在Saccharomyces cerevisiae中的定向进化方法：突变文库的构建与筛选

摘要

我们提供了一种详细的方案，用于在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建和筛选突变文库，以开展定向进化研究。

摘要

定向进化在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 在为生物技术应用设计酶时具有诸多显著优势，该过程涉及突变体文库的构建、克隆与表达，并结合高频同源DNA重组 体内在此，我们介绍一种以真菌芳醇氧化酶（AAO）为例，在酵母中构建和筛选突变体文库以提高其总活性的实验方案。通过对两个蛋白质片段进行随机诱变的靶向定向进化 体内 DNA 重组。每个片段两侧约 50 bp 的突出端使得 AAO-融合基因能够在线性化载体中正确重组成一个完整的自主复制质粒。通过筛选功能型 AAO 变体富集的突变文库， S. cerevisiae 基于芬顿反应的高灵敏度高通量检测法检测上清液。文库构建的一般流程如下 S. cerevisiae 此处描述的方法可轻松应用于进化多种其他真核基因，避免额外的PCR反应， 体外 DNA 重组与连接步骤。

引言

定向分子进化是一种设计酶的强大、快速且可靠的方法^{1, 2}。通过反复进行随机突变、重组和筛选，可以获得性能改进的酶，这些酶能够作用于新的底物、参与新的反应、在非天然环境中发挥作用，甚至帮助细胞实现新的代谢目标^3-5。在用于定向进化的宿主中，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为复杂真核蛋白的功能性表达提供了一系列解决方案，而这些在原核系统中通常无法实现^6,7。

在细胞生物学研究中被广泛使用的这种小型真核模式生物，在翻译后修饰、操作简便性和转化效率方面具有诸多优势，而这些特性对于通过定向进化来改造酶分子至关重要⁸此外，同源DNA重组的频率较高 S. cerevisiae 与其高效的校对装置偶联，为文库构建和基因组装开辟了广泛的可能性 体内，促进从单一酶到复杂人工代谢途径的不同系统的演化^9-12我们实验室在过去十年中致力于设计用于酵母中不同木质素降解酶（在天然木材降解过程中参与木质素分解的氧化还原酶）分子进化的工具与策略^13-14在本文中，我们提供了一种制备和筛选突变文库的详细实验方案 S. cerevisiae 对于一种模型黄素氧化酶——芳香醇氧化酶（AAO）¹⁵)-，可轻松推广至多种其他酶。该方案采用一种定向进化方法（MORPHING：基于同源序列的诱变有序重组） 在 体内 酵母细胞装置辅助的分组¹⁶，以及基于芬顿反应的高灵敏度筛选检测法，用于检测分泌到培养液中的AAO活性¹⁷.

