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方法文章

蛋白质降解的放线菌酮追踪分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

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DOI：

10.3791/53975

⸱

2016年4月18日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

本文内容

摘要

蛋白质丰度反映了蛋白质合成与蛋白质降解的速率。本文介绍了在模式单细胞真核生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，芽殖酵母）中，利用环己酰亚胺追踪实验结合蛋白质印迹法分析蛋白质降解的方法。

摘要

蛋白质丰度的调控几乎对所有细胞过程都至关重要。蛋白质丰度反映了蛋白质合成速率与蛋白质降解速率的整合结果。许多用于检测蛋白质丰度的实验方法（例如单时间点的蛋白质印迹、流式细胞术、荧光显微镜或基于生长的报告基因检测等方法，无法区分翻译和蛋白降解对蛋白质水平的相对影响。本文介绍了在模式单细胞真核生物中，采用放线菌酮追踪结合蛋白质印迹的方法，以特异性分析蛋白质降解过程。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （芽殖酵母）。在此实验中，酵母细胞在翻译抑制剂环己酰亚胺存在下进行孵育。在加入环己酰亚胺后立即以及在特定时间点收集细胞等分试样。细胞经裂解后，裂解液通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用于各时间点蛋白质丰度的蛋白质印迹分析。环己酰亚胺追踪实验可实现对多种细胞蛋白质稳态群体降解动力学的可视化观察。该方法可用于研究蛋白质降解过程中的遗传需求以及环境因素的影响。

引言

蛋白质在几乎所有细胞过程中都发挥着关键作用。许多生理过程需要特定蛋白质（或多种蛋白质）在特定时间段内或特定条件下存在。因此，生物体会监测并调控蛋白质的丰度以满足细胞需求1。例如，细胞周期蛋白（调控细胞分裂的蛋白质）仅在细胞周期的特定阶段存在，而细胞周期蛋白水平的调控失常已被证实与恶性肿瘤的形成相关2。除了调控蛋白质水平以满足细胞需求外，细胞还利用降解性质量控制机制来清除错误折叠、未组装或其它异常的蛋白质分子3。蛋白质丰度的调控涉及大分子合成（转录和翻译）与降解（RNA降解和蛋白质水解）两方面的调节。蛋白质降解功能受损或过度均会导致多种病理状态，包括癌症、囊性纤维化、神经退行性疾病以及心血管疾病4-8。因此，蛋白质水解机制已成为多种疾病治疗中极具前景的靶点9-12。

在单一时间点对蛋白质进行分析（例如，通过蛋白质印迹13、流式细胞术14或荧光显微镜15）仅能提供蛋白质稳态丰度的快照，而无法揭示其合成与降解的相对贡献。类似地，基于生长的报告基因检测反映的是较长时间内蛋白质的稳态水平，但同样无法区分合成与降解各自的影响15–20。通过比较降解机制特定组分被抑制前后蛋白质丰度的变化，可间接推断降解过程对稳态水平的贡献（例如，通过药物抑制蛋白酶体活性21，或敲除假设参与降解过程的基因13）。在抑制降解通路后若观察到稳态蛋白质水平发生变化，则为蛋白水解在调控蛋白质丰度中的作用提供了有力证据13。然而，此类分析仍无法提供有关蛋白质 turnover 动力学的信息。环己酰亚胺追踪实验结合蛋白质印迹技术可克服上述局限，使研究人员能够随时间观察蛋白质的降解过程22–24。此外，由于环己酰亚胺追踪后的蛋白质检测通常采用蛋白质印迹法，因此无需使用放射性同位素或耗时的免疫沉淀步骤——这一点不同于许多常用的脉冲追踪技术，后者也用于观察蛋白质降解25。

