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方法文章

基于人血小板的LC-MS分析作为研究线粒体代谢的平台

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DOI：

10.3791/53941

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2016年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

此处我们展示分离的人类血小板可作为一种便捷的 离体 用于研究对复合体 I 抑制剂鱼藤酮的代谢适应性的模型。该方法采用同位素示踪结合液相色谱-质谱法进行相对定量，可适用于多种研究设计。

摘要

线粒体代谢紊乱在多种疾病中发挥致病作用的研究近期重新受到关注。要探究代谢通路的改变，需要一个能够良好控制外部因素的模型，以获得可重复且有意义的结果。许多研究采用转化细胞模型来实现这一目的；然而，许多癌细胞系中存在的代谢重编程可能引入混杂变量。因此，原代细胞更为理想，尽管获取足够生物量用于代谢研究仍具挑战性。本文表明，人血小板可作为平台，结合液相色谱-串联质谱分析技术开展代谢研究。该方法适用于相对定量及同位素标记，以检测特定代谢通路的活性。血小板可从个体供体或血库获得，使该模型系统适用于临床研究，并具备可扩展性。本文中，我们利用分离的血小板验证了先前发现的在复合物I抑制剂鱼藤酮作用下出现的代偿性代谢转变。更具体而言，糖酵解的减少伴随着脂肪酸氧化的增强，以维持乙酰辅酶A水平。我们的结果表明，血小板可作为一种易于获取且具有医学相关性的模型，用于探究外源物质对细胞代谢的影响。

引言

线粒体代谢功能障碍已被认为与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、癌症和心血管疾病30。因此，人们投入了大量努力来表征导致疾病发病机制的代谢缺陷。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）被认为是定量复杂生物基质中分析物的金标准，常被用于代谢研究8。然而，与许多生物医学研究一样，获得一个与人类疾病相关且易于获取、定义明确的模型仍是一项挑战。

许多研究采用转化的细胞模型来探究外源性物质或基因异常对细胞代谢的影响7,9。癌细胞中发生的代谢重编程可能引入混杂因素21，因此并不理想。这些问题可通过原代细胞模型加以避免，尽管获取足够生物量用于代谢分析仍具挑战性。此外，培养过程中使用大量抗生素可能干扰线粒体研究，这一点已受到关注16。

人血小板为利用原代细胞模型进行代谢研究提供了机会，其线粒体含量足以支持相关实验5,22,27,32。首先，血小板可通过个体献血者采血获得，也可从血库获取大量样本，因此该模型便于控制外部影响因素。其次，由于血小板体积小，在设备简单的实验室中也能通过较少的预处理步骤将其从其他血液成分中轻松分离5。值得注意的是，血小板不含细胞核，因此可用于独立于转录调控之外的代谢变化研究。本文表明，除了可对酰基辅酶A（CoA）硫酯进行相对定量外，分离的血小板系统还可用于研究碳代谢。具体而言，我们报道了使用稳定同位素（非放射性）标记的[13C6]-葡萄糖和[13C16]-棕榈酸进行代谢标记，以检测通过糖酵解或脂肪酸氧化途径将[13C]标记掺入关键代谢物乙酰-CoA的情况。由于酰基-CoA类物质在生化途径中广泛参与13,24，且该系统易于测试其他变量（例如使用鱼藤酮抑制复合物I3,33），因此该方法具有强大、通用且灵活的优势。除下文方案中提供的信息外，有关同位素标记及基于液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法的详细描述可参见Basu和Blair4。

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方案

伦理声明：所有涉及人源样本处理的实验方案均遵循宾夕法尼亚大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 缓冲液和100倍储存液的配制

