需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

10.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53900

⸱

2016年5月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了利用商业化的外泌体分离试剂盒，结合蛋白酶K和RNase处理，从非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中释放的外泌体进行miRNA谱分析的可行性，以避免游离miRNA的污染，并评估其在NSCLC中的生物标志物特征。

摘要

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，包括 EGFR 和 ALK 基因在内的多种基因变异的发现，推动了使用选择性酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）进行靶向药物治疗的发展。为了优化这些 TKIs 的应用，发现用于早期检测和疾病进展监测的新生物标志物至关重要。这些从血浆中分离的外泌体可作为无创且可重复的方法，用于检测和随访这些生物标志物。本研究使用了来自12例具有不同突变和治疗方案的非小细胞肺癌患者（另加6名健康供体作为对照）的1 ml 血浆作为外泌体来源。为降解游离循环miRNA，样本先经RNA酶处理，随后使用商用试剂盒分离外泌体，并重悬于特定缓冲液中以进行后续分析。通过蛋白免疫印迹法检测ALIX和TSG101，以及通过透射电子显微镜（TEM）分析对外泌体进行表征，这是获取这些纳米囊泡生化和尺寸信息的标准技术。总RNA提取采用高得率的商用试剂盒完成。由于外泌体中miRNA含量有限，我们决定采用针对每个选定miRNA的独立引物进行逆转录PCR。利用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）极高的灵敏度和特异性，分析了一组与非小细胞肺癌相关的miRNA（30b、30c、103、122、195、203、221、222）；以mir-1228-3p作为内参对照，数据按照公式 2-ΔΔct 13 进行处理。对照组数值作为基线，结果以对数尺度表示。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）患者的低生存率主要归因于晚期疾病治疗效果有限以及早期检测手段不足1。在部分NSCLC患者亚群中发现的EGFR基因激活突变，已被证实可使肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）敏感。然而，大多数携带EGFR突变的NSCLC患者最终会发展出对TKIs的耐药性2。尤其在这一背景下，准确的诊断至关重要。通常由于肿瘤位置的原因，获取NSCLC患者的活检组织并不总是可行。因此，目前已有多项研究正在探索利用无创方法获取这些生物学信息。外泌体被视为液体活检的组成部分，可通过无创技术进行检测，以获得具有诊断和预后价值的信息3。

外泌体是一类起源于内吞作用的纳米囊泡（直径为40 - 100 nm），在生理和病理条件下可由多种细胞类型释放4。外泌体可携带蛋白质、脂质、mRNA和微小RNA。此外，多项研究表明，肿瘤来源的外泌体具有多效性功能，能够影响肿瘤细胞的生长与存活、血管生成、基质及细胞外基质重塑以及药物耐药性5。

微小RNA（miRNAs）是一类短的非编码RNA，参与转录后调控，通过与靶标mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。6已有关于miRNA选择性分选进入外泌体的报道。在此背景下，最近的研究表明， 体外 和 体内姜黄素处理后慢性髓系白血病细胞系释放的外泌体中miR-21（一种具有致癌作用的知名miRNA）的选择性包装7.

外泌体miRNA谱与原发性肿瘤的miRNA谱相似，这一特性可用于早期诊断和预后评估3具体而言，可以通过实时PCR对与疾病分子特征相关的特定miRNA进行表征， 例如，以及其他EGFR突变8.

本文描述了对一组选定的与非小细胞肺癌（NSCLC）相关的miRNA8-9的分析，这些miRNA是从NSCLC患者血液中释放的外泌体中分离得到的。在获得患者的知情同意报告后，对12名NSCLC患者和6名健康对照者的血浆样本进行了分析。外泌体的分离采用商业试剂盒，并按照制造商提供的操作说明进行。在外泌体分离之前，血浆样本经RNA酶处理，以降解可能污染的循环游离miRNA。我们选择使用商业试剂盒进行该分析，是因为其他技术（例如，超速离心法）的标准化程度有限，而在处理临床样本时，标准化尤为重要。该试剂盒包含蛋白酶K处理步骤，可降解RNA酶，从而在外泌体裂解后降低外泌体miRNA被降解的风险。microRNA的分析采用高灵敏度和特异性的实时PCR方法；以mir-1228-3p作为内参对照，数据根据公式2-ΔΔct进行归一化处理。以对照组数值作为基线，结果以对数尺度表示。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 外泌体分离