方案

1. 突变体文库构建

1. 利用基于可用晶体结构或同源模型的计算算法，选择需进行MORPHING处理的区域¹⁸。
   1. 在此，针对来自Pleurotus eryngii的AAO的两个区域进行随机诱变与重组（Met[α1]-Val109，Phe392-Gln566），同时通过高保真PCR扩增基因的其余部分（844 bp）（图1）。
      注意：可通过MORPHING独立或联合研究多个片段¹⁶。
2. 通过诱变PCR扩增目标区域。通过叠加定义区域的PCR反应，在各片段之间创建重叠区域（每个约50 bp）。
   1. 制备目标片段的诱变PCR反应体系，终体积为50 µl，包含DNA模板（0.92 ng/µl）、90 nM正义引物（M-I片段使用RMLN，M-II片段使用AAO-BP）、90 nM反义引物（M-I片段使用AAO-92C，M-II片段使用RMLC）、0.3 mM dNTPs（每种0.075 mM）、3%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）、1.5 mM MgCl₂、0.05 mM MnCl₂以及0.05 U/µl Taq DNA聚合酶。引物序列详见图1。
   2. 采用以下PCR程序：95 °C预变性2 min（1个循环）；95 °C变性45 sec、50 °C退火45 sec、74 °C延伸45 sec（28个循环）；74 °C终延伸10 min（1个循环）。
3. 使用超保真聚合酶扩增非诱变区域，并包含与诱变片段和/或线性化载体末端同源的相应重叠区域。
   1. 制备终体积为50 µl的反应体系，包含：DNA模板（0.2 ng/µl）、250 nM正义引物HFF、250 nM反义引物HFR、0.8 mM dNTPs（每种0.2 mM）、3%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）以及0.02 U/µl iproof DNA聚合酶。引物序列详见图1。
   2. 采用以下PCR程序：98 °C预变性30 sec（1个循环）；98 °C变性10 sec、55 °C退火25 sec、72 °C延伸45 sec（28个循环）；72 °C终延伸10 min（1个循环）。
      注意：根据步骤1.2和1.3所述条件，设计了43 bp（质粒-M1区域）、46 bp（M1区域-HF区域）、47 bp（HF区域-M2区域）和61 bp（M2区域-质粒）的重叠区域（图1），以促进酵母中的in vivo拼接。
   3. 根据制造商说明书，使用商业凝胶回收试剂盒纯化所有PCR片段（诱变与非诱变片段）。
4. 线性化载体，使其两侧产生约50 bp的同源区域，分别与目标基因的5′端和3′端同源。
   1. 制备线性化反应体系：含2 µg DNA、7.5 U BamHI、7.5 U XhoI、20 µg BSA及2 µl BamHI 10x缓冲液，终体积为20 µl。
   2. 将反应体系在37 °C孵育2小时40分钟，随后在80 °C灭活20分钟。
5. 通过琼脂糖凝胶回收纯化线性化载体，以避免残留环状质粒污染（图2）。
   1. 将酶切反应混合物上样至半制备型低熔点琼脂糖凝胶（0.75%，w:v）的加样孔中，同时在相邻孔中加入一份反应混合物（5 µl）作为指示孔。
   2. 进行DNA电泳（电极间5 V/cm，4 ᵒC），分离对应加样孔的凝胶部分，并在1x TAE缓冲液中4 ᵒC保存。
   3. 对含有分子量标记和指示孔的泳道进行染色，在紫外光下观察条带，标记线性化载体所在位置。
      注意：由于纯化后线性化载体的质量是酵母中成功重组与组装的关键因素，应避免在半制备型DNA电泳中进行凝胶染色。染料和紫外照射可能影响DNA载体的稳定性，降低in vivo重组效率。除有毒的溴化乙锭（EtBr）外，Gel Red和SYBR系列染料常用于凝胶染色。
   4. 在无紫外光条件下，依据染色指示孔中切口位置，确定加样孔中线性化载体的位置并进行分离。
   5. 从琼脂糖凝胶中提取线性化载体，并根据制造商说明书使用商业凝胶回收试剂盒进行纯化。
      注意：使用带有抗生素和营养缺陷型标记的高拷贝穿梭载体：本示例中采用受酵母GAL1启动子调控的尿嘧啶独立型且具有氨苄青霉素抗性的pJRoC30载体。
6. 将PCR片段配制成等摩尔混合物，并以2:1的比例与线性化载体混合，线性化质粒用量不少于100 ng（可测试不同比例的等摩尔文库/线性载体以获得良好的转化效率）。
   1. 测定PCR片段和线性化载体在260 nm和280 nm处的吸光度，以确定其浓度和纯度。
7. 根据制造商说明，使用商业酵母转化试剂盒将DNA混合物转化至酵母感受态细胞中（参见表格获取试剂信息）。
   1. 本实验中使用蛋白酶缺陷型且依赖URA3^-的S. cerevisiae菌株BJ5465。在筛选过程中，将亲本环状载体转化细胞作为内部对照（见下文）。此外，通过在无PCR片段条件下转化线性化载体以检测背景信号。
      注意：若初始分泌水平较低，可使用如BJ5465等蛋白酶缺陷型S. cerevisiae菌株，以促进活性蛋白在培养上清中的积累。若目标酶发生过度糖基化，可考虑使用糖基化缺陷型菌株（例如Δkre2，仅能连接较小的甘露糖寡聚物）。
8. 将转化后的细胞涂布于SC缺陷培养基平板上，30 °C培养三天。将不含质粒的URA3^-S. cerevisiae细胞涂布于补充尿嘧啶的SC缺陷平板上，作为筛选的阴性对照（见下文）。

