盖玻片序贯应用评估鼠标透镜的抗压刚度:应变和形态分析

摘要

与年龄相关的晶状体僵硬增加与老花眼有关。该协议描述了一种简单、经济高效的小鼠晶状体刚度测量方法。老鼠镜片和人类镜片一样，会随着年龄的增长而变得更硬。这种方法很精确，可以适用于大型动物的晶状体。

摘要

眼透镜是透明的器官，折射和光聚焦，以形成在视网膜上的清晰图像。在人类中，睫状肌收缩变形的透镜，从而增加在透镜"光功率集中于附近的物体，被称为住宿的方法。在镜头的刚度与年龄相关的变化都与老花眼​​，在适应镜头的能力降低，以及由此延伸，需要老花镜。尽管鼠标镜头不适合或开发老花眼，小鼠模型可以为理解镜头病症的宝贵基因工具，并在小鼠中观察到加速老化能够在镜头年龄相关的变化研究。这个协议表明用于确定鼠标透镜刚度，用玻璃盖玻片依次施加压缩负荷增大到透镜的简单，精确和成本效益的方法。有代表性的数据证实，鼠标透镜随着年龄的增长变得更硬，像人类的镜头。这种方法是高度可重复的，并且可以潜在地扩大到从较大的动物机械地测试镜片。

引言

晶状体是眼睛前房中一个透明的无血管器官，负责将光线精细聚焦到视网膜上。透明的基底膜（称为晶状体囊）围绕着大量细长的纤维细胞，这些细胞被前单层上皮细胞覆盖^1,2。晶状体的终生生长取决于晶状体赤道上皮细胞的持续增殖和分化为新的纤维细胞，这些纤维细胞以同心方式添加到前几代纤维细胞上²。随着时间的推移，晶状体纤维单元会发生压实，从而在晶状体中间形成一个称为晶核¹ 的刚性中心。调节，定义为眼睛光度的屈光度变化，发生在人类中，当睫状肌收缩使晶状体变形并允许光功率真正增加以聚焦近处物体^{时 3-5}。在未适应的眼睛中，由于带状纤维的张力，晶状体保持在相对扁平的状态。当睫状肌收缩时，晶状体上的张力被释放，导致晶状体赤道直径减小和轴向厚度增加。与年龄相关的晶状体变化会导致老花眼，即晶状体调节能力的进行性丧失，从而导致需要老花镜。

几项研究将老花眼与与年龄相关的晶状体内在硬度增加联系起来^6-11。刚度定义为弹性物体在施加载荷下变形的阻力。已经使用了多种方法来检查人体晶状体的刚度，包括自旋压缩^12-14、致动器压缩¹⁵、探针压痕¹⁶、动态力学分析 ^6,10 和基于气泡的声辐射力¹⁷。虽然小鼠晶状体不适应或发展为老花眼，但用于晶状体病理学的小鼠模型是有价值的工具，因为小鼠比大型动物更便宜，遗传特征良好，并且由于快速衰老而经历与年龄相关的加速变化。一些研究使用压缩方法检查了小鼠晶状体刚度，并证明了由于衰老或靶向遗传破坏而导致的晶状体刚度变化^18-21。因此，小鼠晶状体是研究与年龄相关的晶状体刚度变化的良好模型。

该协议描述了一种简单且廉价但精确且可重复的压缩方法，该方法基于将玻璃盖玻片应用到晶状体上，并结合通过解剖显微镜和镜子拍摄晶状体来确定小鼠晶状体刚度。该方法使用易于制造和组装的设备产生可靠的应变和形态测量数据。代表性结果证实，小鼠晶状体的刚度随着年龄的增长而增加。

方案

所有动物的程序均按照建议的指南中照顾和实验动物使用由卫生和批准议定书下国家研究院​​的机构动物护理和使用委员会在斯克里普斯研究所进行。

1.解剖镜

1. 根据健康"指南实验动物的护理和使用"的国家机构和认可机构使用动物的协议安乐死的建议只。
2. 去核的使用弯钳小鼠眼球。按压围绕与镊子眼组织带来的眼睛从插座中，然后从与镊子插座摘去眼。在解剖盘传送眼睛到新鲜的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
3. 切断视神经接近眼球越好。轻轻地，小心地穿过孔插入wher细直镊子进入眼球E中的视神经退出的后路。
4. 小心使用剪刀切开成从后角膜边缘的眼球。啮齿动物的透镜占据的眼睛的〜30％。请仔细这些切口，不插入镊子或剪刀太深进入眼内，以免损坏镜头。
5. 沿角膜和巩膜在围绕眼球至少一半的方式之间的接合处切割。
6. 轻轻地推在角膜上通过在步骤1.4和1.5所取得的开口以除去从眼睛的晶状体。
7. 使用精尖镊子直小心删除仍然连在镜头任何大的杂物。目视检查是否有损坏镜头在进行硬度测量之前。

