本实验方案旨在演示从小鼠冠状循环中分离和培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）的技术。一旦完成VSMCs的分离，即可将其用于多种标准的细胞培养技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
尽管从大血管中分离和培养血管平滑肌细胞（VSMCs）的技术已较为成熟，但我们旨在从冠状循环中分离并培养VSMCs。取出带有完整主动脉弓的心脏，通过逆行Langendorff灌流法，使用含有300单位/毫升II型胶原酶、0.1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和1 M CaCl2的消化液进行灌注。灌流液每15分钟收集一次，持续90分钟，经离心沉淀后重悬于接种培养基中，并接种至组织培养皿上。VSMCs通过表达SM22α、α-SMA和波形蛋白（vimentin）进行鉴定。该技术的主要优势之一是能够从小鼠冠状循环中分离VSMCs。尽管所获得的细胞数量较少可能限制其部分应用，但分离的冠状VSMCs仍可用于多种成熟的细胞培养技术和检测方法。利用基因修饰小鼠来源的VSMCs开展的研究，可进一步揭示与血管病理相关的结构-功能关系及信号转导过程。
引言
本方法的目的是从鼠类冠状动脉循环中分离血管平滑肌细胞（VSMCs），用于细胞培养及常规的细胞培养检测。我们开发该技术旨在评估糖尿病中血管重塑的分子机制。我们此前已报道，在糖尿病db/db小鼠模型的室间隔冠状小动脉中存在向内性肥厚性重塑1。由于鼠类室间隔冠状动脉组织量极为有限，对db/db小鼠和对照小鼠进行蛋白水平变化（例如 Western blot）的标准实验技术在实际操作中极为困难。此外，我们先前研究显示，血管紧张素受体阻滞剂（ARB）洛沙坦可减轻db/db小鼠中观察到的血管重塑2。因此，从冠状动脉循环中分离原代VSMCs，可使我们进一步研究糖尿病小鼠中VSMC表型变化或信号通路的激活情况，这些变化可能参与了不良冠状小动脉重塑过程。
大量研究利用从啮齿类动物主动脉分离的血管平滑肌细胞（VSMC）阐明了经典的信号通路，而非针对每个特定的血管床进行研究。然而，我们已证实，在db/db小鼠的冠状动脉、主动脉和肠系膜循环中存在血管床特异性的重构现象1，提示不同血管床中的VSMC可能存在差异。因此，有必要从各个血管床分别分离VSMC，以更深入地理解每类VSMC中发生的病理变化。目前已有多种不同的方法用于分离和培养主动脉VSMC；然而，迄今为止仅有一项研究报道了从小鼠冠状动脉循环中分离VSMC的方法3。Teng et al. 首次报道了从小鼠冠状动脉循环分离VSMC的技术；但我们对该方案进行了重大修改，因为原方法同时分离了内皮细胞。其他实验室也采用了Teng et al. 的方案来分离冠状动脉平滑肌细胞和气道平滑肌细胞4,5。我们所引入的改进措施将获得一群高度富集的小鼠冠状动脉来源的VSMC。
离体哺乳动物心脏的逆向灌流，即朗根多夫（Langendorff）技术，由奥斯卡·朗根多夫（Oscar Langendorff）于1897年建立6，至今仍被广泛用于心血管细胞的分离。本研究所采用的技术结合现代小鼠基因修饰方法的进步，为深入探究冠状循环中血管平滑肌细胞（VSMCs）的分子行为提供了有力工具。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：本研究遵循美国国立卫生研究院指南进行，并已获得全美儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 准备/设置
注意：该分离技术需要将两个Langendorff加热线圈并排安装在铁架台上，并与循环水浴装置并联连接。
- 打开循环水浴并调节温度，使Langendorff插管尖端的最终温度达到33–34 °C（由于管路中温度会下降6–7 °C，因此本实验设置的水浴温度为40 °C）。开启灌注泵，并将灌注速率设定为0.5 ml/min。
