定向进化法酿酒酵母:突变体库的创建和筛选

Summary

我们提出了一个详细的方案来构建和筛选酿酒酵母定向进化活动的突变文库。

Abstract

设计用于生物技术应用的酶时，涉及建设，克隆和突变体库的表情，加上高频同源DNA重组在体内的过程在酿酒酵母定向进化提供了许多吸引人的优点。在这里，我们提出了一个协议，以创建一个基于真菌芳基醇氧化酶（AAO）的例子来提高其总活性酵母和屏幕突变体库。两种蛋白质的片段，用随机突变和体内 DNA重组进行集中定向进化。的〜50碱基对的侧翼每段悬允许AAO融合基因的正确重新装配在一个线性化的载体引起全自主复制质粒。与功能AAO变种丰富突变体文库的S.筛选酵母上清与基于芬顿反应灵敏的高通量测定法。的一般过程图书馆建设S.酵母这里描述可容易地应用于演进许多其他的真核基因，避免额外的PCR反应， 在体外 DNA重组和连接步骤。

Introduction

定向分子进化是设计酶^1,2健壮的，快速和可靠的方法，通过迭代轮次的随机突变，重组和筛选，可以产生改进的酶的版本的作用于新底物，在新颖的反应，在非天然的环境中，或甚至以协助细胞来实现新的代谢目标^3-5。间在定向进化中使用的宿主，啤酒酵母酿酒酵母提供了不在原核生物同行^6,7-否则可用复杂的真核蛋白质的功能性表达的解决方案的一个曲目。

在细胞生物学研究中详尽使用时，该小的真核模型在翻译后修饰，易于操纵和转换效率，所有这一切都是由定向进化⁸工程师酶重要性状方面有许多优点。此外，高频率在S同源DNA重组酵母加上其高效的校对设备打开一个广阔的图书馆创建和组装的基因在体内的可能性阵列，促进由单一的酶来复杂的人工途径^9-12不同系统的演变。我们的实验室已经度过了过去十年的设计工具和策略在酵母中不同的木质素酶的分子进化（天然木材腐烂过程中参与木质素的降解氧化还原酶^）13-14。在这种沟通中，我们提出了详细的方案编制和S.屏幕突变体文库酵母为一个模型flavooxidase， -芳基醇氧化酶（AAO ^15） - ，可以很容易地转换为许多其它的酶。该协议涉及的聚焦定向进化方法:通过酵母细胞装置^16，辅助（MORPHING同源体内编组诱变有组织重组处理）基于以检测分泌到培养液中¹⁷ AAO活性Fenton反应哒非常敏感筛选测定。