  1. 配制1 L基础台氏液缓冲液。称取8.123 g NaCl、1.428 g NaHCO3、0.466 g CaCl2∙2 H2O、0.224 g KCl和0.095 g MgCl2，用ddH2O定容至1 L。使用滤膜对基础台氏液缓冲液进行除菌过滤。
  2. 配制100倍浓缩的葡萄糖和棕榈酸储备液。对于100倍葡萄糖储备液，将100 mg葡萄糖或[13C6]-葡萄糖溶解于1 ml ddH2O中。对于100倍棕榈酸储备液，将2.56 mg棕榈酸或2.72 mg [13C16]-棕榈酸溶解于1 ml乙醇中。对100倍储备液进行滤膜除菌。
  3. 配制相应的富集型台氏液缓冲液
    1. 对于非标记实验，向98 ml基础台氏液缓冲液中加入1 ml 100倍葡萄糖储备液和1 ml 100倍棕榈酸储备液。
    2. 对于葡萄糖标记实验，向98 ml基础台氏液缓冲液中加入1 ml 100倍[13C6]-葡萄糖储备液和1 ml 100倍棕榈酸储备液。
    3. 对于棕榈酸标记实验，向98 ml基础台氏液缓冲液中加入1 ml 100倍葡萄糖储备液和1 ml [13C16]-棕榈酸储备液。
  4. 配制鱼藤酮处理用溶液
    1. 将鱼藤酮溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mM的储备液。
    2. 对于非标记的剂量-反应研究，请继续执行步骤1.4.3；对于单剂量标记实验，请继续执行步骤1.4.5。
    3. 用DMSO对10 mM鱼藤酮储备液进行系列稀释，获得浓度范围为1 nM至100 µM的溶液。这些为100倍储备液。
    4. 将每种储备液各取50 µl加入5 ml来自步骤1.3.1的基础台氏液缓冲液+葡萄糖+棕榈酸中，配制成鱼藤酮终浓度为10 pM至1 µM的处理液。或者加入50 µl DMSO作为溶剂对照。随后进行步骤2.1。
    5. 将10 mM储备液在DMSO中稀释1,000倍，得到10 µM的工作液。
    6. 将50 µl该工作液分别加入5 ml来自步骤1.3.2的基础台氏液缓冲液+ [13C6]-葡萄糖+棕榈酸和来自步骤1.3.3的基础台氏液缓冲液+葡萄糖+ [13C16]-棕榈酸中，最终鱼藤酮浓度为100 nM。或者在每种缓冲液中加入50 µl DMSO作为溶剂对照。

2. 血小板分离

注意：本方法适用于从全血或血小板袋中提取的血小板。本文所含示例数据使用来自血小板袋的血小板制备而成。有关使用从全血中分离的血小板的更多细节，请参见 Basu et al.5。

  1. 从全血中分离血小板
    注意：若从血小板袋中分离血小板，请继续进行步骤 2.2.1。
    1. 将全血在 175 x g 条件下离心 g 15分钟内无间断。
    2. 将1 ml上层富血小板血浆（PRP）转移至1.5 ml微量离心管中。
    3. 将PRP在400 x g下离心 g 5 分钟。
    4. 吸去上清液，然后进行步骤 3.1 或 3.2。
  2. 从血小板袋中分离血小板
    1. 将1 ml血小板悬液转移至1.5 ml微量离心管中。
    2. 以 400 × g 离心 5 分钟。
    3. 吸去上清液，然后进行步骤 3.1 或 3.2。

3. 进行实验

  1. 为确定外源性物质处理的影响（例如， 鱼藤酮）对目标代谢物水平的影响（例如， 乙酰辅酶A），进行步骤3.1.1。为确定外源性物质（例如，鱼藤酮）对代谢前体掺入目标下游代谢物的影响，请继续进行3.2.1节。
    1. 每个条件下使用不少于三个生物学重复，将步骤 2.1.4 或 2.2.3 中的血小板沉淀重悬于 1 ml 步骤 1.4.4 中的每种溶液中。
    2. 将重悬的血小板置于水套式 CO₂ 培养箱中孵育2 置于湿度为95%、5% CO₂的培养箱中2 37 °C 下孵育 1 小时。继续进行步骤 4.1。
      注意：此处描述的是剂量反应实验。 alternatively，也可进行时间过程实验，即固定剂量而改变孵育时间。
  2. 确定外源性物质处理对代谢前体掺入目标下游代谢物的影响。
    1. 每个条件下使用不少于三个生物学重复，将步骤 2.1.4 或 2.2.3 中获得的血小板沉淀重悬于 1 ml 来自步骤 1.4.6 的每种标记的 Tyrode's 缓冲液中。
    2. 在水套式 CO₂ 培养箱中孵育重悬的血小板2 置于湿度为95%、5% CO₂的培养箱中2 37 °C 反应 1 小时。进行步骤 4.1。