- 用50 ml 70%乙醇冲洗两个水套式加热线圈、连接管路和25号插管，随后用100 ml高压灭菌的超纯水冲洗，以清洁其表面。
- 使用注射器向加热线圈内推入空气以排空残留液体，并用10 ml不含酚红的Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗。将HBSS保留在加热线圈和管路中。
- 将一个装有室温、不含酚红HBSS的无菌10 ml鲁尔锁式注射器连接至管路。连接时确保管路和加热线圈内无气泡残留，否则在消化过程中可能产生气栓，从而对血管平滑肌细胞（VSMC）的分离造成不利影响。
- 将25号插管从加热线圈上取下，连接至另一个装有冰浴预冷、不含酚红HBSS的无菌10 ml注射器上。置于冰上保存，直至使用。另一根插管重复相同操作。
- 配制酶消化液。
- 根据特定批次的胶原酶II，称取适量以配制75 ml消化液，使终浓度为300单位/ml。
- 将胶原酶溶解于75 ml含酚红的HBSS中。随后向混合液中加入1.5 ml 0.1 mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂和75 µl 1 M CaCl2。
- 若立即使用消化液，则将其预热至37 °C；若暂不使用，则置于4 °C保存，最长不超过6小时。该溶液需每日新鲜配制。
- 配制终止液/接种培养基。
- 在500 ml高糖（4.5 g/L）DMEM培养基中加入100 ml热灭活胎牛血清（FBS）、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml非必需氨基酸、5 ml HEPES和1 ml普列霉素（primocin）。建议进行过滤除菌。
- 将终止液分装至12个15 ml锥形管中，每管6 ml，编号为A1–A6和B1–B6，并置于4 °C保存。另取50 ml终止液分装至一个50 ml锥形管中，放入37 °C培养箱备用。
注意：如需要，此步骤也可在细胞分离前一天完成。该终止液将在细胞分离后用作接种培养基。
- 准备两支1 ml注射器，每支配备30 G针头，并吸入100 µl肝素（1,000单位/ml）。
- 剪取一段5 cm长的5-0外科缝合丝线，在丝线上打一个松散的单结，使一端长度为另一端的两倍。将该结套在25号插管上，但暂不收紧。另一根25 G插管重复相同操作。
- 向四个35 mm无菌培养皿（编号1–4）中各加入2 ml无菌、冰浴预冷、不含酚红的HBSS，并置于冰上保存。
2. 安乐死、心脏分离与插管
- 在心脏分离前，确保消化液和50 ml锥形管中的终止液已预热。将装有HBSS的注射器（连接25 G套管）从冰上取出，放入安装在铁架台上的滴定管夹（或环形夹）中。
- 使用3%异氟烷麻醉小鼠。通过轻触每条后肢脚趾确认麻醉效果。若腿部出现抽动，表明小鼠尚未完全麻醉，需等待1分钟后再重复脚趾刺激测试。
- 用剪刀剪除颈部前方的毛发和皮肤，暴露颈静脉。接着用镊子小心去除颈静脉周围的脂肪组织。清除脂肪后，缓慢注射100 µl肝素（1,000单位/ml）。在静脉上放置外科海绵，以防止过度出血。
- 1分钟后，打开胸腔暴露心脏，用弯头镊子提起心脏，并用剪刀将其剪下，注意保留升主动脉至第一头臂干分支的完整性。立即将心脏放入盛有冰冷HBSS（不含酚红）的35 mm培养皿（#1）中冲洗。
注意：以下4个步骤需在解剖显微镜下进行。 - 将固定在铁架台上的25 G套管调整至45°角，使其尖端刚好位于培养皿#2中冰冷HBSS液面下方，并在解剖显微镜下清晰可见。将心脏转移至培养皿#2中。
- 使用Dumont镊子，通过钝性分离轻轻去除主动脉周围多余的脂肪组织，避免刺破或撕裂主动脉。然后用镊子将主动脉套入25 G套管上。
- 将套管沿主动脉向下引导，接近但不穿过主动脉瓣，以免破坏瓣膜完整性，从而影响逆行灌注效果。套管到位后，将预先打结的丝线滑过主动脉并收紧，再打第二个结，形成方结以固定心脏。
- 主动脉牢固结扎后，用连接在25 G套管上的注射器中的冰冷HBSS轻轻冲洗冠状循环中残留的血液。操作时注意不要施加过大压力，以免造成冠状动脉压力过高。仅需非常缓慢而轻柔地冲洗即可完成。在此轻柔冲洗过程中，也可观察是否实现无泄漏的主动脉插管。