放线菌素最初被鉴定为由革兰氏阳性细菌Streptomyces griseus产生的具有抗真菌特性的化合物26,27。它是一种可穿透细胞膜的分子，通过干扰核糖体移位，特异性抑制真核细胞胞质（而非细胞器）中的蛋白质翻译28-31。在放线菌素追踪实验中，将放线菌素加入细胞后，立即以及在化合物添加后的特定时间点分别收集细胞等分试样22。裂解细胞后，通常通过蛋白质印迹法分析每个时间点的蛋白质丰度。在加入放线菌素后观察到的蛋白质丰度下降可明确归因于蛋白质降解。不稳定的蛋白质会随着时间推移其丰度逐渐降低，而相对稳定的蛋白质则表现出丰度变化较小。

选择性蛋白质降解的机制在真核生物中高度保守。关于蛋白质降解的许多知识最初是在单细胞真核模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，芽殖酵母）中发现的25,32-36。酵母研究有望继续为蛋白质降解提供新颖且重要的见解。本文介绍了一种在酵母细胞中进行环己酰亚胺追踪实验，随后通过蛋白质印迹法分析蛋白质丰度的方法。

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方案

1. 酵母细胞的培养与收获

  1. 若不分析内源性酵母蛋白的降解动力学，则将目标酵母菌株转化入编码目的蛋白的质粒。可靠的酵母转化方法已有文献报道37。
  2. 将酵母接种于5 ml适当的培养基中（例如，用于维持转化细胞中质粒的选择性合成定义培养基（SD培养基），或用于非转化细胞的非选择性酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基）。在30 °C下振荡培养过夜。
    注：30 °C是典型野生型实验室酵母菌株的最佳生长温度38。然而，由于某些突变酵母菌株在30 °C下不能最佳生长，且某些蛋白会发生温度依赖性降解，因此酵母细胞生长和放线菌酮追踪实验所用温度应通过实验确定39。
  3. 测定每种过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。
    注：细胞可处于对数生长期或稳定期，但其密度应至少达到可在15 ml新鲜培养基中稀释至OD600 = 0.2的水平。
  4. 将过夜培养物用15 ml新鲜培养基稀释至OD600为0.2。
  5. 在30 °C下振荡培养酵母，直至细胞进入对数中期生长阶段（即，OD600介于0.8至1.2之间）。
  6. 在酵母细胞生长期间，进行以下操作以准备放线菌酮追踪实验：
    1. 设置一个可容纳15 ml锥形管的加热块，温度设定为30 °C，用于在放线菌酮存在下孵育细胞。向加热块的孔中加水，以实现对培养物的有效热传导。向每个孔中加水，使插入15 ml锥形管后水位上升至孔口边缘但不溢出。
    2. 设置第二个可容纳1.5 ml微量离心管的加热块，温度设定为95 °C，用于细胞裂解后的蛋白变性。
    3. 将新鲜生长培养基预热至30 °C（每种待测培养物每个时间点需1.1 ml）。
    4. 向预先标记的微量离心管中加入50 µl 20x终止混合液（每种待测培养物每个时间点对应一管）。将管子置于冰上。
      警告：20x终止混合液中的成分叠氮化钠经口服摄入或皮肤接触具有毒性。配制、储存和操作叠氮化钠时应遵循制造商建议。如发生意外暴露，请查阅制造商提供的材料安全数据表。
  7. 当细胞达到对数中期生长阶段时，为每个待测时间点收集每种培养物2.5 OD600单位的细胞（例如，为分析三个时间点的蛋白丰度，共收集7.5 OD600单位）。在室温下以3,000 x g离心2分钟，使用15 ml锥形管收集细胞。
    注：1个OD600单位等于OD600为1.0时1 ml培养液中的酵母量。收获X个OD600单位所需培养物体积（V，单位为ml）可通过以下公式计算：V = X OD600单位 / 实测OD600。例如，收获OD600为1.0的7.5 OD600单位酵母培养物，需收集7.5 OD600单位 / 1.0 = 7.5 ml酵母培养物。
  8. 每2.5 OD600单位细胞用1 ml 30 °C（预热）的新鲜培养基重悬细胞沉淀（例如，7.5 OD600单位细胞使用3 ml培养基）。

