本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。
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本文内容
摘要
摘要
多能干细胞（如胚胎干细胞，ESCs）具有分化潜能，因此在细胞替代治疗中具有潜在的治疗应用价值。终末分化的细胞类型可用于治疗多种退行性疾病。体外将这些细胞向肺、肝和胰腺等组织分化时，首先需要生成定型内胚层细胞。这一步骤是进一步分化为胰岛素生成性β细胞、肝细胞或其他内胚层来源的终末成熟细胞类型的限速环节。已定向进入内胚层谱系的细胞会高表达多种转录因子，如FOXA2、SOX17、HNF1B、GATA家族成员以及表面受体CXCR4。然而，目前的分化方案效率很少能达到100%。本文介绍了一种利用磁性微珠在分化为定型内胚层（DE）后对CXCR4+细胞群体进行纯化的方法。该纯化过程还可去除非目标谱系的细胞。这种温和的纯化方法快速且可靠，可能有助于提高后续实验应用及进一步分化的效率。
引言
多能干细胞（如胚胎干细胞，ESCs）能够分化为人体几乎所有类型的细胞。因此，可通过体外（in vitro）分化方案生成多种成体细胞类型，例如心肌细胞1、肝细胞2、β细胞3、肺上皮细胞4或神经元细胞5。这使得胚胎干细胞成为治疗多种退行性疾病的一种重要工具3。
这 体外 胚胎干细胞向肺、肝和胰腺等成体组织分化需要经历类似原肠胚形成的阶段，产生类似于定型内胚层（DE）的细胞6由于向上述体细胞类型的下游分化效率显著较低，因此高效的内胚层分化被视为限速步骤7已承诺向内胚层谱系分化的细胞会经历其基因表达谱的特征性变化。多能性主调控基因的表达下调，而其他转录因子如 FOXA2、SOX17、HNF1B、GATA 家族成员以及表面受体 CXCR4 的表达则显著上调。6, 8, 9CXCR4 已知可被 Nodal/TGF-β 信号通路下游的 SMAD2/3 及 SOX17 转激活，因其启动子区域存在特异性结合位点10因此，它是一种非常适合作为多种报告中使用的标记物6, 8, 11-13这些表达变化反映了一个拟原肠胚形成事件，其中胚胎干细胞首先获得类似原始条带细胞群体的特征，随后定型为内胚层种系6.
然而，分化方案的效率很少能达到100%，因为部分细胞可能抵抗分化过程，或向其他非预期的谱系分化14。这些细胞可能对后续分化产生负面影响。此外，残留的未分化细胞在后续移植实验中具有较大风险，可能引发畸胎瘤15-17。
为了在早期去除这些不需要的细胞，可利用表面标志物 CXCR4 对定型内胚层（DE18）分化方向的细胞进行纯化。本文描述了一种从定型内胚层（DE）分化培养物中正向筛选 CXCR4+ 细胞的方法。该方法通过抗体特异性结合细胞表面标志物 CXCR4，随后抗体再与磁性微珠结合。与流式细胞分选（FACS）过程中较为剧烈的条件不同，磁性标记的类定型内胚层细胞可在台式条件下通过温和的纯化方法轻松分离。本方案提供了一种简便的方法，用于清除未成功经历定型内胚层分化过程的细胞群体。
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方案
1. 人类胚胎干细胞向定型内胚层的分化
- 在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养人类胚胎干细胞（ESCs）2.