2. 高通量筛选实验（图3）

1. 使用移液机器人，向适量的无菌96孔板中每孔加入50 µl最小培养基（分析2,000个克隆的文库需23块板）。
2. 从SC缺失培养基平板上挑取单个菌落，并转移至96孔板中。
   1. 在每块平板中，将亲本类型接种至第6列作为内部对照，并将URA3接种至H1孔^-S. cerevisiae 细胞（在添加尿嘧啶的SC培养基中）不携带质粒作为阴性对照。
      注意： H1 孔中加入含有尿嘧啶的缺陷培养基。也可制备一孔不含细胞的培养基作为空白，作为额外的无菌对照。
3. 用培养皿盖盖好培养皿，并用封口膜封严。将培养皿置于湿度摇床中，在30 °C、225 rpm、相对湿度80%的条件下孵育48小时。
4. 移除封口膜，借助移液机器人向每孔加入 160 µl 表达培养基，重新密封培养板并继续孵育 24 小时。
   注意： 最小培养基和表达培养基的制备方法参照 elsewhere 报道的方法进行¹⁹分泌水平可能因所研究的基因而异，因此必须针对每种情况优化孵育时间，以使所有孔中的细胞生长保持同步。
5. 将平板（主平板）在2,800 x g条件下离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
6. 使用液体处理机器人多通道工作站，将主培养板各孔中的上清液20 µl转移至复制板。
   注意： 为了促进酶的分泌，建议将目标蛋白的天然信号肽替换为酵母中异源表达常用的信号肽例如， α因子前原序列，K的信号序列₁ 来自杀伤毒素 S. cerevisiae或两种肽的嵌合版本¹³或者，可以专门针对酵母分泌系统对天然信号肽进行定向进化。
7. 加入 20 µl 的 2 mM p在100 mM pH 6.0的磷酸钠缓冲液中，借助移液机器人加入甲氧基苄醇，使用96孔板振荡器短暂混匀，室温孵育30分钟。
8. 使用移液机器人向每块复制板中加入 160 µl FOX 试剂，并用混匀器短暂搅拌（孔中 FOX 混合液的终浓度：100 µM 二甲酚橙，250 µM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ 和 25 mM H₂SO₄).
   1. 向试剂中添加多种添加剂以提高灵敏度，例如有机共溶剂（DMSO、乙醇、甲醇）或山梨醇¹⁷。此处通过加入山梨醇至终浓度100 mM来放大反应信号（图4).
9. 读取酶标板（终点法，t₀在酶标仪上于560 nm处检测。
10. 在室温下孵育培养板，直至颜色显现，然后再次测量吸光度（t₁).
    1. 根据每次孵育后的吸光度值与初始测量值之差，相对于每块平板的亲本类型进行归一化，计算相对活性（Δt₁ - t₀).
11. 对最佳突变体阳性结果进行两轮连续复筛，以排除假阳性。
    注意： 通常，重新筛选包括从酵母中分离质粒，并在大肠杆菌中进行扩增和纯化 大肠杆菌，随后将质粒转化至新鲜的酵母细胞中¹⁹每个被选中的克隆均需进行五次重复筛选。

结果

来自AAO的 P. eryngii 是一种细胞外黄素氧化酶，可为真菌过氧化物酶提供 H₂O₂ 开始降解木质素。通过MORPHING技术对AAO的两个片段进行定向进化，以增强其活性及其在 S. cerevisiae ¹⁹. 无论所含有的外源酶如何 S. cerevisiae，酵母中构建突变文库时最关键的环节在于设计特定的重叠区域，以促进片段间的拼接及其向线性化载体中的克隆。在本示例中，每次PCR反应中，所有片段均带有约50 bp的突出端，以促进 体内 酵母中的拼接。重组事件的数量取决于要组装并克隆到线性化载体中的片段数量。即， 在三个PCR片段之间发生了两次交换事件——两个含突变的片段位于非突变片段的两侧——此外，还与线性化载体发生了两次额外的交换； 图1根据我们的经验，重叠序列长度超过50 bp时会降低内部重组的可能性，但不会提高转化效率。

