发现小鼠Bcrp1基因替代启动子使用及转录调控的方法

摘要

以小鼠ABC转运蛋白Bcrp1（Abcg2）为例，本文介绍了利用in-silico方法分析在小鼠组织中表达的基因的可变启动子使用情况的流程，并通过报告基因检测方法评估所鉴定出的可变启动子的功能活性。

摘要

不同组织中的基因表达通常由替代性启动子调控，这些启动子可产生具有独特——通常是非翻译区——首外显子的mRNA。Bcrp1（Abcg2）是ABC转运蛋白乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）的小鼠同源基因，至少具有四个替代性启动子，分别以其对应的四个替代性首外显子命名：E1U、E1A、E1B和E1C。本文介绍了利用in-silico方法预测Bcrp1基因替代性启动子使用的流程。此外，还描述了报告基因检测方法，用于构建针对替代性启动子的报告基因载体，并验证在已鉴定的替代性首外显子上游区域中潜在启动子的功能活性。

引言

超过一半的人类基因受到替代启动子的调控¹。每个替代启动子可能包含不同于其他替代启动子的调控元件。在一种组织中使用的启动子可能与在另一种组织中使用的启动子不同。例如，激活特定信号通路可能会触发某一组织中某个基因所使用的替代启动子，但对另一组织中同一基因所使用的另一个替代启动子则可能无影响或产生抑制作用。

Bcrp1 基因的表达受多个替代启动子调控。Bcrp1 是人类乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein, BCRP）基因的小鼠同源物。BCRP 属于 ATP 结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族，正式命名为 ABCG2^2,3。作为一种位于细胞顶膜的膜蛋白，BCRP/Bcrp1 可介导多种内源性和外源性底物的外排^3,4。在人类和小鼠中，BCRP/Bcrp1 在具有重要药理学意义的器官中高度表达，例如肝脏（胆小管）、肠道和肾脏，同时也高表达于具有血液-组织屏障的器官，如胎盘、大脑和睾丸^2,5-12。BCRP/Bcrp1 在造血干细胞及其他干细胞（包括肿瘤干细胞）中的表达，可能赋予这些细胞对外源性物质及抗癌化疗药物的耐药性³。<....

方案

1. 利用小鼠 EST 数据库的 BLAST 分析对 Bcrp1 基因的替代性第一外显子进行in silico预测

注意：本实验方案描述了如何搜索小鼠表达序列标签（EST）数据库，以寻找与Bcrp1基因第2外显子（包含翻译起始位点）具有序列相似性的EST，并进一步将匹配的EST序列与基因组序列进行比对，从而确定这些EST在小鼠Bcrp1基因中的位置，相对于Bcrp1第2外显子5'端的位置。

1. 通过在 Ensembl 基因组浏览器的搜索窗口中输入小鼠 Bcrp1 外显子 2 的 mRNA 参考序列编号（NM_011920.3）获取该序列¹⁷，点击 "GO" 在下一个界面中，选择一个全长序列（包含16个外显子）：
   1. 在下一个界面中（"基于转录本的展示"），选择 "16个外显子" 这将显示包含 Bcrp1 所有外显子序列的界面。Bcrp1 的第 2 外显子序列为 "5'-AAAGGC…TATCAA-3'" 所得结果将与参考文献中所示结果相似 ¹⁸.
   2. 点击 "下载序列" 选项。在下一个界面中，选择 FASTA 格式，然后点击 "预览。" 在下一个界面中，将外显子2的预览序列复制到剪贴板。
2. 进入 BLAST 主页

