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利用混合反义寡核苷酸在犬X连锁肌营养不良模型中实现多外显子跳跃

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DOI：

10.3791/53776

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2016年5月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

外显子跳跃目前是一种 杜氏肌营养不良症（DMD）最具前景的治疗策略。为扩大DMD患者的适用范围，并优化所产生的截短型抗肌萎缩蛋白的稳定性与功能，研究人员开发了采用鸡尾酒式反义寡核苷酸的多外显子跳跃策略，并在犬模型中实现了全身性的抗肌萎缩蛋白挽救。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是全球最常见的致死性遗传病之一，由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因（DMD 基因）的突变引起。 dystrophin (DMD基因。外显子跳跃技术利用一类称为反义寡核苷酸（AONs）的短链类DNA/RNA分子，恢复阅读框并产生较短但具有功能的蛋白质。然而，外显子跳跃疗法面临两大主要难题：适用性有限（单种AON药物最多仅能治疗约13%的患者），以及截短蛋白功能不确定。这些问题可通过鸡尾酒式AON策略加以解决。尽管通过单个外显子跳跃（所有外显子合并计算）可治疗约70%的DMD患者，但如果能够实现使用鸡尾酒式反义药物进行多外显子跳跃，则有望治疗超过90%的DMD患者。犬X连锁肌营养不良（CXMD）犬模型的表型 是 与人类杜氏肌营养不良症患者更为相似，被 用于测试6号和8号外显子多外显子跳跃的全身性疗效与安全性。CXMD犬模型在内含子6中携带一个剪接位点突变，导致抗肌萎缩蛋白mRNA中缺失7号外显子。 dystrophin mRNA。在CXMD中恢复读码框需要外显子6和外显子8的多外显子跳跃；因此，CXMD是用于评估多外显子跳跃疗效与安全性的良好中等体型动物模型。在本研究中，设计了一种靶向外显子6和外显子8的反义吗啉代寡核苷酸混合物，并在全身骨骼肌中恢复了抗肌萎缩蛋白的表达。本文介绍了在CXMD犬模型中转染/注射寡核苷酸混合物以及评估多外显子跳跃疗效与安全性的方法。

引言

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X连锁隐性遗传性肌肉疾病，以进行性肌无力为特征，最早由Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne（de Boulogne）博士描述1。DMD是一种常见的遗传病，全球约每3,500名男童中就有1例患病，每年约有2万名患儿出生2,3。患儿在幼儿期即出现运动发育迟缓和步态异常4，约在青少年早期需依赖轮椅。患者通常在20至30岁之间因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡5-8。目前尚无治愈DMD的方法。糖皮质激素治疗可在一定程度上延缓肌肉退化，但伴随显著的副作用，包括肥胖和糖尿病2,7,8。DMD由dystrophin（DMD）基因突变引起，导致功能性抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺失。DMD基因极大，包含超过200万个碱基对和79个外显子9,10。缺失、无义和重复突变导致阅读框移位，是引起DMD表型最常见的原因。外显子3–9和外显子45–55区域被称为“突变热点”，大多数患者的缺失突变发生于这些区域，从而导致DMD患者体内抗肌萎缩蛋白功能丧失3,9,11-16。抗肌萎缩蛋白在抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物（DGC）中发挥作用，该复合物在肌肉细胞膜稳定中具有重要作用。其中N端和C端是功能最关键的结构域，而中央杆状结构域作用相对较小3,9,17。临床观察发现，贝克尔型肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）表型较轻，该病主要由DMD基因内的同框突变引起，由此启发了外显子跳跃疗法在DMD治疗中的应用。BMD患者可表达截短但仍具功能的抗肌萎缩蛋白，且保留了N端和C端结构3,6,18。理论上，外显子跳跃可恢复阅读框，产生类似BMD患者中的截短但有功能的抗肌萎缩蛋白3,19。

已测试多种类型的反义寡核苷酸（AONs）用于临床试验，包括2'-O-甲基磷酸硫代酯（2'OMePS）和磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PMOs）。使用这些AONs跳过外显子51和53已被研究，尽管结果具有前景，但单外显子跳跃的适用性有限，因其具有突变特异性 3, 19, 20,21, 22-26关于单外显子跳跃所产生的截短型抗肌萎缩蛋白的稳定性，仍存在一些疑问 22,23此外，部分患者需要跳过多个外显子才能恢复阅读框 3尽管在技术上更具挑战性，多外显子跳跃是一种有望解决上述问题的方法 3,19多外显子跳跃此前已在肌营养不良犬和人类细胞系中得到证实 体外此外， mdx52 小鼠和犬X连锁肌营养不良（CXMD）犬模型已被用于 在体内 研究 22,24-27犬型X连锁肌营养不良日本株（CXMDJ) 比格犬被用于本研究，因为其阅读框 中国台湾J 可通过外显子6和8的多外显子跳跃，或额外外显子的跳跃来恢复例如，外显子3至9）图1基于比格犬的CXMD模型与金毛猎犬肌营养不良（GRMD）模型具有相同的突变模式，但由于比格犬体型较小且饲养成本较低，因此为杜氏肌营养不良症（DMD）研究提供了一个实用的动物模型。 28,29CXMD 犬模型比啮齿类等小型动物模型更接近人类 DMD 表型，且在毒理学评估中更具可靠性 3,22,30,31 (图2CXMD 犬表现出进行性肌肉退化、步态异常以及心脏和呼吸系统问题，与 DMD 患者相似。与单外显子跳跃相比，多外显子跳跃适用于更大比例的患者。在三种最常见的突变类型（缺失、无义突变和重复）中，80% 至 98% 的患者可通过多外显子跳跃进行治疗。 14,32,33而45%的所有DMD患者可能受益于特异性跳过外显子45至55  3,19,22,34.

随着修饰型吗啉代寡核苷酸的发展，反义寡核苷酸（AON）鸡尾酒疗法在促进外显子跳跃方面的效率已得到提升。富含精氨酸的细胞穿透肽偶联的磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PPMOs）以及活体吗啉代寡核苷酸（vPMOs）是两类显著增强细胞穿透能力的AON化学修饰形式。 和稳定性 3,35-38人们对长期使用反义寡核苷酸（AON）可能产生的毒性仍存担忧；然而，该领域已取得显著进展。对吗啉代寡核苷酸进行的化学修饰可大幅降低脱靶效应，且临床前研究未发现明显毒性作用。 3,22,39,40多外显子跳跃疗法目前仍面临一个挑战，即每种单个反义寡核苷酸必须作为单一药物单独进行毒性测试。 而不是作为混合物同时使用 3,19,22,41,42在针对心脏的杜氏肌营养不良症（DMD）研究中，无论是单外显子跳跃还是多外显子跳跃， dystrophic 心脏组织的改善均较为有限。由于细胞穿透能力差，吗啉代寡核苷酸（morpholinos）在心脏中的功效被认为较低。肽偶联的PPMOs（peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomers）已提高了 AONs穿透心肌细胞，增加心脏中功能性抗肌萎缩蛋白的挽救量 3,19,38.