2. 放线菌酮追踪实验

  1. 将酵母细胞悬浮液在30 °C金属浴中孵育5分钟以达到平衡。
  2. 准备一个计时器，从0:00开始计时。
  3. 开始环己酰亚胺追踪实验时，按下 "开始" 在计时器上。迅速但小心地执行以下步骤：
    1. 向第一个酵母细胞悬液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为 250 µg/ml例如， 加入37.5 µl浓度为20 mg/ml的环己酰亚胺储备液至3 ml细胞悬液中，短暂涡旋混匀。
      警告：环己酰亚胺对皮肤具有刺激性，经口摄入具有毒性。配制、储存和操作环己酰亚胺时应遵循生产商的建议。如发生意外接触，请参考生产商提供的材料安全数据表。
    2. 加入环己酰亚胺并涡旋后，立即转移950 µl（约2.4 OD）600 将添加了环己酰亚胺的酵母细胞悬液各1单位加入预先标记的微量离心管中，每管含50 µl预冷的20倍终止液。涡旋混匀微量离心管，置于冰上，直至所有样品收集完毕。
    3. 将酵母细胞悬液放回30 °C。
  4. 以规律的时间间隔，对剩余的每种酵母细胞悬液重复步骤 2.3.1 至 2.3.3例如， 每30秒一次，即在0:00向样本#1加入环己酰亚胺，0:30向样本#2加入，1:00向样本#3加入， 等等.).
  5. 在每个后续时间点，涡旋振荡酵母细胞悬液，并转移950 μl至含有50 μl预冷的20x终止液的已标记微量离心管中。涡旋振荡后将收集的细胞置于冰上。将15 ml锥形管放回30 °C加热块中。
    1. 例如，在添加环己酰亚胺后30分钟收集细胞（假设时间过程开始时向酵母细胞悬液中添加环己酰亚胺的时间间隔为30秒），在30:00时涡旋并从样品#1中取出950 μl细胞悬液。在30:30时对样品#2重复此操作，依此类推。
      注意：为防止酵母沉淀，在整个追踪过程中，每隔约5分钟对15 ml锥形管中的细胞悬液进行一次涡旋振荡。或者，也可将酵母细胞悬液置于持续振荡的水浴中，直至完成环己酰亚胺追踪实验。
  6. 当所有样品收集完毕后，在室温下以6,500 × g离心30秒，使收集的细胞沉淀。用移液器或抽吸法去除上清液。此时细胞已准备好进行碱裂解。或者，将细胞沉淀在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。

3. 碱性后蛋白质提取（改良自16,40）

  1. 向每个细胞沉淀中加入 100 µl 蒸馏水。通过反复吹打或涡旋振荡重悬细胞。
  2. 向每个样品中加入 100 µl 0.2 M NaOH。通过反复吹打或涡旋振荡混匀。
  3. 将悬浮细胞在室温下孵育 5 分钟。在此阶段，酵母细胞尚未裂解，蛋白质也未释放40。
  4. 在室温下以 18,000 x g 离心 30 秒，使细胞沉淀。通过移液或抽吸去除上清液。
  5. 为裂解细胞，向每个细胞沉淀中加入 100 µl Laemmli 上样缓冲液。通过反复吹打或涡旋振荡重悬细胞。
    注意：依次使用 NaOH 和 Laemmli 上样缓冲液处理细胞，可释放出适用于采用 Tris-甘氨酸电泳缓冲系统的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的蛋白质形式。
  6. 在 95 °C 下孵育 5 分钟，以充分变性蛋白质。
    注意：95 °C 孵育可能不适用于易发生聚集的蛋白质（e.g.，含多个跨膜区段的蛋白质）的分析。此类蛋白质在高温孵育时可能变得不溶41。因此，对于这类蛋白质的分析，应根据经验确定在较低温度（e.g.，37 °C - 70 °C）孵育 10 - 30 分钟。
  7. 在室温下以 18,000 x g 离心 1 分钟，使不溶性物质沉淀。上清液（溶解的提取蛋白）可直接用于 SDS-PAGE 分离及后续的蛋白质印迹（Western blot）分析。或者，可将裂解液储存于 -20 °C。

