依次施加玻璃盖玻片评估小鼠晶状体压缩刚度：应变与形态测量分析

摘要

晶状体硬度随年龄增长而增加，这与老视有关。本实验方案介绍了一种简单且成本效益高的小鼠晶状体硬度测量方法。小鼠晶状体与人晶状体类似，均会随年龄增长而变硬。该方法具有较高精确性，且可适用于较大动物晶状体的测量。

摘要

晶状体是一个透明的器官，能够折射并聚焦光线，从而在视网膜上形成清晰的图像。在人类中，睫状肌收缩会改变晶状体的形状，增加其屈光力，以聚焦近处物体，这一过程称为调节。晶状体硬度随年龄增长而发生的变化与老视有关，老视即晶状体调节能力下降，进而导致需要佩戴阅读眼镜。尽管小鼠晶状体不具备调节功能，也不会发生老视，但小鼠模型可作为理解晶状体病理的重要遗传学工具，且小鼠表现出的加速衰老特征使得研究晶状体的年龄相关变化成为可能。本实验方案展示了一种简单、精确且成本效益高的方法，用于测定小鼠晶状体的硬度，该方法利用玻璃盖玻片对晶状体施加逐步增加的压力负荷。代表性数据证实，小鼠晶状体与人类晶状体类似，其硬度随年龄增长而增加。该方法具有高度可重复性，并有望扩展应用于对较大动物晶状体的力学测试。

引言

晶状体是位于眼球前房的一个透明且无血管的器官，负责将光线精确聚焦到视网膜上。一层称为晶状体囊的透明基底膜包裹着大量被前部单层上皮细胞覆盖的伸长纤维细胞^1,2。晶状体的终生生长依赖于赤道区上皮细胞持续不断地增殖并分化为新的纤维细胞，这些新形成的纤维细胞以同心圆方式逐层添加到先前世代的纤维细胞之上²。随着时间推移，晶状体纤维细胞发生压缩，导致晶状体中央形成一个坚硬的核心，称为晶状体核¹。调节（accommodation）定义为眼屈光力的屈光度变化，在人类中，当睫状肌收缩引起晶状体变形时，眼的屈光力真实增加，从而实现对近处物体的聚焦^3-5。在未调节的眼中，由于悬韧带纤维的张力作用，晶状体处于相对扁平的状态；当睫状肌收缩时，晶状体所受张力释放，导致晶状体赤道直径减小而轴向厚度增加。晶状体随年龄增长发生的变化会引起老视，即晶状体调节能力进行性下降，从而导致需要佩戴阅读眼镜。

多项研究已将老视与晶状体固有刚度随年龄增长而增加的现象联系起来^6-11。刚度定义为弹性物体在受力时抵抗形变的能力。已有多种方法被用于检测人眼晶状体的刚度，包括旋转压缩法^12-14、致动器压缩法¹⁵、探针压痕法¹⁶、动态力学分析法^6,10以及基于气泡的声辐射力法¹⁷。尽管小鼠晶状体不具备调节功能，也不会发生老视，但用于研究晶状体病变的小鼠模型仍具有重要价值，因为小鼠比大型动物更经济，遗传背景明确，且由于衰老速度快，其与年龄相关的改变更为迅速。少数研究采用压缩法检测了小鼠晶状体的刚度，并证实了刚度随年龄增长或特定基因干扰而发生变化^18-21。因此，小鼠晶状体是研究晶状体刚度随年龄变化的良好模型。

本方案描述了一种简单、低成本但精确且可重复的压缩方法，用于测定小鼠晶状体的刚度。该方法通过将玻璃盖玻片施加于晶状体，并结合体视显微镜和反射镜对晶状体进行拍照来实现。该方法利用易于制作和组装的装置，可获得可靠的应变和形态测量数据。代表性结果证实，小鼠晶状体的刚度随年龄增长而增加。

方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行，并经斯克里普斯研究所机构动物护理与使用委员会批准的方案实施。

1. 晶状体解剖

1. 根据美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议以及批准的机构动物使用规程对小鼠实施安乐死。
2. 使用弯头镊子摘除小鼠眼球。用镊子按压眼球周围组织，使眼球突出眼窝，然后用镊子将眼球从眼窝中拔出。将眼球转移至解剖皿中的新鲜1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 尽可能靠近眼球处剪断视神经。用精细直头镊子小心地从视神经穿出眼球后部的孔洞插入眼球内部。
4. 用剪刀从眼球后部向角膜边缘小心地做切口。啮齿类动物的晶状体约占眼球体积的30%。操作切口时应格外小心，镊子或剪刀不得插入过深，以免损伤晶状体。
5. 沿角膜与巩膜交界处至少环绕眼球半周进行剪切。
6. 轻压角膜，使晶状体通过步骤1.4和1.5所形成的开口从眼球中脱出。
7. 使用精细直头镊子小心去除仍附着在晶状体上的大块杂质。在进行刚度测量前，需对晶状体进行肉眼检查，确认是否存在损伤。

