方法文章

人类血小板的LC-MS分析作为研究线粒体代谢的平台

DOI：

10.3791/53941

⸱

2016年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里，我们表明分离的人血小板可以用作一个可访问的体外模型来研究的代谢适应响应于I抑制剂鱼藤酮的复合物。这种方法通过液相色谱 - 质谱法使用同位素示踪和相对定量，并且可以应用于各种研究设计的。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

扰动的线粒体代谢因其在一系列疾病中起致病作用而重新受到关注。探测代谢途径的改变需要一个模型，在该模型中，外部因素可以得到很好的控制，从而获得可重复和有意义的结果。许多研究为此目的采用了转化的细胞模型;然而，在许多癌细胞系中发生的代谢重编程可能会引入混杂变量。因此，原代细胞是可取的，尽管获得足够的生物量用于代谢研究可能具有挑战性。在这里，我们表明人血小板可以用作结合液相色谱-串联质谱分析进行代谢研究的平台。这种方法适用于相对定量和同位素标记，以探测特定代谢途径的活性。 来自个人献血者或血库的血小板的可用性使该模型系统适用于临床研究并可以扩大规模。在这里，我们利用分离的血小板来确认先前确定的响应复合物 I 抑制剂鱼藤酮的代偿性代谢变化。更具体地说，糖酵解的减少伴随着脂肪酸氧化的增加以维持乙酰辅酶 A 水平。我们的结果表明，血小板可以用作一种易于获得且具有医学相关性的模型来探测外源性物质对细胞代谢的影响。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

功能失调线粒体代谢已牵涉多种疾病，包括神经变性，肿瘤和心血管疾病30。这样，巨大的努力已被放在特征有助于疾病的发病机制的代谢缺陷。液相色谱-串联质谱（LC-MS / MS）被认为是用于从复杂的生物基质分析物定量的黄金标准，并经常用于代谢研究8。然而，由于经常与生物医学研究中的情况下，获得有关人类疾病可访问的和明确的模型是一个挑战。

许多研究聘请转化的细胞模型，用于探测生物异源物质或遗传异常的对细胞代谢7,9的影响。发生在肿瘤细胞中可引入混杂代谢重新编程因子21，因此不理想。这些问题可以是circumve原发性细胞模型nted，虽然获得足够的生物质的代谢分析可以是具有挑战性的。此外，大量的文化中使用抗生素的影响已经凸显为潜在的混杂线粒体研究16。

人血小板无力利用与代谢研究5,22,27,32足够的线粒体内容主要细胞模型的机会。首先，血小板可容易地获得的，通过抽血从个体供体，或从血库大量，因此提供其中外部因素可容易地控制的模型。其次，由于它们的尺寸小，血小板可以很容易地从其它血液成分以最小的准备工作中，即使最小装备的实验室5隔离。值得注意的是，血小板不含有晶核，因此可以被用来改变独立地转录调控的研究来代谢。这里，我们表明除了酰基辅酶A（辅酶A）硫酯的相对定量，分离的血小板系统可用于检查碳代谢。具体地讲，我们报道了使用代谢标记的稳定同位素（非放射性）标记的[13 C 6]葡萄糖和[13 C 16] -palmitate探测的[13℃] -label掺入重要代谢产物乙酰经由糖酵解或脂肪酸氧化辅酶A.这提供了一个有力的，概括的，和多功能平台由于酰基-CoA物种的生化途径13,24广泛参与和该系统对测试其他变量，如复合物I的抑制鱼藤酮3,33的易处理性。除了 ​​下面的协议中提供的信息，用于对同位素标记和用于基于LC-MS-分析的方法的广泛的说明可在巴苏和Blair 4中找到。

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方案

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伦理学声明:关于人体标本的处理所有协议遵循美国宾夕法尼亚大学的人类研究伦理委员会的指导方针。