Protocol

1突变体库建设

1. 选择的区域要进行与基于所述可用的晶体结构或同源性模型¹⁸的计算算法的帮助下变形。
   1. 这里，目标从杏鲍菇 AAO的两个区域为随机诱变和重组（蛋氨酸[α1] -Val109，Phe392-Gln566），而扩增基因（844碱基对）的通过高保真PCR，其余（ 图1）。
      注意:几个片段可以通过以独立或组合方式¹⁶变形进行研究。
2. 通过诱变PCR扩增目标区域。创建通过叠加所定义的区域的PCR反应重叠区段之间的区域（〜各50碱基对）。
   1. 在含有DNA模板50微升（0.92纳克/微升），90纳米寡感（RMLN为段MI和AAO-BP的段M-II）的最终体积准备有针对性的细分诱变PCR，90纳米ntisense引物（AAO-92C为段MI和RMLC为段的M-II）中，0.3毫摩尔的dNTPs（0.075毫每个），3％（体积/体积）二甲基亚砜（DMSO），1.5毫_氯化镁 ，0.05毫的MnCl ₂和0.05 U /μLTaq DNA聚合酶。引物的序列在图1中详细说明。
   2. 使用下述PCR程序:95℃2分钟（1个循环）; 95℃45秒，50℃45秒，74℃45秒（28个循环）;和74℃下进行10分钟（1个循环）。
3. 放大用超高保真聚合酶的非诱变的区域，并包括重叠诱变区段和/或线性化载体突出的相应的区域。
   1. 在含有50微升的最终体积制备反应混合物:DNA模板（0.2纳克/微升），250纳米寡感HFF，250纳米寡聚反义HFR，0.8毫的dNTPs（每种0.2mM），3％（体积/体积）二甲基亚砜（DMSO）和0.02单位/微升iproof DNA聚合酶。引物序列在详述图1。
   2. 使用下述PCR程序:98℃30秒（1次循环）; 98℃下10秒，55℃25秒，72℃45秒（28个循环）;和72℃10分钟（1个循环）。
      注意:随着1.2描述和条件，1.3 43基点（质粒-M1区）的重叠; 46基点（M1区域-HF区）; 47碱基对（HF区-M2区）和61碱基对（M2 region-质粒）设计（ 图1）有利于在体内剪接在酵母。
   3. 净化所有根据制造商的协议的商业凝胶提取试剂盒对PCR片段（诱变和非诱变）。
4. 线性化使得侧翼大约50碱基对区域所创建的是同源的靶基因的5'-和3'-末端的载体中。
   1. 制备含2微克DNA，7.5ū 巴姆 HI，7.5ūXhoⅠ位 ，缓冲巴的20微克BSA和2微升线性反应混合物米的HI 10倍在20微升的最终体积。
   2. 孵育反应混合物在37℃下2小时和40分钟。之后，继续进行灭活在80℃下进行20分钟。
5. 净化用琼脂糖凝胶提取的线性化载体，以避免与残余环形质粒（ 图2）的污染。
   1. 在相邻的以及等分试样（5微升）在反应混合物的以及记者:加载消化反应混合物成半制备低熔点琼脂糖凝胶的大型孔（ⅴ0.75％，重量）。
   2. 运行DNA电泳（电极之间的5伏/厘米，4ᵒC）和独立的对应大型井琼脂糖凝胶并将其存储在1X TAE 4ᵒC。
   3. 色斑与分子量梯子，记者车道。可视化在紫外灯下条带。尼克的位置，其中线性载体的地方。
      注意:作为纯化线性化载体的质量是一个criti校准因子在酵母重组成功和组装，避免半制备DNA电泳凝胶染色。使用染料和UV曝光对凝胶提取的可能影响DNA载体的稳定性，降低的体内重组效率。作为替代有毒的EtBr染料，凝胶红色和SYBR染料通常用于凝胶染色。
   4. 在没有紫外线的光的，用在染色记者车道刻痕的指引，以便它可被分离鉴定在巨型井片段的线性化的载体。
   5. 从琼脂糖提取的线性载体并用根据制造商的协议的商业凝胶提取试剂盒纯化它。
      注意:使用高拷贝与抗生素和营养缺陷型标记附加型穿梭载体:在本例中，我们所用的尿嘧啶独立和氨苄青霉素抗性pJRoC30载体，酵母GAL1启动子的控制之下。
6. 准备等摩尔英里PCR片段的夹具，并将其与在2线性化的载体混合:1的比例，不低于100纳克线性质粒（摩尔库/矢量开放测试不同比例达到良好的转化率）。
   1. 测量的PCR片段，并在260nm和280nm线性载体的吸光度以确定其浓度和纯度。
7. 根据制造商的说明转化酵母感受态细胞，使用市售酵母转化试剂盒的DNA混合物（ 见表用品）。
   1. 在这里，使用缺陷的蛋白酶和URA3 ^-依赖S.酵母菌株，BJ5465。变换筛选（见下文）中与亲环化向量作为内部标准的细胞。此外，通过在不存在PCR片段转化线性载体检查的背景。
      注:在检测最初的低分泌水平的情况下，使用S.像BJ5465酵母蛋白酶缺陷菌株，以促进活性的蛋白质的培养上清中的积累。如果目标酶经受超糖，使用糖基化缺陷型菌株（例如，Δkre2即仅能够连接小甘露糖的低聚物）可以是一个合适的选择。
8. 板上的SC落出板中的转化的细胞，并培育它们在30℃下三天。板（上辅以尿嘧啶SC辍学板）URA3 ^- S.酵母细胞缺乏质粒作为用于筛选的阴性对照（见下文）。