2.测量刚度

1. 从使用分析天平同一框体重至少10盖玻片。查找的平均重量的盖玻片。为了保持一致性，使用盖玻片所有实验的同一个盒子。预湿盖玻片和直角镜在1×PBS中在室温下至少2小时开始实验之前。
2. 填测量室（参见图1）与65 - 75毫升1×PBS中。测量室由一个内部的机械车间做出来有机玻璃，并在该室草皮被钻床设置为所需的深度与适当的钻头制成。透镜在1×PBS中保持透明，在室温下机械测试的持续时间。

图1:刚度测量室示出了各种不同的深度和形状的草皮层的定做刚度测量室的尺寸的照片。圆形凹坑是200微米或300微米深（黄色箭头）被用于对小鼠透镜的测量结果。草皮是2毫米直径和〜13-从腔边缘14毫米请点击此处查看该图的放大版本。

3. 放置直角镜进入室在从将被用于保持透镜的草皮层的恒定距离。确保镜在实验过程中不动。
4. 转移解剖镜头测量室仔细抓住钳或弯钳。
5. 取卸载透镜的顶视图图片从直接开销。取小鼠透镜照片在30X放大倍数下通过从解剖显微镜（底部），在左，右两侧光纤光源照明。设置光纤电源到最大光强度的80％。根据需要调整基于环境照明，用户偏好和画质电源输出。
6. 取卸载透镜的侧视图的图片，这可以通过里可以看到GHT角度的镜子。如果相机未校准，采取在聚焦镜边缘的图片。镜边缘为5mm长，并且该测量可以在以后被用来确定像素/毫米，并作为图像中的比例尺。
7. 镜头放置到草皮，并确认镜头在草皮安全，直就位。取装载前透镜的图象。该镜头应在其前或后极部草皮静养。
8. 轻轻地放在1盖玻片上的镜头。等待2分钟，以允许蠕变，并采取装载镜头的另一侧查看图片。
9. 继续加入盖玻片如在步骤2.8和服用侧视图图片加入每个盖玻片的如在步骤2.8之后，直到总共10盖玻片被应用。
10. 删除所有盖玻片。等待2分钟，并除去所有盖玻片后取透镜（内部和外部的草皮的）的侧视图图片。

3.晶状体核测量

1. 要determ的INE晶状体核大小，移动镜头到一个干净的培养皿中充满了1X PBS。
2. 用细镊子直轻轻解封镜头。
3. 脱落的皮质纤维细胞通过滚动手套的手指之间的镜头。剩下的晶状体核会感觉像一个硬的大理石。使用此过程来隔离成人镜头细胞核起1个月的年龄。因为分离的核是一个刚体，不能用此描述的方法进行晶状体核的进一步的机械测试。
4. 轻轻漂洗在培养皿在1×PBS中的晶状体核。
5. 放置晶状体核放回测量室（未在草皮），并采取晶状体核的图像通过直角反射镜。

图2:恩小鼠镜头由盖玻片压缩 （一）示意图和（B）的照片perimental设置表示在填充用1×PBS测量室200微米深草皮一个2个月大的小鼠透镜。直角反射镜和安装在解剖显微镜的数字照相机中使用由盖玻片压缩过程中收集透镜的图像。 （C）的通过连续增加盖玻片的数字压缩的2个月大的野生型透镜的矢状次照片用于测量轴向和赤道直径和基于盖玻片压缩测试期间计算轴向和赤道菌株提供的原始数据。透镜的反射有时可以在盖玻片（最清晰可见的1盖玻片图像中的）中看到。当进行测量时，忽略该反射并测量到透镜的顶点。 （D）的2个月大的野生型镜头后的压缩和隔离晶状体核矢状美景照片。该压缩后的镜头和孤立的核正坐在草皮之外。比例尺1毫米。这个数字是从Gokh修改在， 等 公共科学图书馆·之一 ，2012 ^19。 请点击此处查看该图的放大版本。