4. 代表性 SDS-PAGE 和 Western 印迹实验步骤（改编自16）

  1. 将蛋白质分子量标准品和经实验确定体积的裂解液上样至SDS-PAGE凝胶。
    注意：根据目标蛋白质的分子量选择SDS-PAGE凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的百分比。通常，较低百分比的凝胶更适合分离高分子量蛋白质。
  2. 以200 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部边缘。
  3. 在4 °C条件下，以20 V电压湿转60–90分钟，将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
  4. 将膜置于含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）中，在室温下摇动孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育进行封闭。
    注意：为防止膜在过夜孵育过程中发生微生物生长，建议在封闭液中加入叠氮化钠，终浓度为0.02%。
  5. 将膜与针对目标蛋白的特异性一抗在含0.1% Tween-20（TBS/T）和1%脱脂奶粉的TBS中于室温摇动孵育1小时。
  6. 在室温下用TBS/T摇动洗涤膜3次，每次5分钟。
  7. 将膜与合适的荧光染料偶联的二抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T中于室温摇动孵育1小时。
    注意：荧光染料对光敏感。因此，荧光染料偶联抗体的稀释液应在避光条件下配制，且膜与荧光染料偶联抗体的孵育以及后续洗涤步骤均应在避光容器（例如，铝箔包裹的容器）中进行。
  8. 在室温下用TBS/T摇动洗涤膜3次，每次5分钟。
  9. 使用LI-COR Odyssey CLx及Image Studio软件（或性能相当的成像设备和软件），按照制造商推荐条件对膜进行成像。
  10. 获取膜图像后，将膜与针对上样对照蛋白的特异性一抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T中于室温摇动孵育1小时。
  11. 在室温下用TBS/T摇动洗涤膜3次，每次5分钟。
  12. 将膜与合适的荧光染料偶联的二抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T中于室温摇动孵育1小时。
  13. 在室温下用TBS/T摇动洗涤膜3次，每次5分钟。
  14. 按照步骤4.9的方法对膜进行成像。

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结果

为了说明放线菌酮追踪实验方法，分析了模式酵母内质网相关降解（ERAD）底物 Deg1-Sec62（图1）的稳定性42-44。在ERAD过程中，质量控制型泛素连接酶将小分子蛋白泛素共价连接成链，并修饰定位于内质网（ER）膜上的异常蛋白。这些多聚泛素化蛋白随后从内质网中被移除，并由蛋白酶体——一种大型胞质蛋白酶——进行降解45。Deg1-Sec62蛋白在持续且异常地结合易位子（一种介导蛋白质转入内质网腔或膜中的通道）后，即被靶向降解43。类似地，哺乳动物载脂蛋白B（低密度脂蛋白的蛋白组分）在缺乏其脂质结合伴侣时，会持续结合内质网易位子，并通过相关机制被降解46-48。因此，对酵母细胞中Deg1-Sec62降解过程的研究可能有助于理解那些持续或异常结合易位子的蛋白的降解机制，这类底物暂称为ERAD-T（易位子相关型）底物43。

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讨论

本文介绍了一种分析蛋白质降解动力学的方法。该技术可广泛应用于多种通过不同机制降解的蛋白质。需要注意的是，环己酰亚胺追踪实验反映的是特定蛋白质稳态池的降解动力学。其他技术可用于分析特定蛋白质群体的降解动力学。例如，可通过脉冲追踪分析来监测新生多肽的降解命运55。在这类实验中，新生蛋白质被短暂脉冲标记（例如，使用放射性氨基酸）。随后可随时间追踪被标记的新生蛋白质丰度的变化（这种变化可能与稳态蛋白质丰度的变化一致，也可能不一致）。