- 用1 ml基底膜基质包被一个新的6孔细胞培养板，并在室温下孵育培养器皿至少30分钟。具体操作细节请参考相应生产商的说明书。
- 在显微镜下使用低倍镜观察，确认培养的人类胚胎干细胞（ESCs）已达到80%–90%的融合度例如， 4倍体积）。使用无菌玻璃巴斯德吸管吸出各孔中的培养基。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次：每孔加入2 ml PBS，轻轻摇动培养板，然后吸去液体，以去除死细胞和细胞碎片。
- 加入1 ml无酶细胞传代溶液试剂，以轻柔解离细胞簇。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 直到细胞明显破裂成小簇状。
注意： 孵育时间取决于所用试剂。对于材料部分提到的无酶消化液，孵育时间约为7 min。 - 加入1 ml DMEM/F-12培养基，用1 ml移液枪头反复吹打，将残留的细胞团块分散为单细胞。用此液体冲洗培养表面，并将细胞转移至离心管中。为回收全部细胞，用1 ml DMEM/F-12培养基洗涤每个孔，并将洗涤液加入离心管中。
- 离心细胞5分钟，300 × g。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml含10 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂的ES细胞培养基中。
- 在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，并根据所使用的胚胎干细胞系，将150,000 - 400,000个细胞接种至每孔6孔板或其他孔板布局中。使用含有10 µM ROCK抑制剂的培养基以避免细胞凋亡，并将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2.
- 接种后约24小时，用无菌玻璃巴斯德吸管吸除培养基，加入2 ml原条诱导培养基。
注意： 该培养基含有终浓度为1%的谷氨酰胺、0.2%胎牛血清（FCS）、5 µM CHIR-99021和50 ng/ml激活素A，溶剂为Advanced RPMI-1640培养基。通常在6孔板中培养时，每孔使用2 ml培养基。 - 接种后48小时，更换为内胚层诱导培养基。在此培养基中继续培养细胞48小时，每天更换培养基。
注意： 该培养基含有1%谷氨酰胺、0.2%胎牛血清（FCS）和50 ng/ml激活素A（activin A），溶剂为Advanced RPMI-1640培养基。定型内胚层定向分化的细胞表达表面标志物CXCR4，通过CXCR4染色可定量分析定型内胚层定向分化细胞的数量。
2. 用于流式细胞术分析的CXCR4+定型内胚层细胞染色
- 在收获细胞前的最后24小时，但至少在收获前1小时，向培养基中加入10 µM ROCK抑制剂。
- 用基底膜基质包被将用于重新接种细胞的细胞培养器皿， 即， 用于qPCR分析的12孔板或用于免疫荧光染色的腔室载玻片。在室温下孵育平板或载玻片至少30分钟。
- 使用无菌玻璃巴斯德吸管从用于染色和/或分选的已分化细胞孔中吸除培养基。
- 加入1 ml无酶细胞传代溶液试剂，以轻柔解离细胞团块。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 直到细胞明显破裂成小簇为止。
注意： 孵育时间取决于所使用的试剂。对于材料部分提到的无酶传代溶液，孵育时间约为7分钟。 - 加入1 ml DMEM/F-12培养基，使用1 ml枪头反复吹打，将残留的细胞团块分散为单细胞。用此液体冲洗培养表面，并将细胞转移至离心管中。为收集全部细胞，用1 ml不含FCS的DMEM/F-12培养基洗涤每个孔，并将洗涤液加入离心管中。
- 使用血细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数。来自6孔板中三个孔的细胞数量应达到10–15 × 10⁶个。6 分化三天后的细胞。以300 x g离心5分钟。
注意： 获得的细胞确切数量将取决于用于分化的多能细胞系。 - 吸弃上清液，将细胞重悬于含有10 µM ROCK抑制剂的PEB缓冲液中。每10⁶个细胞使用100 µl该缓冲液。7 细胞。在染色当天加入10 µM ROCK抑制剂。后续所有步骤均使用此缓冲液（称为PEB缓冲液 + RI）。
注意： PEB 缓冲液含有 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS 溶液。若需染色更多细胞，应相应调整缓冲液体积。 - 每10 µl中加入10 µl CXCR4-APC抗体7 100 µl 中的细胞，这大致代表了 1:10 的稀释比例。