- 打开灌注泵，开始HBSS流动。将连接心脏的25 G套管从装有HBSS的注射器上取下（注意保持套管接头内充满HBSS），并连接至预热的HBSS加热线圈。启动灌注泵，以0.5 ml/min的流速对心脏进行8分钟的灌注。
- 当第一颗心脏已插管并开始系统灌注后，对第二颗心脏重复步骤2.1–2.8。每颗心脏的分离操作需交错进行，因此需要仔细规划和掌握时间。
3. 消化
- 用HBSS冲洗后，将泵上现有的10 ml HBSS注射器更换为装有10 ml预热消化液的注射器。以0.5 ml/min的流速对每个心脏灌注消化液12分钟。此阶段产生的灌注液不收集，因其可能含有残留血液和内皮细胞。
- 12分钟后，将灌注速率调整为0.4 ml/min，并在心脏下方放置一个装有冷终止液的15 ml锥形管（A1或B1，分别对应每次消化的第一和第二个心脏），置于冰桶中，开始收集富含血管平滑肌细胞（VSMC）的灌注液。
- 15分钟后，将收集管更换为A2或B2管，并立即将A1和B1管在89 × g下离心10分钟。当泵上的消化液注射器中剩余液体少于1 ml时，应立即更换为新装满的10 ml消化液注射器。
- 离心后，吸除各收集管中的上清液，每管保留约0.5 ml。用2 ml温热的终止液（或铺板培养基）重悬A1管中的沉淀。将A1管的重悬液加入B1管中，并将该管置于37 °C培养箱中，盖子稍松。
- 重复步骤3.3和3.4，直至所有收集管（至A6和B6）使用完毕，总收集时间为90分钟。在消化进行至80分钟时，剪开心脏心尖部，冲洗出可能滞留在心室内的细胞，并将这些细胞分别收集至A6和B6管中。
注意：有时心脏会在90分钟前从套管脱落。若发生此情况，应立即取出心脏并放入含有2 ml消化液的无菌35 mm培养皿中。剪开心脏心尖部，并用消化液轻轻冲洗心脏。随后，将2 ml消化液通过无菌100 µm细胞滤网过滤至50 ml锥形管中，并加入A6或B6管中。 - 每次后续收集管（A2和B2）离心后，将重悬的VSMCs加入前一收集管（合并的A1和B1管）。同时注意避免泵中的消化液耗尽，并在整个消化过程中根据需要及时更换10 ml注射器。
- 所有收集管合并后，将富含VSMCs的悬液在89 × g下离心10分钟。
- 尽可能吸除收集管中的上清液。将剩余沉淀重悬于2 ml铺板培养基中，接种至一个35 mm培养皿。将培养皿置于37 °C培养箱中培养24小时。
4. 细胞培养
注意：在生物安全柜中完成剩余步骤。
- 24 小时后，轻轻吸去铺板培养基。培养物中通常会含有大量碎片。为洗涤细胞，加入 2 ml 温热的无菌 PBS，并在顺时针旋转培养皿的同时，轻轻用手指轻敲培养皿边缘。
- 旋转 360° 后，吸去 PBS，并重复洗涤一次。再次吸去 PBS，再加入 2 ml 无菌温热 PBS。在显微镜下检查培养皿，确保皿内几乎没有或完全没有碎片。此时也可确定细胞融合度。
- 若培养皿中仍有碎片残留，请重复步骤 4.2。若培养皿已无碎片，吸去 PBS，并加入 2 ml 温热铺板培养基。
- 24 小时后，再次用温热无菌 PBS 洗涤细胞，以去除培养物中任何残留的碎片或死细胞。吸去 PBS 后，在细胞上加入 2 ml 温热铺板培养基。
- 每天观察细胞，并每隔 48 小时更换新鲜预温的铺板培养基。此时，细胞可用于常规细胞培养检测。铺板后 4–5 天，血管平滑肌细胞（VSMCs）融合度应约为 80%，但可能需要长达 7 天时间才能优化操作流程。若进行后续传代，最多可按 1:4 比例传代至 35 mm 培养皿（或等效培养面积）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
