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方法文章

可视化Xylella fastidiosa中的抽搐运动及其PilG蛋白功能的表征

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DOI：

10.3791/53816

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2016年4月8日

 , 
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

本文内容

摘要

本研究采用纳米-微流控流动室，对引起葡萄藤皮尔斯病的细菌Xylella fastidiosa的抽搐运动进行可视化和功能表征。

摘要

Xylella fastidiosa 是一种革兰氏阴性、无鞭毛的细菌，可引起多种对植物具有重要经济影响的病害。 twitching 运动性提供了 X. fastidiosa 一种介导植物体内长距离移动和定殖的机制，有助于增强其致病性 X. fastidiosa 抽搐运动性 X. fastidiosa 由 IV 型菌毛驱动。IV 型菌毛的 Xylella fastidiosa 受调控于 pilG, Pil-Chp 操纵子中的一种趋化性调节蛋白，该操纵子编码参与信号转导通路的蛋白质。为了阐明其作用 pilG 在抽搐运动中 X. fastidiosa，一个 pilG缺陷型突变体 XfΔpilG 及其互补菌株 XfΔpilG-含天然 C pilG 已开发出相关方法。采用整合了延时成像记录系统的微流控腔室来观察抽搐运动 XfΔpilG，XfΔpilG-C 及其野生型菌株。 使用该记录系统，可对细菌通过抽搐运动进行的个体细胞及群体聚集、迁移等行为进行长期的时空观察。 X. fastidiosa 野生型和互补型 XfΔpilG-C 菌株在微流控流动室中直接观察到典型的抽搐运动特征，而突变株 XfΔpliG 表现出运动缺陷表型。本研究表明 pilG 促进细菌的抽搐运动 X. fastidiosa 微流控流动室被用作观察抽搐运动的方法。

引言

Xylella fastidiosa 是一种革兰氏阴性、无鞭毛的致病菌，可引起多种具有重要经济影响的作物病害，包括葡萄藤的皮尔氏病（Pierce's disease）Vitis vinifera L.)1,2, 3该细菌局限于负责输水的木质部导管。葡萄藤感染后会导致木质部导管堵塞，从而引发水分胁迫和营养缺乏。3成功定殖取决于细菌从初始感染位点移动至植物其他部位的能力。3. 菌毛介导的滑行运动是一种不依赖鞭毛的细菌运动方式，通过极性IV型菌毛的延伸、附着和回缩实现4 已对其进行表征的 X. fastidiosa5,6,7.

通过激光镊子和原子力显微镜（AFM）已观察到细菌的抽搐运动行为8,9,10。利用这些技术，研究人员通过对N. gonorrhoeae和P. aeruginosa的IV型菌毛进行荧光标记，并在显微镜下捕捉其运动，从而表征了由IV型菌毛驱动的抽搐运动。尽管这两种方法均能详细描述单个细菌的黏附力，但其实验流程复杂且耗时较长9,10。微流控腔室被用于观察单个细菌细胞以及小规模细菌聚集体的长距离迁移过程5,6。这些腔室设计为集成在培养板上的微加工纳米通道，并与延时成像记录系统相结合11,12,13,14。微流控腔室装置在研究细菌运动行为及细胞间相互作用方面具有多项优势：（i）提供具备多通道功能的集成化平台；（ii）可在纳米尺度上检测单个细胞的运动与聚集行为；（iii）支持对细菌细胞进行直接的显微成像记录及延时分析；（iv）可在微环境中对单个或群体细菌进行长期的空间与时间动态观察；（v）可精确控制通道内培养基的流速；（vi）每次实验仅需极少量（1 ml）的培养基。

近年来，微流控流动系统已被用于研究细菌细胞在不同微环境下的行为 14,15,16黏附性及表面附着能力 E. coli15, X. fastidiosa16，以及 Acidovorax citrulli14 使用微流控室评估了对玻璃表面的黏附。由IV型菌毛介导的聚集和生物膜形成 Acidovorax citrulli 进行了分析14此外，运动的 A. citrulli 在流动条件下观察发现，IV型菌毛可能在定植和扩散过程中发挥重要作用 A. citrulli 在汁液流动条件下木质部导管中的抽搐运动。 铜绿假单胞菌 和 X. fastidiosa 细胞在微加工流动室中的流体流动条件下被成功观察到5,6,17IV型菌毛缺陷 pilB 和 pilQ 突变体 X. fastidiosa 在微流控装置的流动条件下，显著改变了 twitching 运动的速度5,6,18在微流控装置中开展的关于细菌黏附与运动性的研究表明，微流控腔室特别适用于分析由菌毛介导的细菌的抽搐运动及迁移行为 体外这些结果阐明了由抽搐介导的迁移机制，该机制促进细胞间的附着、聚集以及在宿主内的定植，最终导致全身性感染。