注意：根据制造商提供的方案，并结合RNA酶处理步骤，使用商业试剂盒从血浆样本中分离外泌体（所有这些步骤都必须在佩戴个人和环境防护设备的情况下进行，并遵循操作生物样本的特定法律程序）。

  1. 取每份储存于 -80 °C 的 1 ml 血浆样品，置于冰上。
  2. 在室温下以 2,000 × g 离心 20 分钟 ；此步骤为必需操作，旨在去除细胞和碎片。
  3. 将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。
  4. 将新管在室温下以 10,000 × g 离心 20 分钟 。
  5. 将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。
  6. 向上清液中加入 100 ng/ml 的 RNAse，并在 37 °C 孵育 10 分钟 ，以降解循环游离的 RNA。
  7. 将所有处理后的血浆转移至新的 2 ml 离心管中，并加入 0.5 倍体积的 1x PBS。
  8. 涡旋震荡样品，以充分混匀溶液。
  9. 向样品中加入 0.05 倍体积的 Proteinase K 溶液（试剂盒提供）。
  10. 涡旋震荡样品，随后在 37 °C 孵育 10 分钟。
  11. 向样品中加入 0.2 倍体积的外泌体沉淀缓冲液，并通过倒置混匀溶液。
  12. 将样品在 2 °C 至 8 °C 孵育 30 分钟 ，然后在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟 。
  13. 吸除并弃去上清液。沉淀物即为分离得到的外泌体。
  14. 加入选定的缓冲液以重悬外泌体沉淀。缓冲液的选择取决于后续分析方案，具体如下：
    1. 加入 100 µl 的 1x PBS，用于进行透射电子显微镜（TEM）分析。
    2. 加入 346.5 µl 用于 RNA 提取的特异性裂解缓冲液（来自商业试剂盒）（注意：存在化学危害）。
    3. 加入 100 µl 用于蛋白质提取的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6 - 300 mM NaCl - 0.5% Triton X-100 - 1 mM PMSF - 10 µg/ml Leupeptin/Aprotinin），用于进行 Western Blotting 分析。（注意：存在化学危害）。
  15. 将重悬后的外泌体储存于 −20 °C。

2. 通过蛋白质印迹分析对外泌体进行表征

注意：为了表征分离得到的纳米囊泡，建议使用针对 ALIX 和 TSG101 的抗体进行蛋白质印迹分析（这两种蛋白是公认的外泌体标志物）。

  1. 将外泌体沉淀重悬于裂解缓冲液中后，置于冰上1小时，以溶解外泌体膜。
  2. 将裂解物在12,000 g离心10分钟 ，并将上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。
  3. 通过Bradford法或其他方法定量总外泌体蛋白含量，并在Tris/Glycine SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶中每孔上样50 µg蛋白。（注意：化学品危害）。
  4. 使用电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS）在8% SDS-PAGE凝胶中以120 V恒压电泳1小时30分钟 ，分离蛋白质及适当分子量标记物。（注意：化学品危害）。
  5. 使用4 °C预冷的转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇），以50 V恒压电转印1小时，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。（注意：化学品危害）。
  6. 用含5%脱脂奶粉的1×TBS-Tween 0.1%缓冲液，在缓慢振荡条件下封闭膜1小时。
  7. 用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜4次，每次5分钟 。
  8. 根据抗体说明书推荐的缓冲液，分别加入针对ALIX和TSG101的一抗（每张膜一种抗体），并在缓慢振荡条件下孵育过夜 。
  9. 用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜5次，每次5分钟 ，以去除未结合的一抗。
  10. 根据抗体说明书推荐的缓冲液，加入相应的二抗，并在缓慢振荡条件下孵育1小时。
  11. 用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜5次，每次5分钟 ，以去除未结合的二抗。
  12. 通过化学发光分析检测目标蛋白11。

