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方法文章

发现小鼠Bcrp1基因替代启动子使用及转录调控的方法

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DOI：

10.3791/53827

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2016年5月27日

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1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 3Baltimore VA Medical Center, 4Membrane Transport and Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 5Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science, University of Pittsburgh, 6Magee Women's Research Institute, 7Obstetrics, Gynecology, Perinatal Research Branch (NICHD), Wayne State University School of Medicine, 8Medicine, University of Maryland School of Medicine, 9Pathology, University of Maryland School of Medicine, 10Pharmacology, University of Maryland School of Medicine, 11Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine

本文内容

摘要

以小鼠ABC转运蛋白Bcrp1（Abcg2）为例，本文介绍了利用in-silico方法分析在小鼠组织中表达的基因的可变启动子使用情况的流程，并通过报告基因检测方法评估所鉴定出的可变启动子的功能活性。

摘要

不同组织中的基因表达通常由替代性启动子调控，这些启动子可产生具有独特——通常是非翻译区——首外显子的mRNA。Bcrp1（Abcg2）是ABC转运蛋白乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）的小鼠同源基因，至少具有四个替代性启动子，分别以其对应的四个替代性首外显子命名：E1U、E1A、E1B和E1C。本文介绍了利用in-silico方法预测Bcrp1基因替代性启动子使用的流程。此外，还描述了报告基因检测方法，用于构建针对替代性启动子的报告基因载体，并验证在已鉴定的替代性首外显子上游区域中潜在启动子的功能活性。

引言

超过一半的人类基因受到替代启动子的调控1。每个替代启动子可能包含不同于其他替代启动子的调控元件。在一种组织中使用的启动子可能与在另一种组织中使用的启动子不同。例如，激活特定信号通路可能会触发某一组织中某个基因所使用的替代启动子，但对另一组织中同一基因所使用的另一个替代启动子则可能无影响或产生抑制作用。

Bcrp1 基因的表达受多个替代启动子调控。Bcrp1 是人类乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein, BCRP）基因的小鼠同源物。BCRP 属于 ATP 结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族，正式命名为 ABCG22,3。作为一种位于细胞顶膜的膜蛋白，BCRP/Bcrp1 可介导多种内源性和外源性底物的外排3,4。在人类和小鼠中，BCRP/Bcrp1 在具有重要药理学意义的器官中高度表达，例如肝脏（胆小管）、肠道和肾脏，同时也高表达于具有血液-组织屏障的器官，如胎盘、大脑和睾丸2,5-12。BCRP/Bcrp1 在造血干细胞及其他干细胞（包括肿瘤干细胞）中的表达，可能赋予这些细胞对外源性物质及抗癌化疗药物的耐药性3。

在早期研究正常细胞和肿瘤细胞中BCRP表达调控的工作中，对BCRP mRNA进行了5'端cDNA末端快速扩增（5'-RACE）分析，以确定其精确的转录起始位点13不仅发现了多个转录起始位点，还检测到第一外显子的三种可变形式，这些可变的第一外显子在BCRP中属于非翻译区。这些被命名为E1a、E1b和E1c的可变第一外显子在多种人体组织中表现出不同的表达模式。通过使用BCRP的第二外显子对人类EST数据库进行BLAST搜索，还发现了另外两种第一外显子的变异形式。13. 四个匹配结果显示了第一个外显子 >位于外显子2上游70 kb处，被命名为E1u；另外四个匹配结果显示BCRP mRNA完全缺失第一外显子，被命名为E1-13. 选择性启动子的使用被认为表现为存在可变的5'端外显子14.

