蛋白质丰度反映了蛋白质合成与蛋白质降解的速率。本文介绍了在模式单细胞真核生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，芽殖酵母）中，利用环己酰亚胺追踪实验结合蛋白质印迹法分析蛋白质降解的方法。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质丰度的调控几乎对所有细胞过程都至关重要。蛋白质丰度反映了蛋白质合成速率与蛋白质降解速率的整合结果。许多用于检测蛋白质丰度的实验方法（例如单时间点的蛋白质印迹、流式细胞术、荧光显微镜或基于生长的报告基因检测等方法，无法区分翻译和蛋白降解对蛋白质水平的相对影响。本文介绍了在模式单细胞真核生物中，采用放线菌酮追踪结合蛋白质印迹的方法，以特异性分析蛋白质降解过程。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （芽殖酵母）。在此实验中，酵母细胞在翻译抑制剂环己酰亚胺存在下进行孵育。在加入环己酰亚胺后立即以及在特定时间点收集细胞等分试样。细胞经裂解后，裂解液通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用于各时间点蛋白质丰度的蛋白质印迹分析。环己酰亚胺追踪实验可实现对多种细胞蛋白质稳态群体降解动力学的可视化观察。该方法可用于研究蛋白质降解过程中的遗传需求以及环境因素的影响。
引言
蛋白质在几乎所有细胞过程中都发挥着关键作用。许多生理过程需要特定蛋白质（或多种蛋白质）在特定时间段内或特定条件下存在。因此，生物体会监测并调控蛋白质的丰度以满足细胞需求1。例如，细胞周期蛋白（调控细胞分裂的蛋白质）仅在细胞周期的特定阶段存在，而细胞周期蛋白水平的调控失常已被证实与恶性肿瘤的形成相关2。除了调控蛋白质水平以满足细胞需求外，细胞还利用降解性质量控制机制来清除错误折叠、未组装或其它异常的蛋白质分子3。蛋白质丰度的调控涉及大分子合成（转录和翻译）与降解（RNA降解和蛋白质水解）两方面的调节。蛋白质降解功能受损或过度均会导致多种病理状态，包括癌症、囊性纤维化、神经退行性疾病以及心血管疾病4-8。因此，蛋白质水解机制已成为多种疾病治疗中极具前景的靶点9-12。
在单一时间点对蛋白质进行分析（例如，通过蛋白质印迹13、流式细胞术14或荧光显微镜15）仅能提供蛋白质稳态丰度的快照，而无法揭示其合成与降解的相对贡献。类似地，基于生长的报告基因检测反映的是较长时间内蛋白质的稳态水平，但同样无法区分合成与降解各自的影响15–20。通过比较降解机制特定组分被抑制前后蛋白质丰度的变化，可间接推断降解过程对稳态水平的贡献（例如，通过药物抑制蛋白酶体活性
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方案
1. 酵母细胞的培养与收获
- 若不分析内源性酵母蛋白的降解动力学，则将目标酵母菌株转化入编码目的蛋白的质粒。可靠的酵母转化方法已有文献报道37。
- 将酵母接种于5 ml适当的培养基中（例如，用于维持转化细胞中质粒的选择性合成定义培养基（SD培养基），或用于非转化细胞的非选择性酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基）。在30 °C下振荡培养过夜。
注：30 °C是典型野生型实验室酵母菌株的最佳生长温度38。然而，由于某些突变酵母菌株在30 °C下不能最佳生长，且某些蛋白会发生温度依赖性降解，因此酵母细胞生长和放线菌酮追踪实验所用温度应通过实验确定39。 - 测定每种过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。
注：细胞可处于对数生长期或稳定期，但其密度应至少达到可在15 ml新鲜培养基中稀释至OD600 = 0.2的水平。 - 将过夜培养物用15 ml新鲜培养基稀释至OD600为0.2。
- 在30 °C下振荡培养酵母，直至细胞进入对数中期生长阶段（即，OD600介于0.8至1.2之间）。
- 在酵母细胞生长期间，进行以下操作以准备放线菌酮追踪实验：
- 设置一个可容纳15 ml锥形管的....