4.图像分析

1. 装货前和使用ImageJ或类似软件的每一装载步骤后测量镜头赤道和轴向的直径。测量每个晶状体核的直径。晶状体核是近球形所以在任何方向的测量就足够了^19,21。
2. 通过增加使用的草皮的深度修正镜头直径轴。在测量室中，草皮层遮蔽了透镜的轴向厚度为200微米（2个月大的小鼠透镜）或300微米（4月龄和8个月大的小鼠镜头）。
3. 使用方程，ε=（D - D _0）计算从透镜直径测量的轴向和赤道菌株/天_0，其中ε为应变，d为轴向或电子邮件quatorial直径在给定的负载，而d ₀是在零负载的相应的轴向或赤道直径。
4. 画出轴向和赤道株作为施加的负荷（毫克）的功能。
5. 绘制轴，赤道和核直径。计算并通过由赤道直径除以轴径绘制透镜纵横比。
6. 计算和使用等式绘制透镜体积，体积= 4/3×π×R _e ² _的 ×R _A，其中R _e为赤道半径和R _a是从在步骤2.6拍摄的照片测量的轴向半径。这个公式假定镜头是一个扁球体（椭球^）1.22。
7. 计算并用公式，体积= 4/3×π×R _N ^3，其中R _N是透镜核的半径为从在步骤3.5拍摄的照片测量绘制核体积。这个公式假定晶状体核我SA球^19,21。
8. 计算并绘制细胞核部分作为核体积与透镜体积的比值。

结果

刚度和2-，4-和8个月大的小鼠的镜片的尺寸进行了测量。小鼠从TSRI动物育种设施获得的纯C57BL6菌株背景所有野生型动物，并且每一个透镜装载有1至10个盖玻片。轴向和赤道株计算为通过测量透镜的轴向和赤道直径在加入每个盖玻片的后，再归一直径为相应的卸载每个直径变化的施加载荷的功能。从每个年龄八个透镜进行了测试，结果表示为平均值±标准误差。如图先前^19，轴向应变是施加的载荷（ 图3A）的对数函数。有一个在最大施加载荷（ 图3）下轴向和赤道菌株具有统计学显著年龄依赖性降低，表明该鼠透镜随年龄变硬。圣雨测量结果在相同年龄的透镜高度重现，由小标准误差所证明。

该实验中收集的图像数据也被用来确定几个其他透镜的形态特征（ 图4）。正如预期的，轴向和赤道直径和透镜体积与年龄（ 图4A，4B和4D）增加。纵横比...

讨论

使用这种方法来衡量镜片硬度时，有几个关键因素。 （ - 8.5°8）相对于所述腔室（θ）的底部第一，盖玻片在略微倾斜的角度施加到透镜。这将适用于负载的非常小的组分平展，而不是轴​​向。然而，这种赤道负载可以忽略不计，因为罪θ≈0.1 ^19。如果此方法适于大透镜，盖玻片到腔室的底部的角将需要被测量以确定赤道负载是否应计入应变计算。其次，它是重要的，以允许透镜到加法每个盖玻片的后平衡。为2分钟的等待期间允许取决于时间的变形（ 即 ，蠕变）发生，使得当透镜处于一种平衡状¹⁹的图片仅服用。第三，该协议是用于测量M上压应变优化乌斯横跨负荷的宽动态范围的透镜。在试点研究中，1293毫克（ 即十18×18mm的盖玻片）施加的载荷压缩鼠标透镜到最大应变，超过此负载增加不会引起明显的进一步变形。这是由于刚性晶状体核不压缩下¹⁹略微变形的存在。四，本协议避免了不可逆的组织损伤。在先前公布的实验中，在重复加载观察到的小鼠镜片的机械性能没有变化，这表明该方法不会损坏镜头^19。当机械地测试不同的物种或突变体透镜镜片，中试应做通过重复步骤2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细尖直镊子	Fine Scientific Tools	11252-40
显微解剖剪刀，直边	Fine Scientific Tools	15000-00
弯曲镊子	Fine Scientific Tools	11272-40
抓握钳	Hammacher	HSC 702-93	可选
解剖盘	Fisher Scientific	12565154
60 mm 培养皿	Fisher Scientific	0875713A
1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Life Technologies	14190
18 x 18 mm 玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542A
带有草皮的测量室，用于固定镜片			定制（见<强>图 1）
直角镜	Edmund Optics	45-591
光源	Schott/Fostec	8375
照明解剖显微镜	奥林巴斯	SZX-ILLD100	带 SZ-PT 光电管
数码相机	尼康	Coolpix 990