结果

通过分析前导外显子鉴定小鼠睾丸中 Bcrp1 替代启动子的利用

当使用方案1中所述步骤在NCBI的EST数据库中进行检索（2015年4月）时，发现了一些与Bcrp1 mRNA第2外显子5'端连续的EST序列，其在基因组DNA中相对于第2外显子起始位置的定位如表1所示。其中一条来源于C57BL/6J小鼠睾丸的EST序列，在基因组DNA中位于第2外显子上游70 kb处，并与Bcrp1 mRNA中的第2外显子相连，对应于E1U（表1）。类似地，还检测到了对应于E1A、E1B和E1C的EST序列。值得注意的是，两条对应于E1C的EST序列还包含E1B与E1C的5'端发生剪接的结构。这些预测的首个外显子在小鼠6号染色体上相对于Bcrp1第2外显子的位置关系如图1

讨论

大多数方法和代表性结果已在2013年发表的先前研究中描述，该研究题为"Bcrp1在小鼠睾丸中的转录受位于一个新型第一外显子（E1U）上游的启动子调控，该启动子由类固醇生成因子-1调控"⁵。除了本文所示的代表性结果外，先前的研究还利用5'-RACE PCR和RT-PCR方法估算了替代性第一外显子的使用情况。此外，通过in-silico分析鉴定了E1U上游启动子区中一个假定的SF-1反应元件，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实SF-1能够结合该假定的SF-1反应元件。功能研究表明，在小鼠支持细胞中，Bcrp1的转录通过E1U启动子中的SF-1反应元件受到SF-1的调控。这些功能研究包括通过转染或使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（伏立诺他）在TM4细胞中上调SF-1的表达，结果导致Bcrp1 E1U mRNA表达增强，以及Bcrp1蛋白水平升高，并在报告基因检测中观察到Bcrp1 E1U启动子活性增加。最后，这些研究提供了证据表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
商用生物材料与试剂盒：
First Choice RLM-RACE试剂盒	Ambion Inc., Austin, TX，现可通过Life Technologies获取	AM1700	5'-RACE PCR试剂盒
TOPO TA克隆试剂盒	Life Technologies	K450001	该试剂盒包含TOP10化学感受态E. coli细菌。
T4 DNA连接酶快速连接试剂盒	New England Biolabs	M2200
Faststart高保真Taq DNA聚合酶	Sigma-Aldrich/Roche	3553400001/RMB-4738284001	包含高保真Taq聚合酶酶混合物
XtremeGENE HP DNA转染试剂	Roche	6366236001
双荧光素酶报告基因检测试剂盒	Promega	E1910	包含pGL3-basic空载体（萤火虫荧光素酶）、pRLTK海肾荧光素酶表达载体及其他对照载体。
QIAprep	Qiagen	27104	用于质粒小量提取——从细菌菌落中分离和纯化质粒DNA
pCR2.1载体	TOPO TA克隆试剂盒的组成部分
含萤火虫荧光素酶的pGL3-basic载体	Promega	E1751
pRL-TK海肾荧光素酶表达载体	Promega	E2241
细菌人工染色体	BACPAC资源中心，Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA	RP23-285A12 和 RP24-314E24	http://bacpac.chori.org/clones.htm
试剂/化学品/培养基/耗材
TRIzol	Life Technologies	15596026
Wizard® SV凝胶与PCR产物纯化系统	Promega	A9281	适用于限制性内切酶消化后PCR产物的纯化
CRYOVIALS	Denville Scientific	V9012
软件：
Ensembl软件	Ensembl项目	http://Ensembl.org	Ensembl项目为脊椎动物及其他真核生物提供基因组数据库，并在线免费提供这些信息。
Blast软件	NCBI	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3软件	Simgene	http://simgene.com/Primer3	适用于设计5'-RACE PCR引物
NCBI核苷酸数据库	NCBI	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
细胞系：
TM4小鼠Sertoli细胞	ATCC, Manassas, Virginia	CRL-1715™
仪器：
发光仪	Turner Biosystems	TD-20/20	这是一种相对便宜的手动操作发光仪。同一制造商也提供使用96孔板的自动化系统。
NanoDrop分光光度计	Thermo Scientific, Inc.	NanoDrop 2000	分光光度计可使用极少量样品
DU 800 UV/VIS分光光度计及核酸分析II软件	BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA	DU 800