2. 刚度测量

1. 使用分析天平称量来自同一盒的至少10个盖玻片，计算盖玻片的平均重量。为保证一致性，所有实验应使用同一盒盖玻片。在实验开始前，将盖玻片和直角反射镜在室温下用1×PBS预湿至少2小时。
2. 将测量室（见图1）中加入65–75 ml的1×PBS。测量室由本单位机械加工车间使用有机玻璃（Plexiglas）制作，室内的凹槽通过钻床配合合适的钻头并设定至所需深度加工而成。晶状体在室温的1×PBS中可保持透明，直至力学测试结束。

图1：刚度测量腔室。 一张展示自制刚度测量腔室尺寸的照片，腔室内含有多种不同深度和形状的凹槽。直径为2 mm、距腔室边缘约13–14 mm的圆形凹槽（黄色箭头所示），深度分别为200 µm或300 µm，用于小鼠晶状体的测量。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 将直角反射镜以固定距离放置于腔室内，该距离相对于用于固定晶状体的凹槽保持不变。确保实验过程中反射镜不发生移动。
4. 使用持取镊子或弯头镊子小心地将解剖好的晶状体转移至测量腔室中。
5. 从正上方对未加载负荷的晶状体拍摄俯视图像。拍摄小鼠晶状体时使用30倍放大倍率，光源来自解剖显微镜底部以及左右两侧的光纤光源。将光纤光源的电源输出功率设置为最大光强的80%。根据环境光照、用户偏好及图像质量需要，可适当调节电源输出。
6. 通过直角反射镜拍摄未加载负荷晶状体的侧视图像。若相机未校准，需对焦拍摄反射镜边缘的照片。反射镜边缘长度为5 mm，该尺寸后续可用于确定像素/毫米比例，并作为图像中的标尺。
7. 将晶状体放入凹槽中，并确认晶状体已稳固且垂直地嵌入凹槽内。在加载负荷前拍摄一张晶状体图像。晶状体应以其前极或后极平稳地置于凹槽中。
8. 轻柔地将一片盖玻片放置在晶状体上。等待2分钟以允许蠕变发生，然后拍摄一张加载后晶状体的侧视图像。
9. 继续按照步骤2.8的方法逐片添加盖玻片，并在每次添加后按照步骤2.8拍摄侧视图像，直至总共施加10片盖玻片为止。
10. 移除所有盖玻片。等待2分钟后，拍摄移除全部盖玻片后的晶状体侧视图像（包括凹槽内和凹槽外的视野）。

3. 晶状体核测量

1. 为确定晶状体核的大小，将晶状体转移至盛有1x PBS的洁净培养皿中。
2. 使用精细直头镊子轻轻去除晶状体的囊膜。
3. 通过戴手套的手指轻轻滚动晶状体，使皮质纤维细胞脱落。剩余的晶状体核触感类似坚硬的玻璃珠。此方法适用于从1月龄开始的成年动物晶状体核的分离。由于分离得到的晶状体核为刚性结构，因此无法使用本方法进行进一步的力学测试。
4. 在培养皿中用1x PBS轻轻冲洗晶状体核。
5. 将晶状体核重新放回测量室（不要放入凹槽内），并通过直角反射镜拍摄晶状体核的图像。

图 2：由盖玻片压缩的小鼠晶状体。 （A）实验装置的示意图与（B）照片，显示一个2月龄小鼠晶状体置于测量室中深度为200 µm的凹槽内，测量室中充满1× PBS。使用安装在解剖显微镜上的直角反射镜和数码相机，采集盖玻片压缩过程中晶状体的图像。（C）在逐步增加盖玻片数量进行压缩时，对2月龄野生型小鼠晶状体进行矢状面观察的照片，提供了用于测量轴向和赤道直径以及计算基于盖玻片压缩测试过程中轴向和赤道应变的原始数据。晶状体在盖玻片中的反射有时可见（在单个盖玻片图像中最清晰）。进行测量时，应忽略反射像，并以晶状体的顶点为测量终点。（D）2月龄野生型小鼠晶状体在压缩后的矢状面照片以及分离出的晶状体核。压缩后晶状体与分离的晶状体核均置于凹槽之外。比例尺：1 mm。本图改编自 Gokhin, et al. PloS one, 2012¹⁹。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 图像分析