4. 猝灭与辅酶A提取

  1. 在3,000 × g条件下离心3分钟，沉淀血小板。
  2. 吸除上清液。
  3. 将血小板重悬于750 µl冰上预冷的10%（w/v）三氯乙酸中。
  4. 加入适当量的稳定同位素标记内标。例如，若目标是比较不同样本中辅酶A（CoA）物种的水平，可使用100 µl先前所述方法（SILEC技术）从酵母中获得的稳定同位素标记的辅酶A硫酯混合物29。
  5. 对每个样本进行脉冲式超声处理，共30次，每次0.5秒。
  6. 在4 °C下以16,000 × g离心10分钟。
  7. 将C18固相萃取（SPE）柱连接至真空 manifold。
  8. 用1 ml甲醇对萃取柱进行活化。
  9. 用1 ml ddH2O平衡萃取柱。
  10. 将样本所得上清液（本例中约850 µl）过柱。
  11. 用1 ml水洗涤萃取柱。
  12. 在真空 manifold中放入10 ml玻璃离心管，用于收集洗脱组分。
  13. 用1 ml含25 mM乙酸铵的甲醇溶液洗脱萃取柱。
  14. 在氮气下吹干洗脱液。
  15. 将干燥残留物重悬于50 µl 5%（w/v）5-磺基水杨酸中，并转移至HPLC小瓶中。

5. 高效液相色谱仪设置

  1. 使用HPLC系统的控制软件，根据表1中列出的目标分析物和所用色谱柱优化的HPLC条件，建立分析方法。
    注意：本实验数据生成时采用的色谱柱温度为25 °C，但具体参数会因仪器不同以及目标化合物的差异而有所变化。针对酰基辅酶A的定量分析，已有多种LC-MS分析方法被报道，并在不同的LC条件下对不同分析物进行了验证14,19,20。
  2. 确保HPLC系统充分平衡。
    注意：此过程应包括在安装色谱柱前对流动相进行预冲洗，以及在方法起始流动相条件下对色谱柱进行平衡。平衡体积应遵循制造商的建议，平衡过程中流出的液体应排入废液。
    注意：有关HPLC设置的更多细节，请参阅Basu和Blair5。

6. 质谱仪设置

  1. 使用质谱仪的控制软件，为待测化合物的离子化形式建立靶向检测方法。相关参数见表2。
    注意：应使用这些化合物的稳定同位素类似物，以确定正离子模式或负离子模式可提供更优的灵敏度，并优化离子源和光学系统的检测条件。质谱方法的总检测时间应与相应的高效液相色谱（HPLC）方法的时间组分相匹配。
    注意：如前所述，已有多种酰基辅酶A分析方法被报道，包括正离子模式14和负离子模式15，以及使用高分辨质谱仪17而非三重四极杆仪器28。
  2. 清洁并校准仪器，建立稳定的喷雾进入质谱仪，并根据制造商说明，留出足够时间使校准溶液充分从离子源和光学系统中消散。
  3. 使用质谱仪控制软件为所有样品设置进样序列。包括样品名称或编号，并注明相应的进样体积和仪器方法。在第一个样品前运行一个空白样品，并根据需要在样品之间插入其他空白和清洗步骤，以减少残留或基质效应。
    注意：用于目标分析物液相色谱图峰面积积分的处理方法，通常可在该序列中设置，或在后续数据处理中应用。
  4. 启动序列，并在运行过程中定期监测质谱仪和高效液相色谱系统，检查是否存在压力波动、系统故障或信号强度下降等问题。
    注意：若出现严重问题或持续运行失败，可能需要中止运行，对高效液相色谱系统进行冲洗和重新平衡，并对质谱仪进行清洁和校准。有关质谱参数设置和数据处理的更多细节，请参阅 Basu 和 Blair5。