3. 通过透射电子显微镜分析对外泌体进行表征

注意：为了观察分离的外泌体，进行了透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）分析。

  1. 放置  ~10 µ将已通过Bradford法预先定量的完整外泌体样本，用1×PBS重悬后取g量置于parafilm上，再将铜镍载网（表面覆有Formvar碳膜）放置于液滴上孵育1小时。
  2. 将载网在3个40 μL的溶液上各放置一次，洗涤3次 µ1× PBS 滴加液
  3. 将载网置于5个30 μL的液滴上，每个液滴洗涤一次，共洗涤5次 µl 超纯水滴。
  4. 加入一滴2.5%戊二醛（注意：化学品危险）固定样品，孵育10分钟。
  5. 将载网在3个40 μL液滴上各漂洗3次 µ1× PBS 滴液。
  6. 加入一滴2%醋酸铀（注意：化学品危险），将载网置于其上染色15分钟 以对比样本。
  7. 将样品置于一滴0.13%甲基纤维素（注意：化学品危害）和0.4%醋酸铀酰的混合液上，将载网置于液滴上方孵育10分钟。
  8. 用吸水纸轻轻吸去多余液体，并将载网干燥5分钟 涂层面向上。
  9. 通过透射电子显微镜观察网格12.

4. 外泌体RNA提取与定量

注意：我们决定根据制造商的说明书，使用商业试剂盒从外泌体样本中进行总RNA提取：（注意：存在化学危害，请查阅制造商的说明书和安全指南）。

  1. 将外泌体沉淀重悬于 346.5 µl 裂解缓冲液中后，加入 3.5 µl β-巯基乙醇（注意：具有化学危害），并剧烈涡旋；此步骤为破坏脂质膜所必需。
  2. 将裂解液加入收集管中的洗涤柱内，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去柱子，将滤液转移至新的 1.5 ml 无 RNase 的离心管中。
  3. 加入 350 µl 70% 乙醇（注意：具有化学危害），涡旋混匀 5 秒。
  4. 将裂解液加入解析柱中，于 8,000 × g 离心 30 秒。离心后弃去穿流液，将柱子转移至新的收集管中。
  5. 向柱中加入 350 µl 去盐缓冲液 ，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去穿流液，并将柱子放回同一收集管中。
  6. 在柱子的硅胶膜上加入 95 µl DNase I 反应混合液（每份样品加入 10 µl 重组 DNase I 和 90 µl DNase 缓冲液），于室温孵育 15 分钟 （注意：具有化学危害）。
  7. 向柱中加入 200 µl 洗涤缓冲液（注意：具有化学危害），于 11,000 × g 离心 1 分钟。将柱子放入新的收集管中。
  8. 向柱中加入 600 µl 洗涤缓冲液，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去穿流液，将柱子放回同一收集管中。
  9. 向柱中加入 250 µl 洗涤缓冲液，于 11,000 × g 离心 2 分钟。将柱子放入一个 1.5 ml 无 RNase 的离心管中。
  10. 用 40 µl 无 RNase 的水洗脱 RNA，并于 11,000 × g 离心 1 分钟，以在此小体积中获得高浓度的 RNA。
  11. 立即把洗脱的 RNA 置于冰上以防止可能的降解，或储存于 -80 °C。
  12. 定量 RNA 含量。注：此处使用 1 µl 样品通过分光光度计进行 RNA 定量。

5. 外泌体miRNA的逆转录

注意：由于外泌体中miRNA含量有限，根据试剂盒制造商的说明书，决定通过商业试剂盒对选定的miRNA进行逆转录，每个miRNA使用独立的检测方法。针对每个样本，选择了8个与非小细胞肺癌（NSCLC）状态相关的miRNA（miR-30b；miR-30c；miR-103；miR-122；miR-195；miR-203；miR-221；miR-222；以及作为内参对照的miR-1228-3p）。

  1. 配制逆转录主混合液（RT混合液）。每个反应配制7 μL µl 的 RT 反应混合液，具体方法如所述 表1（点击此处下载）。（警告：化学品危害）
    注意：本实验中，每份样本制备了9种不同的逆转录反应混合液。
  2. 轻轻混匀，将反转录混合液置于冰上保存。加入7 µ每反应管加入 l 的 RT 混合液。
  3. 加入5 µl 微升样本 RNA（10 µ每反应管加入总RNA的量为g，并轻轻混匀。
  4. 加入3 µ将每套试剂中的5倍逆转录引物（注意：化学品危害）加入对应的反应管中。
  5. 缓慢混合，盖上管盖，于冰上孵育5分钟。
  6. 将反应管放入热循环仪中，并使用以下参数开始逆转录反应（HOLD at 16 °C孵育30分钟；42℃保存 °C，30 分钟；85 ℃ 保持 °5 分钟 C；保持 ∞ 4 °C）。