Pil-Chp 操纵子 X. fastidiosa 含有 pilG、pilI、pilJ、pilL、chpB 和 chpC 编码信号转导通路20跨膜化学感受器在其周质结构域结合化学刺激，并在其胞内部分激活信号级联反应，从而最终调控细菌的抽搐运动。在Pil-Chp操纵子中 X. fastidiosa一种磷酸穿梭蛋白PilG是CheY的同源物。在 E. coli 和 P. aeruginosa CheY 是趋化系统中与鞭毛电机蛋白相互作用的反应调节蛋白19,21尽管Pil-Chp操纵子在毒力方面的贡献 X. fastidiosa 最近进行了检查20，其作用是 pilG 响应环境信号并调控运动型IV型菌毛的趋化性操纵子 X. fastidiosa 尚不明确。为了阐明趋化性调控因子的作用机制 pilG 在抽搐运动活性方面 X. fastidiosa，使用微流控室评估细菌的抽搐运动能力 X. fastidiosa。该 X. fastidiosa 的 pilG 具有以下特征通过比较缺失突变体的表型 XfΔpliG，互补菌株 XfΔpliG - C 及其野生型 体外结果强调了 pilG 在抽搐运动中 X. fastidiosa.

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方案

1. 细菌菌落的周边边缘

  1. 培养 X. fastidiosa (Xf) 特梅库拉野生型22, pilG 缺失突变体 XfΔpliG （采用先前描述的缺失策略）23），及其互补的 XfΔpliG- C（采用先前描述的基于染色体的遗传互补策略）24在PD2培养基琼脂平板上25 在28 °C下培养5-7天。
  2. 高压灭菌玻璃纸（1 x 1 cm）2在121 °C（249 °F）下将玻璃纸在水中灭菌15分钟。取出一片玻璃纸，用其一角轻触空的培养皿以沥干水分，小心地将玻璃纸覆盖在15%的琼脂表面，并自然风干。
  3. 挑取单个 X. fastidiosa 用无菌的圆头牙签挑取菌落，并将细胞无菌地点种到覆盖在琼脂平板含15%琼脂表面的灭菌玻璃纸片上。将平板在28 °C下培养2-3天。
  4. 使用解剖显微镜（物镜倍数为2X，目镜倍数为10X）观察菌落边缘形态。拍摄菌落周围边缘 fringe 的显微照片。

2. 显微镜与微流控流动腔

  1. 采用与先前所述类似的方法，通过光刻工艺制备微流控装置5,18使用计算机辅助设计软件，通过标准光刻方法在母硅片上设计四个平行通道26.
  2. 使用硅晶圆母模和聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备微流控腔室。将未聚合的PDMS浇注在硅晶圆母模上，在60 °C下固化1小时。将PDMS复制品从母模上剥离，并用刀片将其修剪成22 mm × 40 mm，尺寸与玻璃盖玻片相同。
  3. 暴露PDMS复制品和玻璃盖玻片（22 × 40 mm）2），以及一个显微镜载玻片（51 × 76 mm）2) 置于30 W空气等离子体中处理2分钟27将PDMS主体夹在玻璃盖玻片和玻璃显微镜载片之间，构建微流控腔室。
  4. 在PDMS上所制微通道的两端各钻一个直径为5.5 mm的孔。将硅橡胶管剪成12–20 cm长。将硅橡胶管（外径5.1 mm，内径2.1 mm，壁厚0.8 mm）的一端分别插入PDMS复制件微通道的每个开口端，并在60 °C下用未聚合的PDMS密封1小时。
  5. 将管路的另一端连接到塑料鲁尔接头的带刺端。用铝箔包裹组装好的微流控芯片，并在高压灭菌器中灭菌20分钟。
  6. 收集细菌细胞 X. fastidiosa 野生型，突变体 XfΔpliG，以及互补的 XfΔpliG- 用一次性接种环从PD2培养基平板上刮取细胞，悬浮于PD2液体培养基中，调整细胞密度至600 nm处的光密度值为0.05，具体操作如前所述。23将细菌细胞溶液收集到1 ml 气密注射器中。
  7. 将微流控装置安装在倒置显微镜载物台上。将进样管连接至装有PD2培养基的5 ml气密型注射器。将该5 ml气密型注射器安装到注射泵上。
  8. 将出口管连接至废液储槽。保持0.2 µl/min的中等流速。-1 30分钟以稳定系统。
  9. 将侧向进样管连接至含有细菌细胞溶液的1 ml 气密注射器。通过橡胶管将细菌细胞溶液冲洗至微流控通道，直至溶液到达通道位置。保持中等流速为0.2 µl/min。-1 再冲洗30分钟，以在成像前将未结合的细胞从腔室中彻底清除。
  10. 在显微镜的视场调节部分下方安装显微镜快门以控制光照。将快门连接至快门控制系统，并将快门控制系统连接至计算机。
  11. 将数码相机安装到显微镜的视频端口，并将其连接至计算机。运行延时摄影软件，选择 "快门" 从菜单中选择功能，软件将自动识别已安装的快门作为默认设置，并建立与快门的软件连接。
  12. 选择 "数码相机" 使用延时录像软件菜单中的功能，自动识别数码相机为软件中的默认采集设备，并通过该软件与数码相机建立通信。
  13. 使用20倍相差显微镜在其中一个通道中定位细菌细胞，然后在图像采集前切换至40倍物镜。
  14. 运行延时录像软件，选择 "图像采集" 使用菜单中的默认参数获取显微镜图像。接下来，打开 "获取延时图像" 功能并将时间间隔设置为 30 秒5,18,28 根据实验需要观察抽搐运动的时间，持续6-24小时 X. fastidiosa5,18,28. 点击 "好的" 开始延时录像。点击 "功能堆叠" 从菜单中选择 "另存为" 将图像堆叠保存至计算机的目标文件夹中，完成记录后。
  15. 对于多通道实验，每30秒从第一通道采集一次延时图像，持续6小时。随后移动显微镜物镜至下一通道，定位目标细胞。若实验设置包含四个通道，则重复上述延时成像步骤，依次在四个通道中采集图像。延时图像采集可连续进行最长三天。所有实验均在室温条件下（23 ± 2 °C）进行。
  16. 使用延时成像软件将延时图像合成为视频文件。运行延时成像软件，点击 "堆栈功能" 从菜单中选择 "开放堆栈功能" 从计算机中打开堆叠文件。
  17. 开始 "制作视频" 从堆栈模块中选择该函数，选中所有图像并选择 "AVI" 输出格式。点击 "另存为" 将视频文件存储到计算机的目标文件夹中。
  18. 从计算机的目标文件夹中选择已编译的视频文件并进行播放，然后通过生成的视频文件中细菌细胞抽搐运动活性的可视化结果，观察单个细胞的运动性。