注意： 使用APC标记的抗体并非必需，可根据所使用的微珠类型进行替换。若需染色的细胞数量较多，应相应调整抗体体积。 - 用手指轻轻翻转离心管混匀，于4 °C冰箱中孵育15分钟。用1–2 ml PEB缓冲液重悬细胞。在300 x g离心5分钟。
- 用无菌玻璃巴斯德吸管吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于每 10⁷ 个细胞 80 µl PEB 中7 细胞并加入20 µl抗APC微珠。
注意： 如果需要染色的细胞更多，应相应调整微珠的体积。 - 用手指轻轻翻转离心管混匀，于4 °C冰箱中孵育15分钟。加入1–2 ml PEB缓冲液 + RI重悬细胞。在300 × g离心5分钟。吸除上清液。用500 µl PEB缓冲液 + RI重悬细胞。
3. CXCR4+ 细胞的磁分离
- 根据制造商说明，将一个中等大小的磁性柱置于磁场中。用 500 µl PEB 缓冲液 +RI 预冲洗柱。将整个细胞悬液加到柱上。收集流穿液，因为并非所有细胞都会结合到柱上。为确保最佳回收 CXCR4+ 细胞，请务必不要扰动柱。
- 用 500 µl PEB 缓冲液 + RI 洗涤柱三次。收集第一次的流穿液，并与步骤 3.1 中收集的细胞合并。将磁性柱从磁场中取出，放入合适的收集管中。向柱上加入 1 ml PEB 缓冲液 + RI。为洗脱细胞，用力将推杆压入柱中。
- 可选：分别收集所有流穿液样品，每份取 20 µl，使用流式细胞术分析 CXCR4+ 细胞数量。其数量应随着每次洗涤步骤而减少。
注意：为获得可靠结果，至少应计数 2 x 104 个活细胞并设门。 - 使用新的柱重复步骤 3.1–3.3，处理来自步骤 3.1 的收集流穿液样品和来自步骤 3.2 的第一次流穿液样品。请勿重复使用之前的柱。由于使用推杆会将空气压入柱中，导致柱堵塞。
- 使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。根据分化效率，初始可分选多达 6 x 106 个细胞，若在操作中使用 107 个细胞并使用第二个柱，还可额外获得约 1 x 106 个细胞。
- 以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，用无菌玻璃巴斯德吸管将细胞重悬于 1 ml 来自步骤 1.9 的内胚层诱导培养基中，并额外添加 10 µM ROCK 抑制剂。
- 使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。以适当密度接种细胞，即 每 12 孔板每孔约 4 x 105 个细胞（约 3.6 cm2 表面积）或每 8 孔腔室载玻片每孔约 1.5 x 105 个细胞。
4. 可选：纯化定型内胚层细胞群体的分析
- 进行免疫荧光染色时，取第3.7步纯化的细胞，在接种后约24小时用4%多聚甲醛固定，并对定型内胚层（DE）和/或多能性标志蛋白进行染色。
注意：常用的DE标志物包括FOXA2和SOX17，常用的多能性标志物包括OCT3/4、NANOG和SOX26, 8。 - 进行RT-qPCR分析时，可直接收集纯化后的细胞，或在接种后24小时收集，提取总RNA，并以提取的总RNA样品反转录获得cDNA。每项RT-qPCR反应（设三个重复）使用10 ng cDNA作为模板，分析DE及多能性标志基因的表达水平6, 8。
注意：常用标志基因见第4.1步。循环条件为95 °C预变性5分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火1分钟），最后进行熔解曲线分析。
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结果
分化后 ESC在基因和蛋白质表达方面会发生显著变化。 图1 展示了可用于验证内胚层分化是否成功的典型标记基因。基因表达分析的主要靶基因为 GSC, FOXA2 和 SOX17 在相对基因表达分析中尤其 FOXA2 和 SOX17 增加 > 与未分化的ESC相比，增加2,000倍。 GSC 在原条形成后24小时内已开始早期表达，但仍可被诱导 > 第4天增加100倍。因此，在使用CXCR4表面标志物分选后，这些基因的表达水平随之升高6. 多能性主调控因子，例如 OCT3/4 （POU5F1）和 NANOG 显著下调，尽管这些基因在处理四天后仍可检测到表达。这表明部分细胞对CHIR-99021和激活素A的处理方案反应不足。 SOX7 基因表达通常用于区分胚外内胚层的形成与定型内胚层（DE）。在前一种情况下 SO...