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结果
为了说明放线菌酮追踪实验方法，分析了模式酵母内质网相关降解（ERAD）底物 Deg1-Sec62（图1）的稳定性42-44。在ERAD过程中，质量控制型泛素连接酶将小分子蛋白泛素共价连接成链，并修饰定位于内质网（ER）膜上的异常蛋白。这些多聚泛素化蛋白随后从内质网中被移除，并由蛋白酶体——一种大型胞质蛋白酶——进行降解45。Deg1-Sec62蛋白在持续且异常地结合易位子（一种介导蛋白质转入内质网腔或膜中的通道）后，即被靶向降解43。类似地，哺乳动物载脂蛋白B（低密度脂蛋白的蛋白组分）在缺乏其脂质结合伴侣时，会持续结合内质网易位子，并通过相关机制被降解46-48。因此，对酵母细胞中Deg1-Sec62降解过程的研究可能有助于理解那些持续或异常结合易位子的蛋白的降解机制，这类底物暂称为ERAD-T（易位子相关型）底物43。
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讨论
本文介绍了一种分析蛋白质降解动力学的方法。该技术可广泛应用于多种通过不同机制降解的蛋白质。需要注意的是，环己酰亚胺追踪实验反映的是特定蛋白质稳态池的降解动力学。其他技术可用于分析特定蛋白质群体的降解动力学。例如，可通过脉冲追踪分析来监测新生多肽的降解命运55。在这类实验中，新生蛋白质被短暂脉冲标记（例如，使用放射性氨基酸）。随后可随时间追踪被标记的新生蛋白质丰度的变化（这种变化可能与稳态蛋白质丰度的变化一致，也可能不一致）。
放线菌酮追踪实验适用于分析较短时间内蛋白质的稳定性（即， 长达两小时）。在更长时间的过程中（即，数小时至数天），环己酰亚胺（cycloheximide）作为一种全局性翻译抑制剂，对细胞具有毒性，可能是由于泛素耗竭所致 56此外，长时间过程中的蛋白质稳定性分析更有可能受到蛋白质整体合成受损对目标蛋白质降解产生的间接效应的干扰。例如， 降解与目标蛋白降解相关的短寿命蛋白）。因此，其他技术（如脉冲追踪代谢标记实验）更适合研究长寿命蛋白的降解，可用于验证.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢鲁宾斯坦实验室现任和前任成员，为研究工作提供了支持性强且充满热情的科研环境。作者感谢耶鲁大学的马克·霍赫斯特拉瑟（Mark Hochstrasser）分享试剂与专业知识。E.M.R. 感谢康斯坦茨大学的斯特凡·克雷夫特（Stefan Kreft）和匹兹堡大学的詹妮弗·布伦斯（Jennifer Bruns），提供了宝贵的蛋白质动力学分析专业知识。本研究得到了美国国立卫生研究院基金（R15 GM111713）对 E.M.R. 的资助、鲍尔州立大学 ASPiRE 研究奖对 E.M.R. 的支持、鲍尔州立大学西格玛赛（Sigma Xi）分会向 S.M.E. 提供的研究奖励，以及鲍尔州立大学教务长办公室和生物系提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 所需酵母菌株、质粒、标准培养基和缓冲液成分 | |||
| 一次性硼硅酸盐玻璃管 | Fisher Scientific | 14-961-32 | 可从多家制造商处获得 |
| 温度控制培养箱（例如 Heratherm 培养箱型号 IMH180 | 点科学 | 51028068 | 可从多家制造商处获得 |
| 新不伦瑞克可互换式18毫米试管滚轴（试管滚筒） | 新不伦瑞克 | M1053-0450 | 建议使用管式滚轴混合器过夜混匀 悬浮培养的酵母细胞起始培养物。或者，若无试管滚轴仪，也可使用置于温度控制培养箱中的平台摇床进行过夜起始培养。对于较大规模的培养物，可使用平台摇床或试管滚轴仪以维持细胞悬浮状态。 |
| 新不伦瑞克 TC-7 滚筒式摇床 120 V 50/60 Hz | 新不伦瑞克 | M1053-4004 | 适用于试管滚轴混合器 |
| SmartSpec Plus 分光光度计 | 伯乐（Bio-Rad） | 170-2525 | 可从多家制造商处获得 |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | 随设备出售的转子可容纳 1.5 和 2.0 ml 微量离心管。该转子可更换为可容纳 15 和 50 ml 锥形管的转子。 |
| 固定角转子 F-35-6-30，带盖及适配器，适用于离心机型号 5430/R，可容纳 15/50 ml 锥形管，6 位 | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 毫升丝网印刷螺口管，17 × 20 毫米锥形，聚丙烯材质 | Sarstedt | 62.554.205 | 可从多家制造商处获得 |
| 1.5 ml 柔性管，PCR 级洁净，天然微量离心管 | Eppendorf | 22364120 | 可从多家制造商处获得 |
| 模拟干浴加热器 | Fisher Scientific | 1172011AQ | 建议准备两个加热设备（一个用于环己酰亚胺处理期间细胞的孵育，另一个用于煮沸裂解液以变性蛋白质）。或者，30 °可使用 37°C 水浴在环己酰亚胺存在下孵育细胞。 alternatively，可使用带加热板的煮沸水浴使蛋白质变性。 |
| 用于12个15 ml离心管的加热块 | Fisher Scientific | 11-473-70 | 用于在放线菌酮存在下孵育细胞时与Dri-Bath加热器配合使用。 |
| 20个1.5 ml离心管用加热块 | Fisher Scientific | 11-718-9Q | 与Dri-Bath加热器配合使用，用于煮沸裂解液以进行蛋白质变性。 |
| SDS-PAGE 电泳及转膜装置、电源、成像设备或用于 SDS-PAGE 及膜转移的暗室 | 将根据实验室和应用的不同而有所差异 | ||
| Western blot 成像系统（例如 Li-Cor Odyssey CLx 扫描仪和 Image Studio 软件 | Li-Cor | 9140-01 | 将根据实验室和应用情况而异 |
| EMD Millipore Immobilon PVDF 转印膜 | Fisher Scientific | IPFL00010 | 将根据实验室和应用的不同而有所差异 |
| 一抗（例如 磷酸甘油酸激酶（Pgk1）单克隆抗体，小鼠（克隆 22C5D8） | Life Technologies | 459250 | 将根据实验室和应用的不同而有所差异 |
| 二抗（例如 Alexa Fluor 680 标记的兔抗小鼠 IgG（H + L） | Life Technologies | A-21065 | 将根据实验室和应用的不同而有所差异 |
参考文献
- Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
- Amm, I., Sommer, T.,....
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