本实验方案旨在演示从小鼠冠状循环中分离和培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）的技术。一旦完成VSMCs的分离，即可将其用于多种标准的细胞培养技术。
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本文内容
摘要
摘要
尽管从大血管中分离和培养血管平滑肌细胞（VSMCs）的技术已较为成熟，但我们旨在从冠状循环中分离并培养VSMCs。取出带有完整主动脉弓的心脏，通过逆行Langendorff灌流法，使用含有300单位/毫升II型胶原酶、0.1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和1 M CaCl2的消化液进行灌注。灌流液每15分钟收集一次，持续90分钟，经离心沉淀后重悬于接种培养基中，并接种至组织培养皿上。VSMCs通过表达SM22α、α-SMA和波形蛋白（vimentin）进行鉴定。该技术的主要优势之一是能够从小鼠冠状循环中分离VSMCs。尽管所获得的细胞数量较少可能限制其部分应用，但分离的冠状VSMCs仍可用于多种成熟的细胞培养技术和检测方法。利用基因修饰小鼠来源的VSMCs开展的研究，可进一步揭示与血管病理相关的结构-功能关系及信号转导过程。
引言
本方法的目的是从鼠类冠状动脉循环中分离血管平滑肌细胞（VSMCs），用于细胞培养及常规的细胞培养检测。我们开发该技术旨在评估糖尿病中血管重塑的分子机制。我们此前已报道，在糖尿病db/db小鼠模型的室间隔冠状小动脉中存在向内性肥厚性重塑1。由于鼠类室间隔冠状动脉组织量极为有限，对db/db小鼠和对照小鼠进行蛋白水平变化（例如 Western blot）的标准实验技术在实际操作中极为困难。此外，我们先前研究显示，血管紧张素受体阻滞剂（ARB）洛沙坦可减轻db/db小鼠中观察到的血管重塑2。因此，从冠状动脉循环中分离原代VSMCs，可使我们进一步研究糖尿病小鼠中VSMC表型变化或信号通路的激活情况，这些变化可能参与了不良冠状小动脉重塑过程。
大量研究利用从啮齿类动物主动脉分离的血管平滑肌细胞（VSMC）阐明了经典的信号通路，而非针对每个特定的血管床进行研究。然而，我们已证实，在db/db小鼠的冠状动脉、主动脉和肠系膜循环中存在血管床特异性的重构现象1，提示不同血管床中的VSMC可能存在差异。因此，有必要从各个血管床分别分离VSMC，以更深入地理解每类VSMC中发生的病理变化。目前已有多种不同的方法用于分离和培养主动脉VSMC；然而，迄今为止仅有一项研究报道了从小鼠冠状动脉循环中分离VSMC的方法3。Teng et al. 首次报道了从小鼠冠状动脉循环分离VSM....
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方案
伦理声明：本研究遵循美国国立卫生研究院指南进行，并已获得全美儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 准备/设置
注意：该分离技术需要将两个Langendorff加热线圈并排安装在铁架台上，并与循环水浴装置并联连接。
- 打开循环水浴并调节温度，使Langendorff插管尖端的最终温度达到33–34 °C（由于管路中温度会下降6–7 °C，因此本实验设置的水浴温度为40 °C）。开启灌注泵，并将灌注速率设定为0.5 ml/min。
- 用50 ml 70%乙醇冲洗两个水套式加热线圈、连接管路和25号插管，随后用100 ml高压灭菌的超纯水冲洗，以清洁其表面。
- 使用注射器向加热线圈内推入空气以排空残留液体，并用10 ml不含酚红的Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗。将HBSS保留在加热线圈和管路中。
- 将一个装有室温、不含酚红HBSS的无菌10 ml鲁尔锁式注射器连接至管路。连接时确保管路和加热线圈内无气泡残留，否则在消化过程中可能产生气栓，从而对血管平滑肌细胞（VSMC）的分离造成不利影响。
- 将25号插管从加热线圈上取下，连接至另一个装有冰浴预冷、不含酚红HBSS的无菌10 ml注射器上。置于冰上保存，直至使用。另一根插管重复相同操作。
- 配制酶消化液。
- 根据特定批次的胶原酶II，称取适量以配制75 ml消化液，使终浓度为....
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结果
由于本研究的冠状动脉VSMC分离技术具有新颖性，我们旨在确定细胞分离的纯度。小鼠冠状动脉VSMC根据其形态学特征及免疫荧光染色结果在传代至第2代前进行鉴定。根据首次洗涤后细胞在培养中的形态学表现，该分离方法可有效去除心肌细胞和内皮细胞。VSMC的形态可稳定维持至第2代（图1）。然而，仍存在成纤维细胞（包括外膜和间质成纤维细胞）污染的可能性。为排除这一潜在干扰因素，我们在第1至第2代时对分离的细胞进行了SM22α、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（均为VSMC标志物7,8）以及波形蛋白（vimentin，成纤维细胞标志物9）的染色检测（图2）。结果显示，这些标志物在第2代前未发生改变。此外，我们还证实，分离的细胞不表达CD31/PECAM（以人冠状动脉微血管内皮细胞作为阳性对照），表明采用本分离方案未出现内皮细胞污染。综上所述，本细胞分离方法可获得近乎纯的冠状动脉VSMC群体，可用于后续实验研究。
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讨论
本研究的目的是改进现有的细胞分离方案，以提高从小鼠心脏中分离冠状血管平滑肌细胞的得率。血管平滑肌生物学领域的许多开创性工作均使用培养的大鼠主动脉平滑肌细胞完成，这些研究为调控VSMC增殖、迁移和肥大的分子机制提供了基础性认识7。然而，随着该领域的发展，人们逐渐认识到VSMC的表型和功能受到多种血管床特异性因素的调控。例如，与外周血管相比，冠状动脉表现出不同的功能反应，在损伤后呈现独特的生长模式，并具有一组独特的离子通道、受体和信号分子10,11。冠状血管床还暴露于独特的血流动力学力环境中，因为这些血管在心室收缩期会受到心肌收缩的压迫。我们近期的研究表明，在2型糖尿病db/db小鼠中，冠状微血管的重塑过程与主动脉和肠系膜阻力血管不同1,12。为了理解导致这些差异的分子机制，有必要开展使用低代次VSMC的体外研究。尽管目前已建立多种有效且可靠的方法用于分离和培养小鼠主动脉或肠系膜动脉VSMC，但迄今为止，仅有1项研究报道了从小鼠冠状循环中分离VSMC的方法3。
在本实验方案中，我们.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（R01HL056046 资助 PAL，K99HL116769 资助 AJT）以及全美儿童医院研究所（资助 PAL 和 AJT）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M 溶液 | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM（高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺） | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100倍浓缩液 | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| 无菌细胞滤网，100 µm 尼龙网 | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon 聚苯乙烯培养皿（带盖），无菌，35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus 黑色丝线缝合线 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体（无酚红） | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体（含酚红） | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml 加热线圈，带脱气气泡捕获装置 | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus 泵 | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| 循环加热水泵 | 任何品牌均可 |
参考文献
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al.
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