讨论

本文总结了我们实验室在酿酒酵母（S. cerevisiae）中通过定向进化改造酶（以AAO为例）所采用的大部分技巧与方法，以便读者通过遵循文中所述的通用策略，将其应用于许多其他真核生物酶系统的研究中。

在文库构建方面，MORPHING 是一种快速的单管法，可在小段蛋白质区域中引入并重组随机突变，同时保持蛋白质其余区域不变¹⁶可轻松制备并重组具有多种突变负荷的文库 体内，连同线性化质粒，以生成完整的自主复制载体。至关重要的是，每段序列两端必须具有重叠序列，以便通过重叠延伸反应将完整基因的各片段重新组装。 体内 重组，避免额外的PCR反应和 体外 连接步骤。在本方案中，可通过减小PCR片段间重叠区域的长度来增加片段间发生交换的频率，但可能会降低转化效率。无论使用何种DNA聚合酶进行突变PCR，均可通过预先构建并分析小型突变文库的突变谱型来调节突变负荷。图5A）。如果使用 GeneMorph II 试剂盒，仍建议遵循此方法，因为 体内 DNA重...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 培养基
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 分子量 371.39
细菌用琼脂	Difco	214010
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 分子量 323.13
D-(+)-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 分子量 180.16
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 分子量 180.16
D-(+)-棉子糖五水合物	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 分子量 594.51
蛋白胨	Difco	211677
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 分子量 136.09
尿嘧啶	Sigma Aldrich	U1128
酵母提取物	Difco	212750
无氨基酸酵母氮源基础培养基	Difco	291940
无尿嘧啶酵母合成缺失培养基补充剂	Sigma-Aldrich	Y1501
名称	公司	货号	备注
2. PCR 反应
dNTP 混合液	Agilent genomics	200415-51	每种 25 mM
iProof 高保真 DNA 聚合酶	Bio-rad	172-5301
四水合氯化锰(II)	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 分子量 197.91
Taq DNA 聚合酶	Sigma-Aldrich	D4545	用于易错 PCR
名称	公司	货号	备注
3. 质粒线性化
BamHI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0136S
牛血清白蛋白	New England Biolabs	B9001S
XhoI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0146S
Not I 限制性内切酶	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	用于 DNA 染色
名称	公司	货号	备注
4. FOX 检测
六水合硫酸亚铁铵	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 分子量 392.14
苯乙醇	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 分子量 138.16
D-山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 分子量 182.17
30% 过氧化氢	Merck Millipore	1072090250	FOX 标准曲线
二钠盐邻甲酚紫	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 分子量 716.62
名称	公司	货号	备注
5. 琼脂糖凝胶相关试剂
琼脂糖	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA 分析染料
GeneRuler 1kb DNA 标准品	Thermo Scientific	SM0311	DNA 分子量标准
6×上样缓冲液	Thermo Scientific	R0611
低熔点琼脂糖	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
名称	公司	货号	备注
6. 试剂盒与细胞
酿酒酵母 BJ5465 菌株	LGC Promochem	ATTC 208289	蛋白酶缺陷型菌株，基因型为：MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
大肠杆菌 XL2-Blue 感受态细胞	Agilent genomics	200150	用于质粒纯化与扩增
NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA 凝胶回收
NucleoSpin 质粒提取试剂盒	Macherey-Nagel	740,588,250	柱式质粒小量提取试剂盒
酵母转化试剂盒	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	包含 DNA 载体（鲑鱼精 DNA）
Zymoprep 酵母质粒小量提取 I	Zymo research	D2001	从酵母中提取质粒
名称	公司	货号	备注
7. 培养板
96 孔板	Greiner Bio-One	655101	透明、非无菌、聚苯乙烯材质（用于活性测定）
96 孔板	Greiner Bio-One	655161	透明、无菌、聚苯乙烯材质（用于微发酵）
96 孔板盖	Greiner Bio-One	656171	透明、无菌、聚苯乙烯材质（用于微发酵）