在小鼠中，已报道Bcrp1存在四个可变的第一外显子，这些外显子可能对应于调控其表达的可变启动子 Bcrp1 在不同小鼠组织中的转录；这些外显子/启动子被命名为 E1U、E1A、E1B 和 E1C，分别位于 Bcrp1 外显子 2 上游约 70、58、15 和 5 kb 处5,15E1A mRNA 亚型在小鼠造血干细胞、心脏、肺、脾脏和脑组织中占主导地位，而 E1B 亚型则在小鼠肠道、胎肝细胞以及骨髓中的红系前体细胞中表达。5,15. 位于E1B上游的启动子被证实是调控小鼠肠道中Bcrp1转录的主要替代启动子，其调控至少部分依赖于磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）以及该替代性Bcrp1启动子所特有的CREB反应元件16E1C mRNA 亚型主要在成年小鼠的肝脏和肾脏中表达5E1U 亚型在大多数检测组织中均无法检出，仅在小鼠睾丸中可检测到，且为该组织中主要表达的亚型5在大鼠睾丸中表达的 Bcrp1 存在于体细胞（血管内皮紧密连接、管周肌样细胞和塞尔托利细胞）和生殖细胞（位于生精小管上皮，可能对晚期精子细胞具有保护作用）中4E1U上游区域含有类固醇生成因子-1（SF-1）的功能性反应元件5. Bcrp1 mRNA 和蛋白在支持细胞特异性 SF-1 敲除小鼠的睾丸中显著减少，提示小鼠支持细胞中 Bcrp1 的表达受 SF-1 调控5.

所介绍的实验方案详细描述了检测 Bcrp1 基因可变第一外显子的方法 计算机模拟，并建立基于荧光素酶的报告基因检测方法，用于鉴定位于替代性第一外显子上游的潜在启动子。

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方案

1. 利用小鼠 EST 数据库的 BLAST 分析对 Bcrp1 基因的替代性第一外显子进行in silico预测

注意：本实验方案描述了如何搜索小鼠表达序列标签（EST）数据库，以寻找与Bcrp1基因第2外显子（包含翻译起始位点）具有序列相似性的EST，并进一步将匹配的EST序列与基因组序列进行比对，从而确定这些EST在小鼠Bcrp1基因中的位置，相对于Bcrp1第2外显子5'端的位置。

  1. 通过在 Ensembl 基因组浏览器的搜索窗口中输入小鼠 Bcrp1 外显子 2 的 mRNA 参考序列编号（NM_011920.3）获取该序列17，点击 "GO" 在下一个界面中，选择一个全长序列（包含16个外显子）：
    1. 在下一个界面中（"基于转录本的展示"），选择 "16个外显子" 这将显示包含 Bcrp1 所有外显子序列的界面。Bcrp1 的第 2 外显子序列为 "5'-AAAGGC…TATCAA-3'" 所得结果将与参考文献中所示结果相似 18.
    2. 点击 "下载序列" 选项。在下一个界面中，选择 FASTA 格式，然后点击 "预览。" 在下一个界面中，将外显子2的预览序列复制到剪贴板。
  2. 进入 BLAST 主页19 在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上20.
    1. 选择 "小鼠" 基因组。将外显子2序列从剪贴板粘贴到查询框中。
    2. 选择 "表达序列标签" 从数据库下拉菜单中，优化以 "高度相似的序列，" 然后选择 "BLAST" 运行时间需要几分钟。当BLAST运行完成后， "结果" 页面将出现。
    3. 在……之下 "描述" 小标题 "结果" 页面，选择 "急性淋巴细胞白血病" 然后 "下载，" 然后 "FASTA（完整序列）" 在下拉菜单中，然后选择 "继续。" 将出现一个 .txt 文件；打开并复制整个文件内容到剪贴板。该 .txt 文件包含所有与小鼠 Bcrp1 外显子 2 具有高序列相似性的 EST 序列，但不包含这些序列在 Bcrp1 基因中外显子 2 相对位置的信息。
      注意：2015年4月15日进行的一项分析鉴定出14条与Bcrp1外显子2比对上的小鼠EST序列。这些序列列于 表1.
  3. 确定位于 Bcrp1 基因第2个外显子5'端的EST序列位置。小鼠 Bcrp1 基因位于染色体6的contig NC_000072.6（GI:372099104）上。
    1. 在BLAST主页的下方 "特化的爆炸" 小标题，选择 "使用 BLAST（bl2seq）比对两个（或多个）序列。"
    2. 将剪贴板中的文本文件粘贴到查询框中，并在“主题序列”框内输入 372099104。优化以 "高度相似序列" 在程序选择下运行BLAST。
    3. 结果窗口出现后，通过点击查看比对的图形化结果 "图形" 在 "序列比对" 窗口。使用左右箭头并缩放以聚焦于 Bcrp1/Abcg2 及其序列比对。
    4. 保存序列比对结果：选择 "急性淋巴细胞白血病" 在 "描述" 盒，然后在下方的 "下载" 下拉选择 "命中表（CSV），" 然后点击 "继续。" 该文件包含 Bcrp1 外显子 2 的序列比对结果，以及所有与 Bcrp1 外显子 2 具有序列相似性的 EST 序列相对于小鼠 6 号染色体 contig 核苷酸编号的比对结果。每条完整的 EST 序列可能产生多个比对结果，覆盖外显子 2 的 5' 和 3' 区域，包括与 Bcrp1 外显子 2 重叠的序列。
    5. 由于外显子2的5'端位置对应于6号染色体contig的第58,655,638位核苷酸，因此将该位置指定为+1，然后计算各EST序列5'端位于58,655,638之前的片段位置。14条EST的结果如下所示 表1.
      注意：务必仔细分析位于 +1 位点 5' 端的 EST 序列即，具有负的核苷酸值）作为潜在的第一个外显子。例如，在两条与所示Bcrp1外显子2比对上的EST中 表1 （AI647825 和 AI664571）其余序列位于第2个外显子的3'端。