放线菌酮追踪实验适用于分析较短时间内蛋白质的稳定性（即， 长达两小时）。在更长时间的过程中（即，数小时至数天），环己酰亚胺（cycloheximide）作为一种全局性翻译抑制剂，对细胞具有毒性，可能是由于泛素耗竭所致 56此外，长时间过程中的蛋白质稳定性分析更有可能受到蛋白质整体合成受损对目标蛋白质降解产生的间接效应的干扰。例如， 降解与目标蛋白降解相关的短寿命蛋白）。因此，其他技术（如脉冲追踪代谢标记实验）更适合研究长寿命蛋白的降解，可用于验证...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢鲁宾斯坦实验室现任和前任成员，为研究工作提供了支持性强且充满热情的科研环境。作者感谢耶鲁大学的马克·霍赫斯特拉瑟（Mark Hochstrasser）分享试剂与专业知识。E.M.R. 感谢康斯坦茨大学的斯特凡·克雷夫特（Stefan Kreft）和匹兹堡大学的詹妮弗·布伦斯（Jennifer Bruns），提供了宝贵的蛋白质动力学分析专业知识。本研究得到了美国国立卫生研究院基金（R15 GM111713）对 E.M.R. 的资助、鲍尔州立大学 ASPiRE 研究奖对 E.M.R. 的支持、鲍尔州立大学西格玛赛（Sigma Xi）分会向 S.M.E. 提供的研究奖励，以及鲍尔州立大学教务长办公室和生物系提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
所需酵母菌株、质粒、标准培养基和缓冲液成分
一次性硼硅酸盐玻璃管Fisher Scientific14-961-32可从多家制造商处获得
温度控制培养箱（例如 Heratherm 培养箱型号 IMH180点科学51028068可从多家制造商处获得
新不伦瑞克可互换式18毫米试管滚轴（试管滚筒）新不伦瑞克M1053-0450建议使用管式滚轴混合器过夜混匀  悬浮培养的酵母细胞起始培养物。或者，若无试管滚轴仪，也可使用置于温度控制培养箱中的平台摇床进行过夜起始培养。对于较大规模的培养物，可使用平台摇床或试管滚轴仪以维持细胞悬浮状态。
新不伦瑞克 TC-7 滚筒式摇床 120 V 50/60 Hz新不伦瑞克M1053-4004适用于试管滚轴混合器
SmartSpec Plus 分光光度计伯乐（Bio-Rad）170-2525可从多家制造商处获得
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 随设备出售的转子可容纳 1.5 和 2.0 ml 微量离心管。该转子可更换为可容纳 15 和 50 ml 锥形管的转子。
固定角转子 F-35-6-30，带盖及适配器，适用于离心机型号 5430/R，可容纳 15/50 ml 锥形管，6 位EppendorfF-35-6-30
15 毫升丝网印刷螺口管，17 × 20 毫米锥形，聚丙烯材质Sarstedt62.554.205可从多家制造商处获得
1.5 ml 柔性管，PCR 级洁净，天然微量离心管Eppendorf22364120可从多家制造商处获得
模拟干浴加热器Fisher Scientific1172011AQ建议准备两个加热设备（一个用于环己酰亚胺处理期间细胞的孵育，另一个用于煮沸裂解液以变性蛋白质）。或者，30 °可使用 37°C 水浴在环己酰亚胺存在下孵育细胞。 alternatively，可使用带加热板的煮沸水浴使蛋白质变性。
用于12个15 ml离心管的加热块Fisher Scientific11-473-70用于在放线菌酮存在下孵育细胞时与Dri-Bath加热器配合使用。
20个1.5 ml离心管用加热块Fisher Scientific11-718-9Q与Dri-Bath加热器配合使用，用于煮沸裂解液以进行蛋白质变性。
SDS-PAGE 电泳及转膜装置、电源、成像设备或用于 SDS-PAGE 及膜转移的暗室将根据实验室和应用的不同而有所差异
Western blot 成像系统（例如 Li-Cor Odyssey CLx 扫描仪和 Image Studio 软件Li-Cor9140-01将根据实验室和应用情况而异
EMD Millipore Immobilon PVDF 转印膜Fisher ScientificIPFL00010将根据实验室和应用的不同而有所差异
一抗（例如 磷酸甘油酸激酶（Pgk1）单克隆抗体，小鼠（克隆 22C5D8）Life Technologies459250将根据实验室和应用的不同而有所差异
二抗（例如 Alexa Fluor 680 标记的兔抗小鼠 IgG（H + L）Life TechnologiesA-21065将根据实验室和应用的不同而有所差异

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