本文详细讨论了我们的AON鸡尾酒疗法，包括使用ESEfinder软件设计AON序列的方法43。同时描述了在犬类模型中进行多外显子跳跃实验的操作方案。外显子6和外显子8跳跃实验采用了CXMDJ 比格犬。在CXMD犬模型中，多外显子跳跃显示出良好的应用前景，但在其具备临床适用性之前，仍有一些挑战需要克服。

方案

以下列出的所有实验方案均符合日本国立神经与精神卫生研究中心（NCNP）制定的动物护理指南。所有实验均已获得NCNP机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 反义寡核苷酸的设计

  1. 使用 rescue ESE 和 ESEfinder 程序检测 ESE 位点44, 45-47。
  2. 设计针对目标外显子的 25 个碱基对（bp）的反义序列。在犬模型中靶向外显子 6 和外显子 8（图 1）。
    1. 对于 PMO，使用 25–30 bp 的序列（表 1），对于 2'OMePS 则使用 25 bp 的序列。设计 25 bp 序列时，应选择位于目标区域内的序列。考虑二级结构、避免异源二聚体、外显子剪接增强子基序以及 GC 含量，以形成稳定的序列43。反义寡核苷酸应至少靶向上述软件识别出的一个 ESE 位点。
    2. 选择 GC 含量低于 65%、连续 G 碱基数少于 4 个、且不含自互补序列的反义寡核苷酸。使用 NCBI Blast 软件预测脱靶结合位点22,48,49。
  3. 选择合适的反义寡核苷酸骨架化学修饰类型。对于体外实验，使用 2'-O-甲基寡核苷酸（2'OMePS）或吗啉代寡核苷酸；对于体内实验，使用 2'OMePS、吗啉代寡核苷酸或偶联肽的吗啉代寡核苷酸（vPMOs）3,19,48,50。

2. 体外实验（CXMD模型中外显子6和外显子8的跳跃）

  1. 2'OMePS 狗成肌细胞转染
    1. 在3 ml培养基中培养CXMD成肌细胞 6 孔板中的生长培养基 孔板。接种 1 - 5 x 103 细胞/厘米²2 0.5 ml/cm2 用于成肌细胞的培养基。生长培养基使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） 40.
    2. 37℃孵育 °C，直至细胞汇合度达到60%–80%，大约需要12至24小时。
    3. 将阳离子脂质体转染试剂稀释至总体积100 μL µl 在低血清培养基中（转染试剂：AONs 体积比为 2:1）， 例如, 10 µl 脂质体转染试剂 vs. 5 µg AONs）。将混合物在室温下静置 30 - 45 分钟
    4. 将AONs（2'OMePS或morpholinos）稀释至终体积100 μL µl 在血清减量培养基中。
    5. 将稀释的转染试剂与稀释的反义寡核苷酸（AONs）混合，在室温下孵育10至15分钟。
    6. 在转染试剂/AON混合物于室温孵育期间，通过抽吸去除细胞中的旧培养基，并用培养基洗涤细胞。
    7. 加入 0.8 ml 将培养基加入转染试剂/AON混合物中，然后将全部溶液加入 freshly-washed 细胞中。孵育 3 小时 在 37 °C.
    8. 孵育后，将培养基更换为分化培养基（DM）； 分化可以 最多需要10天。从第3天左右开始检查是否发生分化。分化培养基为含2%马血清、200 U/ml的DMEM 青霉素，200 mg/ml 链霉素和10 µg/ml 胰岛素
  2. 吗啉寡核苷酸转染狗成肌细胞
    1. 按照步骤2.1所述，将CXMD成肌细胞在生长培养基中进行培养。
    2. 更换为分化培养基（DM），并向每孔加入0.1 mM的储备morpholino，使终浓度为1 µ将 M. Heat 混合物形态寡核苷酸在 65 °C 下孵育 10 分钟，以避免 AON 聚集。加入肽递送试剂 39,51 并调整至终浓度为 3 - 6 µM.
    3. 16 - 48 小时后 孵育后，收集细胞用于RNA提取。加入1 ml 使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿处理细胞，使细胞从培养板上脱落。此步骤完成后进行RNA提取。
      1. 或者，加入胰蛋白酶以覆盖所有细胞，并孵育2分钟 在 37 °C.
        注意：若计划进行免疫化学染色，请使用带腔室的载玻片进行细胞培养。分化完成后，可用4%多聚甲醛（PFA）固定10分钟。
  3. RNA提取与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
    1. 细胞一旦分化为肌管，即移除培养基并加入1 ml 酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿；孵育10分钟 室温下
    2. 转移至 1.5 ml 管。与200 µl 氯仿，室温孵育 2 分钟 直到出现三层分离的界面。从上到下的三层分别为：RNA层、DNA层和蛋白质层。
    3. 12,000 离心 × 4℃下，15分钟，1000 × g离心 °C. 移除上层上清液，并将其置于含有500 µl 异丙醇（如果在此停止，将上清液于 -80 保存） °C). 将上清液在 12,000 转/分钟离心 × 4℃下，10分钟内离心1000 × g °C；离心后，保留所得的RNA沉淀，弃去上清液。
    4. 用乙醇洗涤沉淀，并在 4℃ 下以 8,000 × g 离心 5 分钟 °C. 将管子倒置15分钟以蒸发残留的乙醇 然后加入15 - 30 µl RNase-free水。使用紫外/可见光分光光度法在260 nm处测定总RNA浓度。
    5. 将 RT-PCR 反应所需的试剂混合：1.5 µl 10 μM 正向引物，1.5 µl 10 μM 反向引物，1 µl dNTP，5 µl 一步法 PCR 试剂盒缓冲液，0.7 µl RNase 抑制剂，1 µl 一步法PCR试剂盒中的酶混合物，以及200 ng RNA。将上述组分混匀后，加水至终体积为25 μL µl.
    6. 将混合物放入热循环仪中。运行30分钟 50 个循环 °C，15 分钟 95℃循环 °C，随后进行35个循环的94 °C，1 分钟，60 °C，1 分钟，以及 72 °C，1 分钟。 最后，于72℃运行10分钟循环 °C. 将PCR产物于4℃冰箱中保存 °C 或 -20 °C
  4. 互补DNA（cDNA）测序
    1. 使用琼脂糖凝胶电泳鉴定外显子6-9跳跃的条带。加载5 µl 将各样本加入1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中，以135 V电泳5分钟，随后以120 V电泳20分钟。接着将凝胶在室温下用DNA凝胶染料染色30分钟，使用成像软件观察条带。
    2. 使用凝胶回收试剂盒切下目标条带。
      1. 切下DNA片段，并使用200 μL溶胶液溶解凝胶切片 µl NTI/100 mg 凝胶。静置 5 至 10 分钟 在50 °C 水浴。然后转移至硅胶膜离心管。
      2. 11,000 × g 离心 30 秒。用 700 μL 洗涤两次 µl NT3缓冲液中，再次以11,000 × g离心30秒。
      3. 以11,000 × g离心1分钟，干燥硅胶膜。
      4. 加入 15 - 30 µl NE缓冲液，室温静置1分钟。然后在11,000 x g离心1分钟。弃去硅胶，保留管中液体。
    3. 使用测序试剂盒按照说明书确定序列 制造商的说明书