2.高通量筛选测定（图3）

1. 填充无菌96孔板的适当数量的与50微升最小培养基（23板，以分析的2000个克隆的库），每孔用移液机器人的帮助。
2. 从SC-降板挑单个菌落，并将它们转移到96孔板。
   1. 在每个板，接种列号6与亲型作为内部标准，用URA3以及H1 ^- S.酵母细胞（在补充有尿嘧啶SC培养基）无质粒作为阴性对照。
      注:嗯H1与补充尿嘧啶辍学媒体专门填补。没有细胞的空白孔含有介质也可以制备作为附加无菌控制。
3. 盖上盖子的板块，并在封口膜包裹其中。孵育板在30℃下48小时，225转和80％相对湿度的潮湿摇动。
4. 去除封口膜，添加160微升表达培养基到每个孔与移液机器人的帮助下，重新密封板并孵育他们另外24小时。
   注:其他地方^19日报道基本培养基和表达中做好准备。分泌水平可能取决于所研究的基因变化，并且相应地，叔他的温育时间，必须在每一种情况下进行优化以细胞生长在所有的孔中同步。
5. 离心10分钟2800×g下板（主平板）在4℃下。
6. 转移20微升从使用液体处理机器人多站中的主板到副本板孔中的上清液。
   注意:为了有利于酶的分泌是可取由通常用于在酵母中（异源表达的信号肽替换目标蛋白质的天然信号肽例如，所述α因子前原领导者，来自酿酒在K ₁杀手毒素的领导者酵母 ，甚至两种肽^13）的嵌合版本。可替代地，天然信号肽可只进化为在酵母中的分泌。
7. 添加在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.0 20微升2毫米毫米P -methoxybenzylalcohol与移液机器人的帮助。用96我们简要地搅动板LL板混合器，并培育他们在室温为30分钟。
8. 用移液机器人，添加160微升FOX试剂对每个副本板，并与在孔中的混合器（最终FOX混合物的浓度短暂搅拌:100μM的二甲酚橙，250μM的Fe（NH _{4）2（SO 4）2}和25mM _的 H ₂ SO _4）。
   1. 几种添加剂加入试剂，以提高灵敏度，例如有机助溶剂（DMSO，乙醇，甲醇）或山梨糖醇^17。这里，放大通过加入山梨糖醇至100mM（ 图4）的最终浓度的响应。
9. 上读取板读数器在560nm的板（终点模式，叔_0）。
10. 在室温下孵育板至显色，并再次测量吸收（叔_1）。
    1. 从培养后的绝对值之间的差计算出相对活性和初始测量的归一化到的PAREntal类型每个板_（ΔT1 - _T0）。
11. 主题的最佳突变命中两个连续的再检查，以排除假阳性。
    注意:通常情况下，重新放映包括来自酵母，扩增和纯化在大肠杆菌质粒分离，接着鲜酵母细胞的转化用质粒^19。每个选定克隆再筛选pentaplicate。

Results

从AAO P.杏鲍菇是一种细胞外flavooxidase供给真菌过氧化物用H ₂ O ₂与开始攻击木质素。 AAO的两段被以变形，以提高其活性及其在S.表达受到关注，定向进化酵母 ^19。由S.窝藏外国酶无关酵母 ，当在酵母构建突变体文库涉及特定重叠区域的工程有利于片段和其克隆入线性化载体之间的拼接的最关键的问题。在当前的例子中，每个PCR反应中，所有的片段具有约50碱基的突出端，在酵母体内剪接推广。重组事件的数目是依赖于被组装并与线性化载体克隆的段数（即两个交叉事件发生的地点之间3的PCR片段-The 2诱变片段侧翼非诱变segment-加上与线性化载体两个附加的分频器; 图1）。根据我们的经验，重叠序列50碱基长减少内部重组的可能性，同时它们不会提高转化效率。

