本文介绍了一种用于特定植物细胞类型转录谱分析的激光显微切割技术方案。尽管该方案适用于不同物种和细胞类型，但重点是芸苔族Boechera属中与有性生殖和无融合生殖相关的雌性生殖系中极难获取的细胞。
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本文内容
摘要
摘要
在分子水平上理解发育过程需要深入了解转录调控以及特定细胞类型的转录组。尽管本文所述方法通常适用于多种物种和细胞类型，我们的研究重点是植物生殖。植物栽培和种子生产对人类和动物营养至关重要。要实现对植物繁殖过程的定向调控，必须首先深入理解调控生殖系（种系）形成以及最终种子发育的基因调控网络。特别是将无融合生殖（通过种子进行无性繁殖）引入作物植物具有巨大潜力，因为它能够产生与母本植株基因完全相同的克隆种子。因此，雌性种系的各类细胞对于理解并实现无融合生殖的工程化改造具有重要意义。然而，由于这些细胞深埋于花部组织内部，难以获取，给包括细胞类型特异性转录组学在内的实验分析带来了极大挑战。为克服这一限制，可采用激光显微切割技术（LAM）分离单个细胞。虽然LAM结合转录谱分析能够高特异性地鉴定任意细胞类型中活跃的基因和通路，但建立合适的实验流程仍具挑战性。特别是LAM后获得的RNA质量可能受损，尤其是在靶向微小的单个细胞时。为解决这一问题，我们建立了一套LAM工作流程，可重复地获得高质量RNA，非常适合用于转录组学研究，本文以无融合生殖的Boechera雌性种系细胞分离为例进行了展示。本实验方案详细描述了组织制备与LAM操作步骤，并涵盖了RNA提取及质量控制的相关方法。
引言
在组织水平的转录研究中，高度特化但稀有的细胞类型的转录组常常被周围更丰富的细胞所掩盖。植物雌性生殖系（germline）细胞便是这类高度特化细胞类型的例子。雌性生殖系在发育中的胚珠内被确定，胚珠是花雌蕊内种子的前体结构。 1,2大孢子母细胞（MMC）是雌性生殖系的第一个细胞。它经过减数分裂形成四个单倍体的大孢子，构成一个四分体。通常，其中仅有一个大孢子存活，并通过有丝分裂进行多次分裂而不发生胞质分裂。 即，形成合胞体。随后经过细胞化过程发育为成熟的雌配子体，通常包含四种细胞类型：三个反足细胞、两个助细胞、一个卵细胞和一个中央细胞。卵细胞和中央细胞是雌性配子，在双受精过程中分别与两个精细胞结合，发育形成胚胎和胚乳。 1,2在性繁殖模型系统中 拟南芥，每朵花仅发育约50粒种子，而在近缘属中，每朵花可发育约50至80粒种子 拟南芥属因此，雌性生殖系仅由少数几种高度特化的细胞类型组成，是研究细胞命运决定和分化等发育过程的理想模型。
此外，对调控植物繁殖的基因调控过程的研究也具有应用价值。在植物中，既可以通过有性繁殖，也可以通过种子进行无性繁殖（即无融合生殖）。有性繁殖能够在群体中产生遗传多样性，而无融合生殖则产生与母本植株遗传上完全相同的克隆后代。因此，无融合生殖在农业和种子生产中具有巨大应用潜力，因为即使是复杂的母本基因型，也能在多代中保持不变3,4,5。由于主要....
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方案
注意：本方案描述了用于转录谱分析的组织制备、激光捕获显微切割及RNA提取步骤。在整个方案的所有步骤中，必须始终佩戴手套。请仔细阅读并遵守所用每种化学试剂的安全操作说明。特别需要注意的是，二甲苯具有危害性，可穿透手套，而甲醇具有毒性。对于所使用的所有仪器，请参照相应的用户手册进行操作。
1. 去除玻璃器皿及其他设备上的RNase活性
- 使用前，将所有玻璃器皿 用铝箔包裹，并在180 °C下烘烤约8小时，以确保无RNA酶污染。
- 对所有金属表面（例如，镊子）、工作台面及加热板均使用适当的RNA酶去污溶液进行处理。随后用无RNA酶的水清洗表面以去除去污溶液，再用70%乙醇进一步清洁表面。
- 所有塑料耗材（例如，离心管）均应使用全新产品，无需预处理。如条件允许，应选用经认证为无RNA酶的塑料耗材。
2. 组织固定
- 在冰上用新的15 ml离心管配制10 ml农夫固定液（乙醇:冰醋酸 = 3:1；v/v）。（每次使用前均须新鲜配制）。作为替代方案，也可使用非交联性固定液乙醇:冰醋酸（5:1；v/v） 18.
- 使用精细的镊子采集目标发育阶段的花芽。立即将花芽浸入预冷的固定液中。每固定约20个花芽或花朵，使用10 ml固定液。 拟南芥 或 拟南芥属 注意：使用花....