1.缓冲区的制备及100X母液

  1. 制备1升的碱蒂罗德缓冲液中。结合8.123克氯化钠，1.428克碳酸氢钠，0.466克氯化钙 ∙2 H 2 0，0.224克KCl和0.095克的MgCl 2，调整总体积至1L用的DDH 2 O过滤消毒基地台氏缓冲区。
  2. 准备葡萄糖和棕榈酸的100倍储备溶液。对于100倍的葡萄糖储备液，溶解100毫克的葡萄糖或[13 C 6]葡萄糖1毫升的DDH 2 O的为100倍，棕榈酸溶液，溶解2.56毫克棕榈酸或在1ml乙醇2.72毫克[13 C 16] -棕榈酸。过滤消毒100X原液。
  3. 准备适当富集台氏缓冲器
    1. 对于非标记研究，加入1毫升的100倍的葡萄糖储备溶液和1ml的100倍的棕榈酸储备溶液至98的基台氏缓冲毫升。
    2. 葡萄糖标记研究，加入1毫升的100×[13 C 6]葡萄糖储备溶液和1ml的100倍的棕榈酸储备溶液至98的基台氏缓冲毫升。
    3. 为棕榈酸标记研究，将1ml [13 C 16] -棕榈酸原液的100倍葡萄糖储备溶液和1ml添加到98的基台氏缓冲毫升。
  4. 准备鱼藤酮治疗解决方案
    1. 制备鱼藤酮在二甲亚砜（DMSO）中的10mM储液。
    2. 对于非贴标剂量反应的研究，进行1.4.3。对于以单剂量标记研究，继续执行1.4.5。
    3. 在DMSO执行的10mM鱼藤酮的库存的系列稀释以获得具有鱼藤酮的浓度范围为1nM至100μM的解决方案。这是100倍的股票秒。
    4. 加入50微升每只股票的5毫升基地台氏缓冲+葡萄糖+棕榈酸从1.3.1准备用鱼藤酮浓度从晚上10点到1微米的解决方案。备选地，添加50微升的DMSO作为载体对照。继续执行2.1。
    5. 稀释的10mM储备液1,000倍的DMSO以获得10微米的工作溶液。
    6. 加入50微升这股给每个基地台氏缓冲+5毫升[13 C 6]葡萄糖+棕榈酸从1.3.2和基地台氏缓冲+葡萄糖+ [13 C 16]从1.3.3 -棕榈酸。的最终浓度为100nM的鱼藤酮。另外，加入50微升DMSO的每一个缓冲区，作为车辆的控制。

2.血小板隔离

注意:此方法是适合于从全血或血小板从衍生袋血小板。本文中的示例数据准备利用血小板衍生袋血小板。请参见Basu等人 5为使用从全血中分离血小板有关的更多细节。

  1. 从全血中分离血小板
    注意:如果从血小板一袋血小板分离，继续2.2.1。
    1. 离心全血为在没有刹车的15分钟175×g的。
    2. 传输1毫升上层富血小板血浆（PRP）层到1.5ml微量离心管中。
    3. 离心在400×g下将PRP 5分钟。
    4. 吸上清并继续执行步骤3.1或3.2。
  2. 从血小板袋血小板隔离
    1. 传输1毫升血小板悬浮液至1.5ml微量离心管中。
    2. 离心在400 xg离心悬浮液5分钟。
    3. 吸上清并继续执行步骤3.1。或3.2。

3.进行实验

  1. 为了确定异生的作用治疗（ 例如，鱼藤酮）上感兴趣的代谢物的水平（ 例如，乙酰-CoA），继续3.1.1。来确定到感兴趣的下游代谢产物的代谢前体的掺入生物外源性（ 例如 ，鱼藤酮）的效果，进行3.2.1。
    1. 不使用少于三个生物复制为每个条件，从步骤2.1.4或2.2.3在1毫升每种解决方案的步骤1.4.4悬浮颗粒血小板。
    2. 在水夹套的 CO 2培养箱设定为95％湿度，5％CO 2和37℃下1小时孵育再悬浮血小板。继续执行步骤4.1
      注意:这里介绍一个剂量反应实验。或者，时程实验可以做，其中所述剂量是固定和温育的长度是变化的，而不是。
  2. 以确定代谢前体掺入的生物外源性处理的效果到感兴趣的下游代谢产物。
    1. ü唱不超过每个条件的三次生物学重复较少，从步骤2.1.4或2.2.3在标台氏缓冲每个配方1毫升步骤1.4.6悬浮颗粒血小板。
    2. 在水夹套的 CO 2培养箱设定为95％湿度，5％CO 2和37℃下1小时孵育再悬浮血小板。继续执行步骤4.1。

