life Technologies
人类 Nanog 反向引物
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies
人TBP 正向引物
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
人类 TBP 反向引物
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
人 TUBA1A 正向引物
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
人类 TUBA1A 反向引物
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
人 G6PD 正向引物
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
人G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
抗SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
抗-FOXA2默克密理博07-633
抗SOX17R&D SystemsAF1924

参考文献

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

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标签

CXCR4 ROCK

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