2. Bcrp1 替代启动子功能的评估

  1. Bcrp1 E1U、E1A、E1B 和 E1C 启动子报告基因载体的构建设计
    1. 根据从 EST 数据库中获得的 E1U 序列，将 E1U 的第一个 5' 核苷酸指定为 +1。
    2. 获取包含小鼠6号染色体上Bcrp1/Abcg2基因序列及其上游至少100 kb序列的细菌人工染色体（BAC）克隆（参见材料与设备清单）。
      1. 选择一种合适的报告基因载体，例如荧光素酶报告基因质粒 pGL3-Basic。
      2. 确定报告载体中的多克隆位点。在pGL3-Basic载体的多克隆位点中，按5'至3'方向依次为KpnI、SacI、MluI、NheI、SmaI、XhoI、BglII和HindIII限制性内切酶位点。
        注：限制性内切酶消化位点的序列可从生产该酶的公司产品目录中获得。
      3. 使用DNA5等软件程序鉴定E1U外显子及E1U上游5'端2 kb区域内的所有酶切位点。在pGL3-Basic载体的多克隆位点中鉴定至少两个未出现在E1U或其上游2 kb区域内的酶切位点。
        注意：选择正向引物的多克隆位点限制性酶切位点时，应确保其位于反向引物所选酶切位点的上游，以保证插入片段的正确方向。
    3. 准备用于PCR的正向和反向引物，引物中应包含针对所选pGL3-basic载体多克隆位点限制性内切酶识别序列的序列，可通过商业基因/引物合成服务或引物设计软件完成（见材料与设备列表）。选择一个位于E1U序列上游约2 kb处的正向引物，以及一个位于E1U序列内部的反向引物。作者在先前研究中使用的引物在正向引物中引入了SacI酶切位点，在反向引物中引入了NheI酶切位点，扩增的基因组区域约为−1,906至+64（以E1U序列的第一个5'核苷酸定义为+1，见上述步骤2.1.1），相关引物信息参见参考文献 16.
      1. 使用这些引物、0.01至1 µg的BAC以及含有高保真DNA聚合酶的PCR预混液，对E1U基因组区域进行PCR扩增 Taq 聚合酶（见材料与设备清单），95 °C 变性 30 秒，随后进行 35 至 40 个 PCR 循环，72 °C 延伸（2 分钟），退火和变性温度根据所用引物的熔解特性设定。
        注意：高保真酶的使用 Taq 聚合酶对于测序高GC含量的启动子区域至关重要。当使用较大的基因组DNA片段（如BAC）作为模板时，基因组DNA的二级结构可能会阻碍PCR引物的结合。如果出现这一问题，可在PCR反应前通过超声处理轻柔剪切长片段基因组DNA模板，以获得更佳的PCR结果。
      2. 通过使用0.8% TAE琼脂糖凝胶电泳，并与1 kb DNA ladders比较，验证扩增的PCR产物长度。
    4. 使用限制性内切酶对获得的PCR产物和pGL3-Basic载体进行酶切消化，所用酶应针对正向和反向引物中引入的限制性酶切位点，并按照限制性内切酶产品说明书提供的条件操作。
      1. 使用市售 SV 凝胶和 PCR 纯化系统试剂盒（见材料与设备列表），按照试剂盒说明书纯化消化反应产物21.
        1. 通过琼脂糖凝胶电泳将载体与未切割的载体进行比较，以验证其消化和线性化，随后切下并纯化已消化的载体DNA条带。使用紫外分光光度法测定纯化的PCR产物和纯化载体的浓度（参见材料与设备列表）。