Discussion

在这篇文章中，我们总结了大部分的技巧和窍门在我们的实验室中通过S.定向进化工程师使用的酶酵母 （使用氧化铝作为一个例子），以便它们可以通过简单地按照此处描述的常用的方法适于使用与许多其它真核酶系统。

在库创建而言，变形是一个快速单罐法引进和重组中的小蛋白伸展随机突变，同时留下未改变¹⁶蛋白质的剩余区域。与几个突变负载库可以容易地制备，并在体内重组，与线性化质粒一起，以产生一个完整的自主复制的载体。至关重要的是，重叠序列侧翼的每个拉伸，以允许充分基因的片段通过体内重组被重新组装，从而避免额外的PCR反应，并在体外连接步骤。在该protocol，邮局的PCR片段之间的遗传交换事件的频率可以增加通过减少重叠区域的大小，虽然这可能会影响转化效率。无论用于诱变PCR的DNA聚合酶，该突变负载可通过预先构建和分析小突变体库的风景（ 图5A）进行调整。如果使用GeneMorph II试剂盒，它仍然是可取的遵循这种方法...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.培养基
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 MW 371.39
Bacto 琼脂	Difco	214010
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 MW 323.13
D-（+）-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 MW 180.16
D-（+）-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 分子量 180.16
D-（+）-棉子糖五水合	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 分子量 594.51
蛋白胨	Difco	211677
钾二元	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 分子量 136.09
尿嘧啶	Sigma Aldrich	U1128
提取物	Difco	212750
氮基不含氨基酸	Difco	291940
合成辍学培养基补充剂，不含尿嘧啶	Sigma-Aldrich	Y1501
名称<	strong>Company	目录号	评论
2。PCR 反应
dNTP 混合物	安捷伦基因组学	200415-51	每个 25
mM iProof 高保真 DNA 聚合酶	Bio-rad	172-5301
氯化锰（II） 四水合物	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 MW 197.91
Taq DNA 聚合酶	Sigma-Aldrich	D4545	错误易患PCR
名称	Company	目录号	评论
3。质粒线性化
BamHI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0136S
牛血清白蛋白	New England Biolabs	B9001S
XhoI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0146S
Not I 限制性内切酶	New England Biolabs	R0189S
凝胶红	Biotium	41003	用于 DNA 染色
名称	Company	目录号	评论
4。FOX 分析
硫酸铁 （II） 铵六水合物	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 MW 392.14
乙醇	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 MW 138.16
D-山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 MW 182.17
过氧化氢 30%	默克Millipore	1072090250	FOX 标准曲线
二甲酚橙二钠盐	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 MW 716.62
名称	Company	目录号	评论
5。琼脂糖凝胶材料
琼脂糖	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
凝胶红色	Biotium	41003	DNA 分析染料
GeneRuler 1kb 分子量标准	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. 标准
上样染料 6x	Thermo Scientific	R0611
低熔点琼脂糖	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
名称	Company	目录号	评论
6。试剂盒和细胞
酿酒酵母菌株 BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	型的蛋白酶缺陷菌株：MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4：：HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
大肠杆菌 XL2-Blue 感受态细胞	安捷伦基因组学	200150	用于质粒纯化和扩增
NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA 凝胶提取
NucleoSpin 质粒试剂盒	Macherey-Nagel	740,588,250	柱小量制备试剂盒
酵母转化试剂盒	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	包括 DNA 载体（鲑鱼睾丸）
Zymoprep 酵母质粒小量制备 I	Zymo 研究	D2001	酵母质
提取名称	公司	目录号<	strong>评论
7。板
96 孔板	Greiner Bio-One	655101	透明、非无菌、聚苯乙烯（用于活性测量）
96 孔板	Greiner Bio-One	655161	透明、无菌、聚苯乙烯（用于微发酵）
96 孔板盖	Greiner Bio-One	656171	透明、无菌、聚苯乙烯（用于微发酵）