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结果
样品制备与LAM分步连续进行
通过激光显微切割（LAM）从选定的细胞类型中制备用于转录分析的RNA需要经过一系列连续步骤（图1）。首先收获花朵并立即进行固定，以确保收获后RNA群体保持不变。随后对组织进行包埋、切片并载于载玻片上。这使得可通过LAM分离特定细胞类型，并将细胞类型特异性的切片汇集到一个或多个收集帽上（图1）。之后可将材料冷冻保存，或直接进行RNA提取。除了LAM方法适用于模式物种和非模式物种的细胞类型特异性分析这一优势外，该方法仍较为耗时。从组织收获到RNA提取的整个过程通常至少需要一周的工作时间，有时更长（图1）。需要注意的是，通常会将连续数天LAM获得的切片汇集为一个生物学样本并进行RNA提取。对于Boechera卵细胞，强烈建议每个样本使用至少约200个切片，每天可分离约100个切.......
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讨论
该方案适用于不同类型的细胞和组织
结合微阵列或RNA-Seq进行转录组分析的激光显微切割技术（LAM）是一种有价值的工具，可用于深入了解调控发育或生理过程的特定基因表达模式7-11,13,14。然而，该方法对任何特定细胞类型的适用性在很大程度上取决于结构因素。在用于LAM的干燥切片中，细胞必须清晰可见且能够明确识别。在Boechera divaricarpa中，配子体的形态使得卵细胞易于识别（图2，图3）。最终，特定细胞群体的分离速度还取决于在一张载玻片上该细胞类型的出现频率，因为更换载玻片和扫描新载玻片是耗时的步骤。鉴于根据细胞类型的不同，每个样本至少需要汇集200–250个细胞切片，因此该方法对特定研究设计的适用性在很大程度上取决于LAM步骤所需的时间。
此外，根据组织的形态，将切片厚度减少至6 µm可能在结构上更具优势。同样，理想情况下厚度≥ 8 µm的切片通常可从相同量的组织切片中获得更高产量且质量略高的RNA。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Timothy F. Sharbel（IPK Gatersleben）提供 Boechera divaricarpa 种子，感谢 Sharon Kessler（俄克拉荷马大学）对本文的审阅和校对。UG 实验室中关于细胞类型特异性转录组分析以研究配子体发育和无融合生殖的研究工作，得到了苏黎世大学、德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的博士后奖学金以及 Marie Curie 项目 IDEAGENA（授予 AS）、瑞士联邦教育与科研国务秘书处（Staatssekretariat für Bildung und Forschung）在 COST 行动 FA0903 框架内的资助（资助对象为 UG 和 AS）以及瑞士国家科学基金会（资助对象为 UG）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 | VWR | 1,009,861,000 | 分析纯 EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml 圆底离心管 | VWR | 62406-200 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent | G2939AA | |
| 乙酸 | Applichem | A3686,2500 | 100% 分子生物学级 |
| Ambion 无核酸酶水 | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | 组织处理仪 |
| 黑色卡纸 | 可在专业纸张商店购买 | ||
| 无DNA和RNA酶 Frame载玻片 | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET膜；也可从Leica购买 | |
| Dumond 镊子 | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| 酒精灯 | |||
| 干燥器 | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene 真空干燥器或类似设备 |
| 滤芯吸头 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | 可用类似吸头替代 |
| 滤芯吸头 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | 可用类似吸头替代 |
| 滤芯吸头 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | 可用类似吸头替代 |
| 滤芯吸头 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | 可用类似吸头替代 |
| 精密镊子 | VWE | 232-1221 | |
| 玻璃载片架 | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| 玻璃染色槽 | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Leica 加热石蜡包埋模块 | Leica | Leica EG 1150 H | 包埋站，类似设备亦适用 |
| 加热干燥台 | Medax | 15501 | 其他型号和/或供应商的设备亦适用 |
| 冰桶 | VWR 带盖冰桶 | 10146-184 | 类似冰桶同样适用 |
| 透射光台 | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | 白光透射照明仪 |
| 显微镜载玻片 | Thermo Scientific | 10143562CE | 切边 |
| 切片刀片 | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 一次性切片刀片 |
| MMI Cell Cut Plus 仪器 | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| 防粘、无RNA酶微量离心管，2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | 用于组织学 |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA 提取试剂盒 |
| 塑料平衡托盘 | Semadeni AG | 2513 | |
| 塑料盒 | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| 加热板用塑料盖 | 自制 | ||
| 解剖针 | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico 试剂盒 | Agilent | 5067-1513 | |
| 无RNA酶微量离心管 | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP 去污染溶液 | life technologies | AM9780 | |
| 半自动旋转式切片机 | Leica | RM2245 | 类似设备同样适用 |
| Tissue Loc Histo Screen 包埋盒 | Thermo Scientific | C-1000_AQ | 其他供应商的类似包埋盒亦适用 |
| 带粘性盖、无扩散器的管子，500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| 二甲苯（异构体）ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | 最低99%，分析纯，ACS，ISO SP |
| 处理用包埋盒 | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I 无盖 |
| 通用烘箱 | Memmert | UF55 | 其他型号和/或供应商的设备亦适用 |
参考文献
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M.
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重印与许可