3. 肌内注射或开放性肌肉活检

  1. 为在存活手术期间维持无菌条件，使用电推剪去除手术部位（后肢）周围区域的毛发。使用碘伏或氯己定 作为消毒剂。将无菌手术巾覆盖在整个动物体及手术台上，并固定以形成无菌手术区域。
    1. 穿戴洁净的刷手服、口罩、头帽、无菌手套以及专用手术室鞋52,53。
  2. 对CXMD犬静脉注射硫喷妥钠，剂量为20 mg/kg，以实现麻醉。使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
  3. 使用2–3%异氟烷吸入维持全身麻醉（图3）。通过检查肌肉反射并监测心率和呼吸频率来评估麻醉深度。全身麻醉下的正常呼吸频率（RR）、心率（HR）和血氧饱和度（SpO2）如下：RR：10–20次/分钟；SpO2：95–100%；HR：80–120次/分钟（bpm）。
  4. 使用手术刀切开胫前肌（CT，又称tibialis anterior，TA）表面皮肤，并 沿纵轴做一条约5 cm长的切口（适用于年轻成年犬）。为标记注射位点，使用手术针和缝合线缝合深筋膜，并以2 cm间隔制作两个缝合标记。
  5. 使用27 G针头将所需浓度的AONs注入肌肉。不同处理条件下所需浓度有所不同。对于CT肌肉，进行两次注射，每次1 ml ，总剂量为1.2 mg的混合PMOs（每种PMO 0.4 mg）或 0.4 mg的混合vPMOs（每种vPMO 0.13 mg）。 对于前肢的伸腕尺侧肌（ECU），每次注射0.5 ml，共两次，总剂量为1.2 mg的混合PMOs（每种PMO 0.4 mg）或0.4 mg的混合vPMOs（每种vPMO 0.13 mg）。 注射后留针1分钟。混合AONs中每种成分应等量使用。
  6. 使用手术刀从CT肌肉切取一段长约2 cm的肌肉组织，进行开放性肌肉活检。
  7. 转至步骤6.5进行肌肉样本制备。
  8. 在动物从全身麻醉中苏醒前，使用针头肌肉注射盐酸布托啡诺，剂量为0.02 mg/kg。将肌肉筋膜和皮肤复位，并分别使用3-0可吸收缝线和3-0尼龙缝线缝合筋膜和皮肤。
  9. 保持犬口腔张开，判断咽反射 是否恢复；一旦咽反射恢复，即可拔除气管插管。
  10. 为预防感染，通过静脉或肌肉注射头孢唑林或头孢氨苄（抗生素），剂量为15–30 mg/kg，连续给药最多3天。
  11. 在七天内拆除缝线。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前不得无人看护，且在完全康复前不得让其与其他动物接触。尽可能长时间保留气管插管，当动物开始咀嚼或吞咽时再予以拔除。持续监测动物的心率、呼吸及水合状态，确保其稳定且处于正常范围内。
  12. 术后护理期间，提供为期3天的镇痛治疗（例如， 盐酸布托啡诺0.01 mg/kg）及护理支持，包括安静、昏暗的休息环境，适当的伤口和敷料维护，柔软的卧具，通过口服或肠外途径补液以恢复水合状态，并通过提供适口性高的食物或零食帮助恢复正常进食。 若动物需要额外药物，可根据疼痛症状肌肉注射酒石酸布托啡诺，剂量为0.3 mg/kg。
    注意：疼痛中的犬可能出现咬人、抓挠或保护疼痛区域的行为，被触碰时可能表现出异常的警惕或攻击性。此外，单肢疼痛通常会导致跛行或抬高患肢，并尝试避免使用该肢体。在此类情况下，应每6–8小时肌肉注射一次盐酸布托啡诺，剂量为0.02 mg/kg。

4. 全身注射

注意：可根据需要每周或每两周重复一次该操作，持续数周。

  1. 用手轻轻固定犬只，使其躺下，然后将手臂搭在肩部和髋部，以在整个操作过程中固定犬只位置。
  2. 注射 AONs； 120 - 240 mg/kg 混合物PMOs（每种AON 40 - 80 mg），通过静脉留置针注入肢体静脉（即头静脉或隐静脉）。AON的注射剂量取决于实验条件。混合物中每种AON的用量应相等。
  3. 使用输液泵或注射泵注入 50 ml 总计以...的速率 2.5 ml/min 的速度持续 20 分钟，具体操作遵循制造商说明书。每周或每两周（每两星期）重复注射，至少注射 5 次，因为重复注射可使抗肌萎缩蛋白的表达逐渐累积。
  4. 每周进行血液检测以评估毒性。
    1. 使用针头采集3 ml 血液的 — 0.5 ml 用于全血细胞计数（CBC）和 2.5 ml 对于其他情况 — 从前肢或后肢的皮下静脉之一采血。采集的血液样本进行检测时，应包括全血细胞计数（CBC）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酸激酶（CK）和肌酐的测定，具体操作遵循血液检测试剂盒的制造商说明书。 40,54

5. 犬的临床分级

  1. 架设摄像机并记录狗的行为和步态。记录与狗互动的全过程，因为这将在评分时作为参考依据；这意味着每个视频的长度将根据狗的能力和配合程度而有所不同。使用默认的录制参数。拍摄视频可保存评分记录，以便日后回顾审查。
  2. 评估步态和运动障碍。
    1. 对于步态和运动障碍，采用以下分级：
      1级=无异常，2级=坐立时后肢伸展，3级=后肢呈兔跳式行走，4级=拖行步态行走，5级=无法行走。
    2. 对于运动障碍，使用以下分级：1级 = 无，2级 = 躺卧时间多于正常，3级 = 无法用后肢跳跃 4级 = 行走活动困难逐渐加重，5级 = 无法起身活动。
  3. 记录狗跑完15 m所需的时间。量出15 m的距离，将狗置于起跑线处，并鼓励其跑至15 m标记处。
  4. 确定肌肉萎缩程度 使用以下分级标准对肢体进行评估：
    1级=无，2级=疑似硬化，3级=可触及硬化或外观变薄，4级=介于3级与5级之间，5级=极度变薄或硬化。
  5. 使用以下标准对流涎进行分级：1级 = 无流涎，2级 = 坐位时偶有唾液滴出，3级 = 进食和饮水时有少量唾液流出，4级 = 进食或饮水时出现成丝状的唾液流出，5级 = 持续性流涎。
  6. 使用以下分级标准评估舌体肥大（巨舌症）：1级=无肥大，2级=轻度增大，3级=超出牙列范围，4级=增大且轻度增厚，5级=明显增大且增厚。
  7. 根据以下标准评估犬只的吞咽能力：1级=无困难，2级=进食耗时且费力，3级=从盘中取食困难，4级=咀嚼、吞咽或饮水困难，5级=无法进食。
  8. 通过将每个类别（15 米跑测试除外）的得分相加来计算总成绩 55.
    注意：研究应采用盲法，以避免引入偏倚。