4.淬火和CoA提取

  1. 通过以3000 xg离心离心3分钟沉淀血小板。
  2. 吸上清。
  3. 在750微升冰冷的10％三氯乙酸悬浮血小板（重量/体积）。
  4. 添加适当的稳定同位素标记的内部标准。例如，如果目标是辅酶物种的水平跨样品比较，用100微升的稳定同位素如前所述从酵母得到的标辅酶A硫酯（SILEC技术）29的混合物。
  5. 脉冲声处理每个样品以0.5秒的脉冲30​​次。
  6. 离心样品以16,000 xg离心在4℃下10分钟。
  7. 贴上C18固相萃取（SPE）列真空歧管。
  8. 调节用1ml甲醇的列。
  9. 平衡柱用1ml的DDH 2 O
  10. 通过列运行样品衍生的上清液（约850微升在这种情况下）。
  11. 用1毫升清水洗净列。
  12. 放入10毫升玻璃离心管到真空歧管，收集洗脱部分。
  13. 用在甲醇中加入1ml的25mM乙酸铵洗脱该柱。
  14. 在氮气下干燥洗脱液。
  15. 悬浮干燥残留在50μl5％（重量/体积）的5-磺基水杨酸并转移到HPLC小瓶中。

5. HPLC安装

  1. 使用控制软件的HPLC系统中，创建与目标分析物和利用柱进行了优化，如表1中所列的HPLC条件的方法。
    注:列TEMPERAT用于该数据的生成URE为25℃，但在特定的参数将通过仪器和相对于感兴趣的化合物而变化。为酰基辅酶A的定量，LC-MS分析的多种方法已被报道，并验证在不同LC条件14,19,20不同的分析物。
  2. 让HPLC充分平衡。
    注意:这应包括溶剂的两个涂刷在该方法的起始溶剂条件附接柱的柱和平衡之前。该平衡容积应按照制造商的指示，以及由此产生的污水应分流到废液。
    注:请巴苏和布莱尔5关于HPLC设置的详细信息。

6.质谱仪设置

  1. 使用控制软件用于质谱仪，创建用于检测感兴趣的化合物的离子化形式靶向方法。参数介绍在表2中。
    注意:这些化合物的稳定同位素类似物应被用来确定一个正或负模式下是否能给予优良的灵敏度和优化源和光学条件为它们的检测。质谱仪方法的总检测时间应该对应于相关的高效液相色谱法的时间分量。
    注意:如前面提到的，酰基-CoA分析的多种方法已被报道，包括正面14和负电离15模式和使用高分辨率质谱仪17的，而不是一个三重四极杆仪器28。
  2. 清洁和校准仪器，建立一个稳定的喷雾进入光谱仪，并且允许时间校准溶液充分从源，并根据制造商的说明光学消散。
  3. 设置为所有与质谱仪控制软件的样本的序列。 Inclu取消名称或数字标识符，并注明相应的注射量和仪器法。运行的第一个样品之前的空白，并根据需要来减轻残留或基体效应样品之间运行的其他空白和洗涤。
    注意:峰积分所选分析物"液体色谱的处理方法，通常可以此顺序内设定或随后在数据处理中应用。
  4. 开始的顺序和周期性地监视质谱仪和HPLC系统的问题，包括压力波动或系统故障以及在运​​行期间的信号强度的损失。
    注:严重问题或持续运行故障可能需要停止运行和吹扫和重新平衡的HPLC系统以及清洁和校准质谱仪。巴苏咨询和布莱尔5关于MS的设置和数据处理的更多细节。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了证明这种方法我们已经再现先前描述代偿代谢适应的所得暴露于鱼藤酮概的效用。这一发现在细胞培养模型先前确定和本调查的目的，可测试此代谢移也发生在血小板，是无核，不容易在相同实验工件作为细胞培养物。这项工作是用6天的血小板宾夕法尼亚创伤中心，已被认为太老了人类输液进行的，虽然他们保留了他们的代谢活动。 如图1中进行了隔离，总的工作流程可以很容易地从临床样品或实验条件的有限数量可以扩展到96孔平板基于更高的吞吐量与血小板不再用于输注到患者有用的可用性。