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结果

在X. fastidiosa野生型及互补株XfΔpliG-C的菌落中，观察到外围菌落边缘存在表明IV型菌毛介导的抽搐运动的菌落 fringe 结构（图1）。然而，突变株XfΔpliG的菌落周围未出现边缘结构（图1）。利用纳米微流控流动腔室进行的延时成像显示，野生型X. fastidiosa和互补株XfΔpliG-C均表现出抽搐运动（补充视频 V1、V3），而XfΔpilG突变株细胞在整个实验过程中均未表现出抽搐运动（补充视频 V2）。XfΔpilG突变株细胞在PD2培养基中形成相对较小且松散的聚集体（补充视频 V2）。相比之下，X. fastidiosa野生型及互补株XfΔpilG-C在PD2培养基中则形成了更大的聚集体（图2，补充视频 V1、V3）。

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讨论

本研究表征了新设计的多平行纳米通道微流控腔室内X. fastidiosa PilG突变株XfΔpilG及其互补株XfΔpilG-C的运动行为。新设计的微流控腔室最多可包含四个平行腔室，纳米通道宽度为100 µm，而早期设计仅有一个50 µm宽的单通道18。改进后的更宽纳米通道有利于细菌细胞随培养基流动进入腔室。此外，该微流控腔室具有以下优点：1）结构简单，易于构建和组装；2）成本相对较低；3）可灵活适用于不同的实验需求。因此，该腔室设计可实现对细菌细胞在多种实验微环境中长期运动行为的观察。

在多种实验环境下观察细菌细胞运动性时，稳定微流控通道中的液体流动是构建完整流动微流控微环境的关键步骤。在引入细菌细胞之前，用培养基冲洗微流控腔室及连接管路，也是稳定腔室内流动的重要环节。然而，过高的流速会将细菌细胞冲出腔室，导致细胞无法滞留于其中。因此，需使用注射泵调节流经微流控通道的培养基流速至合适水平。在本研究的实验过程中，引入细菌细胞前，通过泵将流速设定并稳定在0.2至1 µl min-...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国农业部农业研究局提供支持。本出版物中提及的商标或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物学材料
X. fastidiosa (Xf) Temecula 野生型Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG 缺失突变体 XfΔpliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG 互补菌株 XfΔpliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
物理材料与设备
一次性接种环VWR international, Radnor, PA#22-363-607用于细菌收集等定量操作
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow Corning Corporation#0002709226Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒
AmScope MD2000 数码相机AmScope, Irvine, CASE305R-AZ-E图像、视频记录与测量 
导管管路Edgewood, NY#T4300连接注射器与微流控腔室
塑料鲁尔接头Edgewood, NY连接注射器与微流控腔室
注射泵Pico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209运行过程中可调节流速
注射器Gastight, Hemilton Company, Reno, NV#1005提供流动的培养基
倒置 Olympus IMT-2 显微镜OlympusIMT-2 FLuoro PHase图像观察与记录
SPOT-RT 数码相机Diagnostic Instruments, Inc., MIRT230图像、视频记录与测量
显微镜快门The UNIBLITZ, US#LS2T2控制相机’s 曝光时间
显微镜快门控制系统The UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 单通道 CE/UL/CSA 认证快门驱动器
MetaMorph 图像软件Universal Imaging Corp., PA实时超分辨率图像处理 

参考文献

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