6. 磁共振成像（MRI）

  1. 使用3特斯拉（3T）磁共振成像仪和直径18 cm、长度18 cm的人体四肢线圈获取后肢的T2加权图像。
  2. 通过向CXMD犬注射20 mg/kg硫喷妥钠进行麻醉。在眼睛上使用兽用眼膏以防止角膜干燥。使用2-3%异氟烷吸入维持全身麻醉。
    1. 检查肌肉反射，并监测心率和呼吸频率以评估麻醉深度。全身麻醉下的正常呼吸频率（RR）、心率（HR）和血氧饱和度（SpO2）如下：RR：10 - 20次/分钟， SpO2：95 - 100%，HR：80 - 120次/分钟（bpm）。
  3. 采用以下参数获取T2加权图像：TR/TE = 4,000/85毫秒，层厚 = 6 mm，层间距 = 0 mm，视野 = 18 cm × 18 cm，矩阵大小 = 256 × 256，采集次数 = 3，采用快速自旋回波序列（图4）。

7. 肌肉取样与制备（尸检）

注意：应在末次AON注射后一至两周内采集肌肉样本。

  1. 以20 mg/kg的硫喷妥钠剂量对犬进行注射以实施麻醉。在麻醉期间使用兽用眼膏以防止眼睛干燥。
  2. 使用 2 - 3% 异氟烷吸入维持麻醉。检查肌肉反射并监测心率和呼吸频率以评估麻醉深度。正常呼吸频率（RR）、心率（HR）和血氧饱和度（SpO₂）2 在全身麻醉下的指标如下：RR：10 - 20 次呼吸/分钟；SpO2：95 - 100%，心率：80 - 120 次/分钟。
    1. 在全身麻醉下通过放血法处死犬只（仅用于尸检）。在深度全身麻醉下进行放血，以避免血液来源因子对分子分析结果产生影响。例如，心肌。
  3. 解剖以下肌肉（图5：膈肌、肋间肌、腹肌、股二头肌、股直肌、肱二头肌、肱三头肌、三角肌、桡侧腕长伸肌（ECR）、尺侧腕伸肌（ECU）、桡侧腕屈肌（FCR）、尺侧腕屈肌（FCU）、胫骨前肌（CT）、趾长伸肌（EDL）、腓肠肌、比目鱼肌、股薄肌、背阔肌、食管、胸锁乳突肌和心脏。为评估毒性，采集肾脏和肝脏样本。解剖技术可参考 Evans 与 Alexander de Lahunta（2009）的著作。 56.
  4. 将胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌、比目鱼肌、股二头肌、股直肌、肱二头肌、肱三头肌、三角肌、尺侧腕伸肌、桡侧腕伸肌、尺侧腕屈肌、桡侧腕屈肌、股薄肌、肋间肌、腹肌、背阔肌、食管、胸锁乳突肌、心脏、肾脏和肝脏切成约1 - 1.5 cm长的小段。将膈肌卷起，然后切成1 - 1.5 cm的片段。 56.
  5. 将刺梧桐胶置于软木圆片上，使其厚度约为0.5–1 cm。在软木圆片的另一侧标记动物编号及肌肉名称。
  6. 将肌肉纵向轴垂直于软木塞置于石黄麻胶中。
  7. 将软木塞放入盛有异戊烷的容器中，该容器置于液氮中。用镊子不断移动软木塞，持续1分钟。 或直至完全冻结。将肌肉置于装有软木塞的冻存管中，在 -80 ℃ 保存 °C. 运输时，将小瓶置于干冰上。
  8. 准备已标记动物编号/肌肉名称和日期的载玻片。
  9. 在预冷至 -25 的恒冷箱中 °C，将软木塞固定到支架上。将切片厚度设置为所需值。使用 8 µ用于免疫组织化学的 m 和 12 µ用于苏木精-伊红（HE）染色。使用15 µ用于蛋白质印迹样品。修剪约四分之一的肌肉，以获得平整的肌肉用于适当的肌肉取样。
  10. 一次切割一块肌肉，每隔6th 若计划将样本用于免疫组织化学或苏木精-伊红（HE）染色，则应将切片置于同一张玻璃载片上。若用于蛋白质印迹实验，应将30–40张切片放入离心管中，并于-80℃保存。 °C.
  11. 载玻片制备后，室温下干燥1.5小时。将载玻片于-80℃保存 °C.

8. 免疫组织化学

  1. 从储存处取出准备好的载玻片，放入湿盒中，使载玻片彼此分离并保持湿润。向湿盒中加水，直至底部刚好被水覆盖（水层厚度约1 mm）。
  2. 室温下空气干燥0.5小时。使用疏水屏障笔在载玻片上围绕肌肉样本画出一个方框。
  3. 加入含15%山羊血清的磷酸盐缓冲液（PBS），在封闭剂中室温孵育2小时 。
  4. 加入抗肌营养不良蛋白杆状区（DYS-1）小鼠单克隆一抗，或用于犬肌营养不良蛋白染色的C端单克隆抗体（DYS-2）（1:150稀释）。用封闭剂在1.25 ml PBS中稀释，于4 °C冰箱中过夜孵育 。
  5. 用PBS洗涤5分钟，重复三次。加入针对小鼠IgG1（用于DYS-2）或IgG2（用于DYS-1）的Alexa 594标记山羊二抗（1:2,500稀释）。用含0.1%辛基酚聚氧乙烯醚的PBS封闭剂稀释，室温孵育0.5小时。
  6. 用PBS洗涤5分钟，重复三次。让载玻片自然干燥。加入1–2滴（3 ng/ml）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片液。用镊子将盖玻片覆盖在组织切片上，避免产生气泡。
  7. 在荧光显微镜下以20倍放大倍数、594 nm波长观察肌营养不良蛋白（DYS-1/DYS-2）阳性肌纤维。