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讨论
目前使用的分化方案很少能够实现100%的细胞完全分化。由于某些尚未明确的原因，部分细胞会抵抗分化过程。根据所用分化方案的效率以及胚胎干细胞系的分化倾向，即使在分化为定型内胚层后，通常仍会残留一定数量的多能性细胞。这些残留细胞可能会影响后续的分化过程或进一步的分析，例如转录组学、蛋白质组学和miRNA表达分析。残留的多能性细胞或其他不需要的细胞谱系还可能产生旁分泌效应，干扰预期的分化目标。因此，去除这些细胞可能有助于提高实验的可重复性。
在分化后对表达CXCR4+的内胚层细胞进行纯化，可用于富集这些细胞群体，并去除抵抗分化过程的细胞。表面内胚层标志蛋白CXCR4可用于内胚层细胞的特异性纯化。本MACS纯化方案可在2小时以内完成，且可在任何细胞培养实验室中以简单的台面操作方式进行，无需昂贵的实验设备。FACS纯化是一种常用技术，但其操作条件较为剧烈。在FACS纯化过程中，细胞通常需长时间保持在悬浮状态，并暴露于其他严苛因素下，例如 FACS仪器喷嘴中的高压环境。相比之下，MACS方法更为快速且温和，有助于细胞在纯化后重新接种时更好地贴壁。为进一步促进细胞贴壁，可在纯化...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Jasmin Kresse 提供娴熟的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hues8 人胚胎干细胞系 | 哈佛大学干细胞系 &与再生生物学 | 适用于内胚层生成的细胞系 | |
| Hes3 人胚胎干细胞系 | ES Cell International | 适用于内胚层生成的合适且稳定的细胞系 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC 培养基 |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC，人 | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| 抗APC微珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | 磁场 |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK抑制剂 |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| 温和细胞解离试剂 | Stemcell Technologies | 7174 | 无酶消化液，替代方案：胰蛋白酶/EDTA |
| Matrigel* | 康宁 | 354277 | 基底膜基质 * 溶解后分装，并于 -80 保存 °C，按照供应商说明书操作。使用时在冰上解冻，用25 ml预冷的Knockout DMEM/F-12稀释。 向6孔板的每孔中加入1 ml，室温孵育45分钟。 去除基质胶并立即使用。 |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| 人 FOXA2 正向引物 gggagcggtgaagatgga | Life Technologies | NA | |
| 人 FOXA2 反向引物 tcatgttgctcacggaggagta | Life Technologies | ||
| 人类 GSC 正向引物 gaggagaaagtggaggtctggtt | Life Technologies | ||
| 人类 GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg | Life Technologies | ||
| SOX17 TaqMan 检测 | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| 人 SOX7 正向引物 gatgctgggaaagtcgtggaagg | Life Technologies | ||
| 人类 SOX7 反向引物 tgcgcggccggtacttgtag | Life Technologies | ||
| 人类 POU5F1 正向引物 cttgctgcagaagtgggtggagg | Life Technologies | ||
| 人类 POU5F1 反向引物 ctgcagtgtgggtttcgggca | Life Technologies | ||
| 人类 Nanog 正向引物 ccgagggcagacatcatcc | Life Technologies | ||
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| 人类 TBP 反向引物 agg ctg tgg ggt cag tcc agt g | Life Technologies | ||
| 人 TUBA1A 正向引物 ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c | Life Technologies | ||
| 人类 TUBA1A 反向引物 tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g | Life Technologies | ||
| 人 G6PD 正向引物 agg ccg tca cca aga aca ttc a | Life Technologies | ||
| 人G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t | Life Technologies | ||
| 抗SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| 抗-FOXA2 | 默克密理博 | 07-633 | |
| 抗SOX17 | R&D Systems | AF1924 |
参考文献
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