6. 外泌体miRNA的实时PCR分析

注意：本分析采用商业化的实时荧光定量 PCR（qPCR）试剂盒进行，每个样本设置三个生物学重复和技术重复。

  1. 每个反应中，准备 17.67 µl 的实时 PCR 混合液（10 µl PCR 预混液 + 7.67 µl 无核酸酶水），混匀后置于冰上。（注意：存在化学危害）
  2. 向每个 PCR 管中加入 1 µl 的 20 倍浓度 qPCR 引物（注意：存在化学危害）。
  3. 将 18.67 µl qPCR 混合液加入每孔板中。
  4. 向对应的孔板中加入 1.33 µl 逆转录产物。
  5. 封闭板子并离心（300 ×g，5 秒）。
  6. 将板子放入实时 PCR 系统中，并按照以下 PCR 条件开始运行：95°C 持续 10 分钟；进行 40 个循环，每个循环为 95°C 持续 15 秒 和 60°C 持续 60 秒 。根据公式 2-ΔΔct 13 对数据进行处理和标准化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用商用试剂盒对12例非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆样本和6例健康对照样本进行外泌体分离。每个样本均通过蛋白质印迹分析检测外泌体标志物ALIX（96 kDa）和TSG101（43 kDa）。图1展示了其中3个样本的检测结果，表明使用该方案从血浆样本中分离外泌体是可行的。

为了从生物物理角度表征外泌体样品，进行了透射电子显微镜（TEM）分析。TEM结果显示，通过该分离方案获得的纳米囊泡的平均大小处于外泌体的典型尺寸范围，即40 - 100 nm之间（图2）。

外泌体分离与表征后，我们检测了其miRNA含量。我们选取了8种在非小细胞肺癌（NSCLC）中已知表达失调的特定miRNA。作为内参对照，我们使用了miR-1228，该miRNA此前已在多种肿瘤类型中被验证为稳...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过该联合方案，可对非小细胞肺癌患者血浆中的外泌体miRNA进行分析。这些数据可能反映疾病的状况，但还需进一步研究加以证实。

本文所采用的方案基于一种用于外泌体分离的商业试剂盒。原因是其他已知的分离方法（例如，密度梯度超速离心法）需要更多手动操作步骤，导致标准化程度有限。然而，本方案的一个局限性在于，与用于外泌体分离的密度梯度超速离心法相比，后者仍是一种非常有用的技术，能够利用外泌体的特定密度（1.13 - 1.19 g/ml）。一种可能的改进方案是将这两种方法结合使用，这或许会成为该领域的金标准。

使用RNase处理临床样本的可能性使我们获得了不含循环miRNA污染的纯净样本。然而，样本中RNase酶的存在可能会影响外泌体裂解后外泌体miRNA的含量。因此，我们选择了一种采用蛋白酶K处理的试剂盒，以消除循环中的污染物蛋白并降解RNase酶。

在标准化所有分离步骤后，对这些数据进行后续表征和miRNA分析可成为一种有用的工具，用于在初次诊断及随访过程中以...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究还获得了安特卫普多学科肿瘤中心（MOCA）2014年资助项目的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
总外泌体分离试剂盒（来自血浆） Invitrogen4484450使用蛋白酶K处理
核糖核酸酶ASigma-AldrichR4875-100MG
ALIX抗体（3A9）Cell Signaling2171S
TSG-101抗体（C-2）SantaCruz BiotecnologySC-7964 
抗小鼠HRP 1 ml  Cell Signaling7076P2
RNAspin Illustra小型试剂盒 50GE HealthCare25-0500-71
Taqman microRNA逆转录试剂盒Life Technologies4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan microRNA检测Life Technologies002919
hsa-miR-30b TaqMan microRNA检测Life Technologies000602
hsa-miR-30c TaqMan microRNA检测Life Technologies000419
hsa-miR-122 TaqMan microRNA检测Life Technologies002245
hsa-miR-195 TaqMan microRNA检测Life Technologies000494
hsa-miR-203 TaqMan microRNA检测Life Technologies000507
hsa-miR-103 TaqMan microRNA检测Life Technologies000439
hsa-miR-221 TaqMan microRNA检测Life Technologies000524
hsa-miR-222 TaqMan microRNA检测Life Technologies002276
TaqMan通用预混液II，不含UNGLife Technologies4440043

参考文献

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

血浆外泌体qPCR分析外泌体分离蛋白质印迹透射电镜分析RT-PCRmiRNA生物标志物
非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。