    5. 通过连接纯化的、经限制性内切酶消化的PCR产物与pGL3-Basic萤光素酶报告载体（包含于报告基因检测试剂盒中；见材料与设备列表），按照插入片段:载体比例为11、21和31进行E1U报告构建体的制备，使用 "T4 DNA连接酶快速连接试剂盒" 按照试剂盒说明书操作22，从而构建出E1U报告基因质粒，命名为pGL3-E1U。
      1. 使用pGL3-E1U质粒按照TA克隆试剂盒说明书（见材料与设备列表）转化细菌，以实现pGL3-E1U的克隆扩增。
      2. 通过序列分析确认插入片段的方向性和保真度。
    6. 使用与E1U相同的方法制备E1A、E1B和E1C的报告基因构建体。通过2.1.5.2节所述的测序方法确认插入片段的准确性。
      注意：E1A、E1B 和 E1C 的启动子插入片段应分别约为相对于 E1A、E1B 或 E1C 的第一个 5' 核苷酸（指定为 +1）的 −1,875/+10、−1,847/+60 和 −1,904/+83。
  2. 报告基因检测方法
    注意：报告基因检测的一般策略：将某基因的假定启动子（5'上游区域）插入空载体的多克隆位点 "报告基因" 含有以下成分的载体 "报告基因" (例如，在多克隆位点下游插入萤光素酶（firefly luciferase）。随后将该载体转染至表达目的基因的真核细胞中。在这些细胞中促进目的基因表达的反式作用因子应能激活转染报告载体中的启动子，从而驱动萤光素酶（firefly luciferase）的表达，其表达水平可通过发光检测法进行定量分析。
    1. 选择适用于报告基因检测的适当细胞系。
      注意：为了评估E1U替代启动子报告基因构建体的活性，必须将该构建体转染至表达由E1U启动子调控的Bcrp1的细胞中。小鼠Sertoli细胞系TM4（见材料与设备清单）表达Bcrp1蛋白以及包含E1U的Bcrp1 mRNA，同时也表达E1A、E1B和E1C5作为阴性对照，可考虑使用不表达 Bcrp1 蛋白或 mRNA 的细胞系。
    2. 在24孔板中培养TM4细胞，初始密度为每孔200,000个细胞，培养基为Ham's F12培养基与Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）等体积混合液，含1.2 g/L碳酸氢钠、15 mM HEPES，并补充5%马血清、2.5%胎牛血清、青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 µg/ml），于37 °C、5% CO₂条件下培养2，如先前所述5.
    3. 细胞接种培养6小时后，使用0.2 µg空pGL3-基础载体或含有−1,906/+64 E1U、−1,875/+10 E1A、−1,847/+60 E1B或−1,904/+83 E1C的0.2 µg pGL3载体进行转染 Bcrp1 缺失构建体以及 4 ng pRL-TK（一种 海肾 荧光素酶表达载体）作为内参对照，使用商用DNA转染试剂盒并按照生产商的说明书进行操作23 （参见材料与设备清单）。
    4. 转染后30小时，从培养的转染细胞中移除生长培养基。用200 µl PBS洗涤细胞一次，然后移除洗涤液。
      1. 测量萤光素酶和 海肾 使用商业试剂盒，按照制造商的说明书检测荧光素酶活性24.
    5. 将每根试管的活性表示为萤火虫荧光素酶活性与内参（海肾 荧光素酶）对照；总体结果通常表示为每种报告基因构建体相对于转染空载体pGL3 basic的细胞的活性，后者被设定为1。