9. 蛋白质印迹

  1. 将冷冻切片收集的肌肉切片加入 150 µl 在冰上加入上样缓冲液。
  2. 使用手动匀浆器短暂匀浆蛋白样品。将样品置于1.5 ml离心管中，在加热块中95°C加热5分钟。 在95℃的加热块孵育器中将试管孵育 °C，离心3-5分钟，转速为16,500 × 15 分钟内离心 1,000 × g 并收集上清液。
  3. 将上清液分装后于 -70 ℃ 保存 °C. 使用蒸馏水稀释至100倍。
  4. 使用商用试剂盒，按照生产商提供的说明书测定蛋白浓度。加入2倍体积的 将Laemmli SDS上样缓冲液加入样品中，加热3分钟 在 95 °C.
  5. 将样品加入 3 - 8% Tris-乙酸盐凝胶中，电泳运行 3 小时 在150 V电压下进行。包括多个稀释的野生型（WT）样本（例如，1%、10% 和 50%）进行定量。该方法可检测到低于 1% WT 水平的抗肌萎缩蛋白。
  6. 将凝胶置于阴极缓冲液中 20 分钟。在此期间，取九张滤纸，分别放入转移缓冲液中（3 张放入阴极缓冲液[+]，3 张放入阳极缓冲液[-]，3 张放入浓缩阳极缓冲液[--]）。此为一种半干式转印方法，可提高检测灵敏度图6).
  7. 将PVDF膜浸泡在甲醇中20秒 然后放入阳极缓冲液中。
    将凝胶与膜组装用于半干转印，在室温或冷室中以400 mA电流运行1.5小时。
  8. 用 PBS 清洗膜。将膜在含有 5% 脱脂奶粉的 PBS-Tween 20（PBST）溶液中孵育 2 小时。
  9. 将 DYS-1（一抗）用 PBST 与 5% 脱脂奶粉混合液稀释至 1:100，加入膜中，室温孵育至少 1 小时。用 100 ml 洗涤液漂洗三次 PBST 中孵育 15 分钟 每个
  10. 加入65 µl/lane 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（DYS1 使用抗小鼠 IgG2a），1:5,000 稀释，室温避光孵育 1 小时。随后，用 TBST 洗涤三次 200 ml PBST 中孵育 20 分钟。按照检测试剂盒说明混合溶液，孵育 1 分钟。
  11. 显影以检测条带，并使用 ImageJ 软件进行分析 48,57,58.

结果

体外实验

为比较每种反义寡核苷酸（AON）的有效性，将成肌细胞转染至不同的 2'OMePS 处理条件下。分别使用 600 nM 的 Ex6A、Ex6B、Ex8A 或 Ex8B 进行单个 AON 处理，并使用包含全部 4 种 AON 序列、每种各 600 nM 的混合物进行鸡尾酒式处理。转染后第 4 天收集 RNA 样本。经 RT-PCR 后，各处理组样本与未经处理（NT）的样本一同进行凝胶电泳。凝胶上位置较高的条带代表移码的 DMD 产物；这些条带在未经处理（NT）、Ex8A 和 Ex8B 处理的成肌细胞中可见。Ex6A、Ex6B、Ex8A 及鸡尾酒处理组的成肌细胞则显示出同框产物。其中，鸡尾酒处理组及 Ex6A/B 处理组显示出 100% 的同框产物，而 Ex8A 仅显示出 30% 的同框产物（图 7）。为确认外显子跳跃及阅读框的恢复，进行了 cDNA 测序；结果表明外显子 6 至 9 确实发生了跳跃（图 7）。免疫组织化学结果显示，与未经处理样本相比，AON 处理的犬类样本中抗肌萎缩蛋白阳性纤维数量增加（图 8）。

体内实验

为比较不同反义寡核苷酸（AON）治疗条件的效率，对年龄在0.5至5岁的CXMD犬单次注射1.2 mg Ex6A，或不同剂量的Ex6A、Ex6B与Ex8A混合物。注射两周后采集肌肉样本，使用DYS-1染色以比较dystrophin阳性纤维的数量。所有接受混合物治疗的样本均显示dystrophin表达较未治疗（NT）样本增加，且dystrophin阳性纤维数量随AON剂量增加而上升图9）。系统注射后，对野生型（WT）、NT 和混合治疗的 CXMD 肌肉样本进行 DYS-1 染色（图10）。与未治疗的CXMD犬相比，鸡尾酒疗法处理的CXMD犬在骨骼肌（CT）和心肌样本中均显示出更高的抗肌萎缩蛋白表达。然而，经AON处理的骨骼肌（CT）中抗肌萎缩蛋白的表达水平明显高于经处理的心肌组织。通过免疫印迹法对野生型（WT）、未治疗组（NT）以及不同吗啉代寡核苷酸鸡尾酒处理组的肌肉样本进行比较，得出了相同的结论。在经处理的骨骼肌样本中，抗肌萎缩蛋白的表达水平也存在较大差异。图10）。苏木精-伊红（HE）染色显示，经处理的 CXMD 与未治疗的CXMD犬相比，治疗组犬只的组织病理学表现得到改善，中心核纤维（CNF）数量显著减少（图11）。这表明NT犬只中存在更显著的变性/再生现象，是肌营养不良性肌肉病理的征象。此外，经治疗的犬只跑步用时更短，且在临床评分量表上的得分更高。在所有评估类别中，经治疗的CXMD犬只的评分均优于未经治疗的CXMD犬只。图12).

mRNA剪接示意图；正常与杜氏肌营养不良犬mRNA及AO处理的外显子跳跃过程。
图1. CXMD犬的突变模式及使用反义寡核苷酸混合物跳过外显子6-8的策略。CXMD犬在外显子6中存在一个点突变，导致杜氏肌营养不良犬mRNA中缺失外显子7。这使得mRNA读码框发生移码，无法产生抗肌萎缩蛋白（dystrophin）。设计短链反义寡核苷酸（AON）序列以结合外显子6和8，从而在mRNA剪接过程中有效跳过外显子6-8。经AON混合物处理的犬中灰色条带代表短链AON序列。外显子9编码一个铰链区结构域，在针对外显子6和8的AON作用下有时会自发被剪除。最终产生的mRNA编码的抗肌萎缩蛋白虽较短，但具有功能。请点击此处查看该图的高清版本。

野生型与CXMD比格犬肌肉营养不良症状比较，1岁，示意图。
图2. 一岁犬X连锁肌肉营养不良（CXMD）动物的主要临床症状。图中显示了一只一岁的野生型比格犬和一只CXMD患病犬。自两个月龄起，通常可观察到近端肢体肌和颞肌受累；自四个月龄起，关节挛缩和骨盆移位表现明显。请点击此处查看该图的放大版本。

兽医外科手术、麻醉准备、手术器械、动物护理设置。
图3. 犬的全身麻醉。A) 在异氟烷全身麻醉下进行肌肉注射和肌肉活检。B) 固定动物以进行系统性注射。请点击此处查看该图的放大版本。