由于本研究的冠状动脉VSMC分离技术具有新颖性，我们旨在确定细胞分离的纯度。小鼠冠状动脉VSMC根据其形态学特征及免疫荧光染色结果在传代至第2代前进行鉴定。根据首次洗涤后细胞在培养中的形态学表现，该分离方法可有效去除心肌细胞和内皮细胞。VSMC的形态可稳定维持至第2代（图1）。然而，仍存在成纤维细胞（包括外膜和间质成纤维细胞）污染的可能性。为排除这一潜在干扰因素，我们在第1至第2代时对分离的细胞进行了SM22α、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（均为VSMC标志物7,8）以及波形蛋白（vimentin，成纤维细胞标志物9）的染色检测（图2）。结果显示，这些标志物在第2代前未发生改变。此外，我们还证实，分离的细胞不表达CD31/PECAM（以人冠状动脉微血管内皮细胞作为阳性对照），表明采用本分离方案未出现内皮细胞污染。综上所述，本细胞分离方法可获得近乎纯的冠状动脉VSMC群体，可用于后续实验研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究的目的是改进现有的细胞分离方案，以提高从小鼠心脏中分离冠状血管平滑肌细胞的得率。血管平滑肌生物学领域的许多开创性工作均使用培养的大鼠主动脉平滑肌细胞完成，这些研究为调控VSMC增殖、迁移和肥大的分子机制提供了基础性认识7。然而，随着该领域的发展，人们逐渐认识到VSMC的表型和功能受到多种血管床特异性因素的调控。例如，与外周血管相比，冠状动脉表现出不同的功能反应，在损伤后呈现独特的生长模式，并具有一组独特的离子通道、受体和信号分子10,11。冠状血管床还暴露于独特的血流动力学力环境中，因为这些血管在心室收缩期会受到心肌收缩的压迫。我们近期的研究表明，在2型糖尿病db/db小鼠中，冠状微血管的重塑过程与主动脉和肠系膜阻力血管不同1,12。为了理解导致这些差异的分子机制，有必要开展使用低代次VSMC的体外研究。尽管目前已建立多种有效且可靠的方法用于分离和培养小鼠主动脉或肠系膜动脉VSMC，但迄今为止，仅有1项研究报道了从小鼠冠状循环中分离VSMC的方法3。
在本实验方案中，我们...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（R01HL056046 资助 PAL，K99HL116769 资助 AJT）以及全美儿童医院研究所（资助 PAL 和 AJT）提供支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M 溶液 | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM（高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺） | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100倍浓缩液 | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| 无菌细胞滤网，100 µm 尼龙网 | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon 聚苯乙烯培养皿（带盖），无菌，35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus 黑色丝线缝合线 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体（无酚红） | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体（含酚红） | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml 加热线圈，带脱气气泡捕获装置 | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus 泵 | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| 循环加热水泵 | 任何品牌均可 |
参考文献
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337(2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