1. 使用 ImageJ 或类似软件，在加载前及每次加载步骤后测量晶状体的赤道面直径和轴向直径。测量每个晶状体核的直径。晶状体核近似球形，因此在任意方向上的测量均可^19,21。
2. 通过加上所用凹槽的深度来校正晶状体的轴向直径。在测量腔中，凹槽遮挡了晶状体轴向厚度的 200 µm（2月龄小鼠晶状体）或 300 µm（4月龄和8月龄小鼠晶状体）。
3. 利用公式 ε = (d - d₀) / d₀ 计算晶状体的轴向和赤道面应变，其中 ε 表示应变，d 为特定载荷下的轴向或赤道面直径，d₀ 为零载荷下对应的轴向或赤道面直径。
4. 绘制轴向和赤道面应变随施加载荷（单位：mg）变化的函数图。
5. 绘制轴向、赤道面及核直径的变化图。通过将轴向直径除以赤道面直径，计算并绘制晶状体的长宽比（aspect ratio）。
6. 使用公式 体积 = 4/3 × π × r_E² × r_A 计算并绘制晶状体体积，其中 r_E 为赤道面半径，r_A 为从第2.6步拍摄图像中测得的轴向半径。该公式假设晶状体为扁球体（椭球体）^1,22。
7. 使用公式 体积 = 4/3 × π × r_N³ 计算并绘制晶状体核体积，其中 r_N 为从第3.5步拍摄图像中测得的晶状体核半径。该公式假设晶状体核为球体^19,21。
8. 计算并绘制核体积分数，即核体积与晶状体总体积的比值。

结果

测量了2个月、4个月和8个月大小鼠晶状体的硬度和尺寸。所有小鼠均为来自TSRI动物繁育中心的纯系C57BL6背景的野生型动物，每个晶状体上加载了1至10个盖玻片。通过测量每增加一个盖玻片后晶状体的轴向和赤道径线直径，并将每次直径的变化归一化至相应的无负载直径，从而计算出轴向和赤道方向的应变。每个年龄组测试了8个晶状体，结果以平均值±标准误表示。如先前报道¹⁹，轴向应变是施加负载的对数函数（图3A）。在最大施加负载下，轴向和赤道应变均表现出具有统计学意义的随年龄增长而降低的趋势（图3），表明小鼠晶状体随年龄增长而变硬。相同年龄晶状体之间的应变测量结果具有高度可重复性，这由较小的标准误所证实。

本实验期间采集的图像数据还被用于确定晶状体的其他若干形态学特征（图4）。如预期所示，晶状体的轴径、赤道直径和体积均随年龄增长而增加（

讨论

使用该方法测量晶状体刚度时需考虑几个关键因素。首先，盖玻片相对于培养腔底部以略微倾斜的角度（8 - 8.5°）施加于晶状体（θ）。这将施加一个非常小的赤道方向分力，而非完全沿轴向加载。然而，由于 sin θ ≈ 0.1¹⁹，该赤道方向的载荷被认为可忽略不计。如果该方法被用于更大的晶状体，需测量盖玻片与培养腔底部之间的角度，以确定在应变计算中是否需要考虑赤道方向的载荷。其次，在每次添加盖玻片后，必须让晶状体充分平衡至关重要。等待2分钟的时间允许时间依赖性形变（即，蠕变）的发生，从而确保仅在晶状体达到平衡形态时进行图像采集¹⁹。第三，本方案已优化用于在较宽载荷动态范围内测量小鼠晶状体的压缩应变。在预实验中，施加1,293 mg的载荷（即，十个18 × 18 mm的盖玻片）可使小鼠晶状体达到最大应变，超过此载荷后进一步增加载荷不会引起明显的额外形变。这是由于晶状体核具有刚性，其在压缩下几乎不发生形变¹⁹。第四，该方案可避免不可逆的组织损伤。在先前发表的实验中，重复加载后未观察到小鼠晶状体机械性能的变化，表明该方法不会对晶状体造成损伤^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精细尖头直头镊子	Fine Scientific Tools	11252-40
显微解剖剪刀，直刃	Fine Scientific Tools	15000-00
弯头镊子	Fine Scientific Tools	11272-40
持取镊子	Hammacher	HSC 702-93	可选
解剖皿	Fisher Scientific	12565154
60 mm 培养皿	Fisher Scientific	0875713A
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	14190
18 × 18 mm 玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542A
带凹槽用于固定镜片的测量室			定制（见 图 1）
直角反射镜	Edmund Optics	45-591
光源	Schott/Fostec	8375
带照明的解剖显微镜	Olympus	SZX-ILLD100	配备 SZ-PT 摄影管
数码相机	Nikon	Coolpix 990