比较不同基因型小鼠随时间推移的脑部发育的MRI扫描图像；WT、NT、2703MA、2001MA。
图4. 野生型、未经治疗的CXMD及经治疗的CXMD的磁共振成像（MRI）。 WT和NT型CXMD犬在3个月和5个月时的后肢MRI扫描图像。展示了两只经治疗的CXMD犬在注射反义寡核苷酸（AON）前（首次注射前1周）和注射后的后肢MRI样本图像。2703MA接受了每周7次、每次200 mg/kg混合吗啉代寡核苷酸的治疗。2001MA接受了每周5次静脉注射、每次120 mg/kg混合吗啉代寡核苷酸的治疗。对照组与治疗组犬只年龄匹配。经治疗的犬只显示出T2信号降低。图片经Yokota et al.（© 2009，John Wiley & Sons）许可改编40 请点击此处查看此图的放大版本。

对犬肢体进行手术以提取组织；包括切口和样本制备。
图5. 犬肌肉活检操作流程。A) 固定犬的下肢以进行肌肉活检。B) 使用镊子夹持下肢。C) 暴露CT肌。采用开放活检技术获取注射部位的肌肉样本，并使用缝线标记活检样本。D) 解剖后置于黄蓍胶上的肌肉样本。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质转印装置示意图，显示在电场作用下用于Western印迹的层状材料。
图6. 半干法转印方法。 本图展示了用于Western印迹的半干法转印方法。在负极端放置三层浸透浓阳极缓冲液的滤纸；再在其上叠加三层浸有阳极缓冲液的滤纸。Mb PVDF膜先用甲醇浸泡，再用阳极缓冲液浸泡，然后铺在六层滤纸上。已浸透阴极缓冲液的凝胶轻柔地覆盖在PVDF膜上。最后，在凝胶上方放置三层浸有阴极缓冲液的滤纸，并将正极端置于最上方。系统以400 mA电流运行1小时。请点击此处查看该图的放大版本。

PCR 电泳结果和测序色谱图；基因编辑分析；外显子比对。
图 7. CXMD 成肌细胞中的外显子跳跃。 将 Ex6A、Ex6B、Ex8A 或 Ex8B 单独转染至 CXMD 成肌细胞，或联合使用四种序列的混合物。单个序列使用总量为 600 nM，混合物中每种序列各使用 600 nM。A) 在 CXMD 犬成肌细胞中进行 2'OMePS 处理。Ex6A、Ex6B 及混合物处理的样本在预期位置显示出明显的同框外显子跳跃转录本条带。Ex8A 显示中等强度条带，Ex8B 显示微弱条带，而 NT 样本在同框位置无条带。B) 转染后第 4 天，单独使用 Ex6A 处理的 cDNA 测序结果。图片经 Yokota et al.（© 2009, John Wiley & Sons）许可改编40。 请点击此处查看本图的放大版本。

荧光显微镜比较WT、Cocktail、Ex6A、NT中细胞生长情况；比例尺50 μm。
图8. 经2'O-甲基化硫代磷酸酯（2'OMePS）转染的CXMD成肌细胞中抗肌萎缩蛋白表达增加。 将Ex6A单独或与2'OMePS鸡尾酒混合物转染至CXMD成肌细胞中。图中显示DYS-2（红色）和DAPI（蓝色）染色结果。将处理后的成肌细胞与野生型（WT）及未处理（NT）成肌细胞进行比较。图像经Yokota et al.（版权2009，John Wiley & Sons）许可改编40。标尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织样本的免疫荧光显微镜图像；WT、NT、Ex6A、混合物。细胞形态比较。
图 9. 通过肌内注射 Morpholino 在 CXMD 犬中恢复抗肌萎缩蛋白的表达。 将单独的 Ex6A 或 Ex6A、Ex6B 与 Ex8A 的混合物注射至 CXMD 犬的 CT 肌肉中。图中显示了野生型（WT）、未治疗（NT）及治疗后 CXMD 犬的抗肌萎缩蛋白（DSY-1）染色结果。犬只分别接受 1.2 mg Ex6A 单独注射或 1.2 mg 混合物注射。图像经 Yokota et al.（© 2009, John Wiley & Sons）许可改编40。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

野生型、CXMD及PMO处理后的肌肉组织分析；包含显微镜图像和凝胶结果。
图10. CXMD犬经全身性混合吗啉寡核苷酸治疗后抗肌萎缩蛋白表达增加。采用抗肌萎缩蛋白（DYS-1）染色法比较野生型（WT，阳性对照）、未处理（NT，阴性对照）以及接受120 mg/kg吗啉寡核苷酸混合物（每种AON为40 mg/kg）治疗的CXMD犬的抗肌萎缩蛋白表达情况。该吗啉寡核苷酸混合物包含Ex6A、Ex6B和Ex8A。犬只每周静脉注射该混合物5次。A) 比较WT、NT和治疗组犬颅胫肌（CT）中抗肌萎缩蛋白的表达。B) 比较NT组与吗啉寡核苷酸混合物治疗组犬心脏组织中抗肌萎缩蛋白的表达。C) 显示WT、NT及接受吗啉寡核苷酸混合物治疗犬的抗肌萎缩蛋白免疫印迹图，以结蛋白（desmin）作为上样对照。治疗组犬所检测的肌肉包括：肱三头肌（TB）、肱二头肌（BB）、膈肌（DIA）、食管（ESO）、CT、内收肌（ADD）、趾长伸肌（EDL）、咬肌（MAS）和心脏。图片经许可改编自Yokota et al.（版权2009，John Wiley & Sons）40。标尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

未处理与经处理组织的组织学对比图；处理后细胞结构的变化。
图11. 接受为期7周、每周240 mg/kg吗啉寡核苷酸混合物治疗的CXMD犬组织病理学改善。 年龄介于半年至五岁的CXMD犬，每周静脉注射一次240 mg/kg的吗啉寡核苷酸混合物（Ex6A、Ex6B和Ex8A），持续7周。末次注射后14天，取食管肌肉组织进行苏木精-伊红（HE）染色。图中显示未治疗（NT）与经吗啉寡核苷酸混合物治疗（Treated）的CXMD犬食管肌肉组织的HE染色结果（40倍物镜）。请点击此处查看该图的高清版本。

静态平衡；PMO注射对评分的影响；折线图；科研分析。
图12. Morpholino治疗后临床评分与15米跑时间的改善。Morpholino治疗的犬只与未经治疗（NT）的同窝犬进行了比较。图中误差线表示标准误（SEM）。A）计算治疗前后临床评分检查的总分，并将治疗动物与NT同窝犬进行比较。B）治疗犬与NT犬15米跑时间的比较。C）与B类似；但使用了年龄更小的犬只。图片经Yokota et al.（版权2009，John Wiley & Sons）许可改编40。请点击此处查看此图的放大版本。

反义寡核苷酸核苷酸序列
Ex6AGTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG
Ex6BACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT
Ex8ACTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC

表1. 反义寡核苷酸设计。

讨论

外显子跳跃是一种治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的有前景的治疗技术。两者 体外 和 在体内 实验已证明多外显子跳跃是可行的。本文讨论了CXMD犬模型的应用。首先，利用Rescue-ESE和ESEfinder程序设计靶向外显子6和外显子8的AONs dystrophin 外显子6 - 8。CXMD成肌细胞转染采用2'OMePS反义寡核苷酸化学修饰，而多外显子跳跃实验则选用吗啉代反义寡核苷酸骨架化学修饰。 在体内 实验。vPMOs 比未修饰的 PMOs 更高效，但由于其毒性较高，不适合用于系统性注射。对 CXMD 成肌细胞进行了 RNA 提取、RT-PCR 和 cDNA 测序。对注射了 PMO 混合物的狗进行临床评分，以评估其功能改善情况 临床症状。在人道安乐死后，采集犬的肌肉样本并制备用于冷冻切片。 抗体会诱导的抗肌萎缩蛋白的半衰期被认为约为1 - 2个月。本研究使用了年轻成年犬，但这些实验也可在新生犬和老年犬中进行。>5岁）。制备的肌肉切片用于通过蛋白质印迹和免疫组织化学评估组织病理学及 dystrophin 蛋白的恢复情况48.

注射前必须确保PMO溶液的体积准确，否则将对实验结果产生显著影响。进行肌肉注射时，需施加足够的压力以进入肌纤维。监测犬的健康状况并检查手术部位对于排查问题至关重要。为监测动物健康状况，应每周进行血液检测和称重。动物安乐死后制备肌肉样本，而在Western blotting实验中，为确保检测抗肌萎缩蛋白的灵敏度，关键步骤是使用Tris-醋酸凝胶和半干法转膜方法。

如代表性结果所示，用 Ex6A、Ex6B、Ex8A 以及包含 Ex6A、Ex6B、Ex8A 和 Ex8B 的混合物处理的成肌细胞均产生了可读框内（in-frame）的DMD产物。由于 Ex8B 未产生任何外显子跳跃产物，因此未将其用于后续的体内实验。cDNA 测序结果显示发生了外显子 6–9 的跳跃，且经 DYS-2 染色的免疫细胞化学分析显示，处理样本中肌营养不良蛋白（dystrophin）的表达得以恢复。经 AON 治疗的犬只中，肌营养不良蛋白阳性肌纤维数量显著增加，表明外显子 6–8 发生了跳跃，并产生了截短但仍具功能的蛋白。当使用 AON 混合物时，肌营养不良蛋白阳性肌纤维的比例进一步增加，且与 AON 剂量呈正相关。免疫印迹结果显示，接受全身性吗啉寡聚体（morpholino）治疗的犬只中，肌营养不良蛋白表达水平升高。骨骼肌中肌营养不良蛋白阳性纤维的表达水平存在差异；然而，经吗啉寡聚体处理的心肌组织中，肌营养不良蛋白表达改善不明显。由于肌营养不良蛋白分子量较大（427 kDa），微量蛋白的检测较为困难。为获得最佳检测效果，采用了 Tris-乙酸凝胶及半干转印法。苏木精-伊红（HE）染色显示，经吗啉寡聚体治疗的犬只肌肉组织病理学得到改善。中央核肌纤维（CNFs）是肌肉不健康的表现，反映了肌肉反复发生变性与再生的过程。与未经治疗的 CXMD 犬只相比，经吗啉寡聚体治疗的 CXMD 犬只中 CNFs 所占比例有所下降。临床评分显示，经吗啉寡聚体治疗的动物症状有所改善，例如行走和奔跑能力增强。肌肉硬度被认为可反映肌肉萎缩程度，因此被纳入评分体系 59。本研究评估了大腿（后肢）肌肉的硬度，但排除了股直肌（cranial sartorius muscles），因为该肌肉在 CXMD 犬只中倾向于发生肥大而非萎缩。经治疗的犬只临床评分更低，且在 15 米奔跑测试中完成时间更短。15 米奔跑测试时间的缩短提示肌肉功能改善40。总体评分越高，表明健康状况越差，肌肉萎缩越严重。

尽管这些结果令人鼓舞，但多外显子跳跃技术仍面临诸多挑战，在该技术具备临床应用性之前仍需克服这些问题。心脏组织对反义寡核苷酸（AONs）的摄取仍然较低，这可能是由于心肌组织与骨骼肌组织之间细胞内转运机制的差异所致。在当前的给药方案下，动物实验中尚未观察到毒性效应；然而，在反义寡核苷酸鸡尾酒疗法进入临床试验之前，仍需开展更多工作以评估其长期毒性。反义寡核苷酸鸡尾酒药物的审批较为困难，因为监管机构将每种AON序列视为一种独立的药物。这意味着鸡尾酒疗法中的每种序列都必须单独进行安全性测试，从而需要更多的时间和资金投入。多外显子跳跃技术在临床应用中的另一个障碍是 会产生大量功能未知的中间蛋白产物。这些蛋白可能引发不可预测的副作用，具体取决于个体的突变类型22。此外，目前可用的肌营养不良犬模型中的突变模式有限。自然发生的突变较少，且并非所有突变都适用于多外显子跳跃的研究。肌营养不良猪模型有望成为未来DMD外显子跳跃研究的良好替代模型33, 34。

DMD 犬模型相较于其他 DMD 模型具有一些优势。作为一种体型较大的动物模型，可以进行临床评分和磁共振成像（MRI），从而实现更详细的分析。由于犬属于大型动物，也更适合开展毒理学研究，且与小鼠模型相比，其疾病表型更接近人类疾病。犬模型的 DMD 基因序列也与人类更为相似23, 34, 45。

尽管在技术上具有挑战性，多外显子跳跃方法仍然可以 最终受益 >90%的DMD患者 24这使其成为比单外显子跳跃更优越的治疗策略，因为单外显子跳跃仅适用于少数患者群体。此外，多外显子跳跃将使我们能够选择可优化截短型抗肌萎缩蛋白功能的缺失模式。例如，缺失 的 杜氏肌营养不良症 外显子45至55的缺失与极轻度症状或无症状个体相关 14,19,60-63. 已在携带外显子52缺失的DMD小鼠模型中证实了外显子45-55的多外显子跳跃mdx52) 通过系统性注射 vPMO 22,26鸡尾酒疗法vPMOs的使用也在其他类型的肌营养不良症中得到验证，例如福山先天性肌营养不良症（FCMD）。FCMD由外显子捕获引起，即逆转座子插入导致异常的mRNA剪接。研究表明，vPMOs可在FCMD小鼠模型及人类细胞系中恢复正常的剪接模式。 64下一代具有更高疗效和更低毒性的反义寡核苷酸化学修饰将有助于推动多外显子跳跃策略向临床应用的有效转化。此外，多外显子跳跃技术还可能应用于其他遗传性疾病，例如 dysferlinopathies（肌萎缩蛋白缺乏症）。 24, 65.