图2）的抑制导致酰基CoA硫酯的相对水平变化。具体来说，我们在SH-SY5Y细胞观察中琥珀酰-CoA（IC 50 = 25纳米）的剂量依赖性降低，在β羟同步增长（HB）-CoA（ED 50 = 75纳米），而乙酰-CoA水平均持平1。我们与鱼藤酮处理的人血小板的分析表明高度一致的结果（ 图3）。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们已经表明孤立血小板的效用作为研究扰动线粒体代谢的平台。具体地，我们已响应于鱼藤酮复合物I抑制其特征代谢适应。

目前的研究复杂我抑制细胞系对人类血小板的作用鱼藤酮扩展先前报告的调查结果。重要的是，这已表明，鱼藤酮也抑制血小板琥珀酰-CoA的形成，刺激在血小板βHB辅酶A的增加和对乙酰-CoA的血小板水平没有影响。

极大必须小心，以确保任何此类型的分析的有效性和可重复性。如果血小板将被从全血中分离，如在为了防止淋巴细胞污染和血小板激活上述隔离应完全进行，用专门留下含淋巴细胞undis血沉棕黄层特别注意受扰。为了使剂量响应曲线有意义，连续稀释必须精确地进行，并在每个步骤中的混合至均匀。血小板再悬浮后，孵育条件可以不同于上面详述被修改，但它们必须在整个治疗组中进行严格的标准化，以允许有意义的比较来进行。也许在任何定量的LC / MS分析中最重要的步骤是使用稳定同位素标记的内标。

利用内部标准在此设置非常重要，因为它可以防止潜在的混杂"批量效应"，如可变萃取效率和整个样...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称没有竞争经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们承认美国国立卫生研究院资助P30ES013508和T32ES019851的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
氯化钠 （NaCl）Sigma-Aldrich746398
氢钠 （NaHCO3）Sigma-AldrichS5761
氯化钙二水合物 （CaCl2 * H2O）Sigma-Aldrich223506
氯化钾 （KCl）Sigma-AldrichP9541
氯化镁 （MgCl2）Sigma-Aldrich208337
葡萄糖Sigma-AldrichG8270<
sup>13C6-葡萄糖Sigma-Aldrich389374
棕榈酸开曼10006627
13C16-棕榈酸Sigma-Aldrich605573
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
三氯乙酸Sigma-AldrichT6399
5-磺基水杨酸Sigma-Aldrich390275
乙腈Fischer ScientificA996-4（最优）
水 （H2O）Fischer ScientificW7-4（最优）
甲酸Fischer Scientific85171（最优）
二甲基亚砜Sigma-Aldrich472301
乙醇Fischer Scientific04-355-222
甲醇Fischer ScientificA454-4（最优）
乙酸铵Fischer ScientificA639-500
2 ml Eppendorf 管BioExpressC-3229-1
液相色谱样品瓶（塑料）Waters186002640
10 ml 玻璃离心管Kimble Chase73785-10
Oasis 固相分离 （SPE） 色谱柱WatersWAT094225
Pastuer 移液管飞鱼科技13-678-200
名称公司<强>目录号<strong>评论
设备
CO2 水套式培养箱NuaireAutoFlow NU-8500
三重四极杆质谱仪Thermo ScientificFinnigan TSQ 量子
HPLCThermo ScientificDionex Ultimate 3000
源Thermo ScientificHESI II
HPLC 色谱柱PhenomenexLuna C183 μm 粒径，200 mm x 2 mm
碳酸

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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