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结果

为了展示该方法的实用性，我们重现了既往报道的因接触鱼藤酮而引发的代偿性代谢适应现象的普适性。这一发现此前已在细胞培养模型中被识别，而本研究旨在验证此类代谢转变是否同样存在于血小板中。由于血小板无细胞核，不易产生细胞培养中常见的实验假象，因此具有更高的可靠性。本研究使用了来自宾夕法尼亚创伤中心的6天龄血小板，这些血小板因超过临床输注时限而不再适用于人体输注，但仍保留了其代谢活性。分离操作如图1所示。整个工作流程可根据可用血小板的数量灵活调整，既可适用于少量临床样本或实验条件，也可扩展至基于96孔板的高通量分析，充分利用那些不再适用于患者输注的血小板资源。

本课题组先前已报道，在细胞系中，酰基辅酶A硫酯的相对水平在鱼藤酮作用下发生变化，推测该变化源于复合物I的抑制（图2）。具体而言，我们在SH-SY5Y细胞中观察到，琥珀酰辅酶A呈剂量依赖性降低（IC50 = 25 n...

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讨论

本文展示了分离血小板作为研究线粒体代谢紊乱的平台的实用性。具体而言，我们表征了在鱼藤酮抑制复合物 I 后所引发的代谢适应性反应。

本研究将先前关于鱼藤酮抑制细胞系中复合体I作用的发现，拓展至人类血小板。重要的是，该研究揭示鱼藤酮同样抑制血小板琥珀酰辅酶A的生成，促进血小板β-羟基丁酰辅酶A水平升高，但对血小板乙酰辅酶A水平无影响。

必须格外注意，以确保此类分析的有效性和可重复性。若需从全血中分离血小板，应严格按照上述方法进行操作，以防止淋巴细胞污染和血小板活化，特别应注意保持含有淋巴细胞的白膜层不受扰动。为了使剂量-反应曲线具有意义，必须精确进行系列稀释，并在每一步充分混匀至均一状态。在血小板重悬后，孵育条件可依据上述细节进行调整，但不同处理组之间的条件必须严格标准化，以便进行有意义的比较。在任何基于液相色谱/质谱（LC/MS）的定量分析中，最关键的步骤之一是使用稳定同位素标记的内标物。

在该实验条件下，内标物的使用至关重要，因为它可防止潜在的干扰因素造成混淆 "...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 P30ES013508 和 T32ES019851 提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
氯化钠 (NaCl)Sigma-Aldrich746398
碳酸氢钠 (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
二水合氯化钙 (CaCl2 · H2O)Sigma-Aldrich223506
氯化钾 (KCl)Sigma-AldrichP9541
氯化镁 (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
13C6-葡萄糖Sigma-Aldrich389374
棕榈酸Cayman10006627
13C16-棕榈酸Sigma-Aldrich605573
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
三氯乙酸Sigma-AldrichT6399
5-磺基水杨酸Sigma-Aldrich390275
乙腈Fischer ScientificA996-4(optima)
水 (H2O)Fischer ScientificW7-4(optima)
甲酸Fischer Scientific85171(optima)
二甲基亚砜Sigma-Aldrich472301
乙醇Fischer Scientific04-355-222
甲醇Fischer ScientificA454-4(optima)
乙酸铵Fischer ScientificA639-500
2 ml Eppendorf 管BioExpressC-3229-1
液相色谱小瓶（塑料）Waters186002640
10 ml 玻璃离心管Kimble Chase73785-10
Oasis 固相萃取 (SPE) 柱WatersWAT094225
巴斯德吸管Fischer Scientific13-678-200
名称公司货号备注
设备
CO2 恒温培养箱（水套式）NuaireAutoFlow NU-8500
三重四极杆质谱仪Thermo ScientificFinnigan TSQ Quantum
高效液相色谱仪 (HPLC)Thermo ScientificDionex Ultimate 3000
离子源Thermo ScientificHESI II
高效液相色谱柱PhenomenexLuna C183 μm 粒径，200 mm × 2 mm

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