披露

本文的开放获取费用由 Gene Tools, LLC 提供。

致谢

本工作由阿尔伯塔大学医学与牙科学院、Garrett Cumming 研究基金之友基金、HM Toupin 神经科学研究中心基金、加拿大肌肉萎缩症协会、加拿大创新基金会（CFI）、阿尔伯塔省高等教育与技术部（AET）、加拿大卫生研究院（CIHR）、Jesse's Journey — 基因与细胞治疗基金会以及妇女与儿童健康研究所（WCHRI）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2'OMePS 狗成肌细胞转染 
3 ml 6孔板岩城5816-006
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s medium（DMEM） Gibco11965-092
胎牛血清（FBS） HyCloneSH30071.01
青霉素 Sigma-Aldrich P4333 200 U/ml 
Lipofectin Invitrogen 18292-011Opti-MEM 培养基中总体积为 100 ml，脂质体转染试剂与核酸比例为 2:1。 
5 mg RNA 使用 10 ml 脂质体转染试剂 Lipofectin。 
2’OMePSEurogentec Ex6A（GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG）、Ex6B（ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU）和Ex8A（CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC）。 
马血清 Gibco16050-1142%
链霉素 Sigma-AldrichP4333 200 μg/ml
牛血清白蛋白（BSA） Sigma-AldrichA9418 
胰岛素
狗肌母细胞的吗啉寡聚体转染
用于培养的狗成肌细胞 MePS 转染所需全部材料
反义吗啉代寡核苷酸 Gene-toolsEx6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC
TCAGG)
Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG
AGCGTT 
Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT
GCTCAC                          
用opti-MEM培养基定容至100 L。                  
120–200 mg/kg 的吗啉寡核苷酸，溶于生理盐水中，浓度为 32 mg/ml
Endo-PorterGene-tools
硫氰酸胍-苯酚-氯仿Invitrogen15596-0181 毫升/孔
RNA提取与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
硫氰酸胍-苯酚-氯仿Invitrogen15596-0181 毫升/孔
氯仿Sigma-AldrichP3803200 μl 
1.5 ml 离心管 Eppendorf22363204
离心 Beckman-Coulter
75% 乙醇 Sigma-Aldrich34852
紫外光谱仪 
外显子5中的上游引物 InvitrogenCTGACTCTTGGTTTGATTTGGA                          
1.5 μ10 μM
外显子10中的反向引物 InvitrogenTGCTTCGGTCTCTGTCAATG                            
1.5 μ10 μM
dNTPsClontech3040
一步法 RT-PCR 试剂盒 Qiagen 210210
热循环仪Scinco
互补DNA（cDNA）测序 
凝胶回收试剂盒 Qiagen 28704
离心 
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 应用生物系统公司 4337454
肌内注射或开放性肌肉活检
手术工具剪刀、手术刀、针、外科缝线 
兽用软膏 
碘伏 网络纺织品12190-71-5
氯己定Peridex12134
手术巾 
手术刷洗
面部口罩 
外科手套 
头部覆盖物 
硫喷妥钠 三菱田边制药 20 mg/kg 
异氟烷Abbott Laboratories 05260-052-3%
反义吗啉代寡核苷酸 Gene-toolsEx6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC
TCAGG)
Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG
AGCGTT) 
Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT
GCTCAC                          
用opti-MEM培养基定容至100 L。                  
120–200 mg/kg 的吗啉寡核苷酸，溶于生理盐水，浓度为 32 mg/ml
27 G NeedlesTERUMO SG3-2325 
50 ml 注射器TERUMOSG2-03L2225
盐酸丁丙诺啡
压舌板 
头孢氨苄15 至 30 mg/kg 
头孢唑林15 至 30 mg/kg 
布托啡诺 0.01 mg/kg
盐酸丁丙诺啡 0.02 mg/kg
全身注射
注射器输注泵 Muromachi 
22 G 型留置针TERUMOSG3-2225 
27 G Needles TERUMO SG3-2325 
50 ml 注射器TERUMOSG2-03L2225 
生理盐水Ohtsuka-Pharmaceutical28372
犬的临床评分
视频摄像机 
秒表 
磁共振成像（MRI） 
3 Tesla MRI l 
18 cm 直径/18 cm 长度人体四肢线圈
肌肉取样与制备（尸检）
硫喷妥钠 三菱田边制药 20 mg/kg 
异氟烷Abbott Laboratories 05260-052-3%
黄蓍胶10-20 ml
液氮 
软木圆片岩井化学 101412-806
干冰
镊子
聚-L-赖氨酸–包被载玻片Fisher22-037-216
冷冻切片显微系统 Leica cm1900 
免疫组织化学 
DYS1 诺沃卡斯特拉 NCL-DYS1 1:150 稀释液 
DYS2诺沃卡斯特拉 NCL-DYS2 1:150 稀释液
Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG1 InvitrogenA-211251:2,500 稀释度
Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG2 InvitrogenA-110051:2,500 稀释液
DAPI InvitrogenD1306含封片剂
山羊血清 Invitrogen10000C15%
PBS
保湿室 科学装置实验室 197-BL
培养皿载片 Lab-tek 154453
盖玻片 Fisher12-540A
疏水屏障笔 
荧光显微镜 594 nm，20倍放大。 
蛋白质印迹法 
蒸馏水 
手动匀浆器 
2× Laemmli SDS上样缓冲液 0.1 M Tris–HCl（pH 6.6），2%（w/v）SDS，2%（0.28 M) β-巯基乙醇，20% 甘油，0.01% 溴酚蓝 
SDS 凝胶 伯乐（Bio-Rad） 161-12105% 分离胶
SDS 凝胶Invitrogen Invitrogen, WG1601BOX3-8%
PVDF膜 通用电气10600021
甲醇
运行缓冲液（10×) 250 mM Tris-Base，1,920 mM 甘氨酸
运行缓冲液（1×)10% 10× 缓冲液，20% 甲醇 
0.05% PBS/吐温20（PBST） 2,000 ml              
3× 200 ml 用于洗涤
PBST/5% 脱脂奶粉 100 ml
蛋白检测试剂盒BCAT9650
Tween 20 Sigma P5927
尿素Sigma U5378
β-巯基乙醇 MilliporeES-007-E
十二烷基硫酸钠SigmaL3771
Tris-乙酸盐Sigma
Tris HClSigmaT3253
甘油SigmaG8773
Western 印迹上样/样品缓冲液NuPage InvitrogenNP007
NaClSigmaS3014
PMSFSigmaP7626
蛋白酶抑制剂混合物 罗氏11836153001
阴极缓冲层0.025 M Tris 碱 + 40 mM 6-氨基己酸 + 20% 甲醇
阳极缓冲液0.03 M Tris 碱 + 20% 甲醇
浓缩阳极缓冲液0.3 M Tris 碱 + 20% 甲醇
结蛋白抗体 Abcamab8592
DYS1 诺沃卡斯特拉 NCL-DYS1 1:150 稀释液 
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参考文献

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