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结果

通过分析前导外显子鉴定小鼠睾丸中 Bcrp1 替代启动子的利用

当使用方案1中所述步骤在NCBI的EST数据库中进行检索（2015年4月）时，发现了一些与Bcrp1 mRNA第2外显子5'端连续的EST序列，其在基因组DNA中相对于第2外显子起始位置的定位如表1所示。其中一条来源于C57BL/6J小鼠睾丸的EST序列，在基因组DNA中位于第2外显子上游70 kb处，并与Bcrp1 mRNA中的第2外显子相连，对应于E1U（表1）。类似地，还检测到了对应于E1A、E1B和E1C的EST序列。值得注意的是，两条对应于E1C的EST序列还包含E1B与E1C的5'端发生剪接的结构。这些预测的首个外显子在小鼠6号染色体上相对于Bcrp1第2外显子的位置关系如图1

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讨论

大多数方法和代表性结果已在2013年发表的先前研究中描述，该研究题为"Bcrp1在小鼠睾丸中的转录受位于一个新型第一外显子（E1U）上游的启动子调控，该启动子由类固醇生成因子-1调控"5。除了本文所示的代表性结果外，先前的研究还利用5'-RACE PCR和RT-PCR方法估算了替代性第一外显子的使用情况。此外，通过in-silico分析鉴定了E1U上游启动子区中一个假定的SF-1反应元件，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实SF-1能够结合该假定的SF-1反应元件。功能研究表明，在小鼠支持细胞中，Bcrp1的转录通过E1U启动子中的SF-1反应元件受到SF-1的调控。这些功能研究包括通过转染或使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（伏立诺他）在TM4细胞中上调SF-1的表达，结果导致Bcrp1 E1U mRNA表达增强，以及Bcrp1蛋白水平升高，并在报告基因检测中观察到Bcrp1 E1U启动子活性增加。最后，这些研究提供了证据表...

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披露

Douglas D. Ross 和马里兰大学巴尔的摩分校拥有人类 BCRP 的专利权。

致谢

本工作获得了美国退伍军人事务部授予 Douglas D. Ross 和 Arif Hussain 的优异评审奖支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
商用生物材料与试剂盒：
First Choice RLM-RACE试剂盒Ambion Inc., Austin, TX，现可通过Life Technologies获取AM17005'-RACE PCR试剂盒
TOPO TA克隆试剂盒Life TechnologiesK450001该试剂盒包含TOP10化学感受态E. coli细菌。
T4 DNA连接酶快速连接试剂盒New England BiolabsM2200
Faststart高保真Taq DNA聚合酶Sigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 包含高保真Taq聚合酶酶混合物
XtremeGENE HP DNA转染试剂Roche6366236001
双荧光素酶报告基因检测试剂盒PromegaE1910包含pGL3-basic空载体（萤火虫荧光素酶）、pRLTK海肾荧光素酶表达载体及其他对照载体。
QIAprepQiagen27104用于质粒小量提取——从细菌菌落中分离和纯化质粒DNA
pCR2.1载体TOPO TA克隆试剂盒的组成部分
含萤火虫荧光素酶的pGL3-basic载体PromegaE1751
pRL-TK海肾荧光素酶表达载体PromegaE2241
细菌人工染色体BACPAC资源中心，Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CARP23-285A12 和 RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
试剂/化学品/培养基/耗材
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard® SV凝胶与PCR产物纯化系统 PromegaA9281适用于限制性内切酶消化后PCR产物的纯化
CRYOVIALSDenville ScientificV9012
软件：
Ensembl软件Ensembl项目http://Ensembl.org Ensembl项目为脊椎动物及其他真核生物提供基因组数据库，并在线免费提供这些信息。
Blast软件NCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3软件Simgenehttp://simgene.com/Primer3适用于设计5'-RACE PCR引物
NCBI核苷酸数据库NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
细胞系：
TM4小鼠Sertoli细胞ATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715™
仪器：
发光仪Turner BiosystemsTD-20/20这是一种相对便宜的手动操作发光仪。同一制造商也提供使用96孔板的自动化系统。
NanoDrop分光光度计Thermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000分光光度计可使用极少量样品
DU 800 UV/VIS分光光度计及核酸分析II软件BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CADU 800

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