体内 生物传感器追踪非凋亡性半胱天冬酶活性 果蝇

摘要

为了在整体动物中检测含有低水平半胱天冬酶（caspase）活性的健康细胞，研究人员为黑腹果蝇（Drosophila）开发了高灵敏度的生物传感器，命名为CaspaseTracker。在无死亡刺激条件下、经优化培养的成年动物体内各内脏器官的长寿健康细胞中，均可检测到依赖半胱天冬酶的生物传感器活性。

摘要

半胱天冬酶（caspases）通过其蛋白水解活性，在介导细胞凋亡性死亡过程中发挥关键作用。当细胞中半胱天冬酶的活性被激活至现有技术可检测的水平时，通常认为细胞将在短时间内发生凋亡。半胱天冬酶可切割多种功能性和结构性组分，从而在数分钟内导致细胞迅速而彻底的破坏。然而，越来越多的证据表明，在正常健康细胞中，相同的半胱天冬酶可能具有其他功能，推测其酶活性处于较低水平。目前，对非凋亡性半胱天冬酶活性的研究受到检测低水平酶活性以及追踪细胞最终命运的技术困难所限制。 体内在此，我们展示了超灵敏的半胱天冬酶（caspase）报告系统CaspaseTracker的应用，该系统可对完整生物体内经历过caspase活性的细胞进行永久性标记。 体内 双色CaspaseTracker生物传感器用于 黑腹果蝇 瞬时表达红色荧光蛋白（RFP）以指示近期或正在进行的caspase活性，而在过去任何时间点曾经历caspase活性但未死亡的细胞则永久表达绿色荧光蛋白（GFP）。重要的是，这种caspase依赖的 体内 生物传感器可快速揭示成年果蝇各器官系统组织中非凋亡性半胱天冬酶（caspase）活性的存在。通过整体解剖单只果蝇，可在健康细胞中检测到该生物传感器的活性，其分布遍及脑、肠道、马尔皮基氏管、贲门、卵巢导管及其他组织。CaspaseTracker能够检测长寿细胞中的非凋亡性caspase活性，因为即使在caspase激活后至少10天，仍可在成年神经元及其他组织中检测到生物传感器信号。该生物传感器是揭示活体动物中非凋亡性caspase活性功能及其分子机制的重要工具。

引言

Caspase 是一类半胱氨酸蛋白酶，通过切割细胞内多种蛋白质中关键的天冬氨酸残基来介导细胞凋亡。例如，起始型 caspase 可激活效应型 caspase，解除对DNA核酸酶的抑制，切割细胞骨架组分，并改变细胞膜的脂质组成，从而迅速瓦解细胞，促进邻近细胞对死亡细胞的识别与吞噬清除^1-4。据估计，人体每天有数十亿个细胞死亡，而凋亡是化疗诱导肿瘤细胞死亡的重要机制之一⁵。另一类 caspase 可通过不同于凋亡的途径引发细胞死亡，进而激活先天免疫反应⁶。因此，目前大多数关于 caspase 的研究主要集中在其促死亡功能上。

有趣的是，该领域的早期证据表明，同一种半胱天冬酶（caspase）在促进细胞死亡的同时，也具有非死亡相关的功能。开创性研究已证实，caspase参与健康细胞中多种多样的细胞功能，包括在胚胎发生过程中调控细胞增殖和迁移^7-9。在果蝇（Drosophila）中，caspase参与精子细胞的个体化过程^10,11，在小鼠中可阻断另一种坏死性凋亡（necroptotic）细胞死亡通路^12,13，并在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中参与microRNA的加工过程^14,15。在寿命可能最长的细胞——神经元中，caspase及其他凋亡相关分子机制被认为通过修剪突触末梢来调控神经元活....

方案

1. CaspaseTracker 果蝇的制备

1. 为准备用于实验的 CaspaseTracker (DQVD) 果蝇，进行如下杂交：UBI-CaspaseTracker × G-TRACE（UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi>Stop>GFP-nls），将7–10只携带由泛素启动子驱动的半胱天冬酶生物传感器底物mCD8-DIAP1-Gal4³⁵的雌性（或雄性） virgin 果蝇与相同数量的G-TRACE雄性（或雌性）果蝇一同转移。G-TRACE果蝇具有第二染色体CyO平衡子，以避免G-TRACE（UAS-RFP、UAS-FLP和Ubi>Stop>GFP-nls）纯合组合导致的致死性³⁴。将果蝇置于装有新鲜酵母糊作为蛋白质来源的新鲜培养基小瓶中。
2. 在18 °C下培养果蝇5至7天（最长不超过2周），随后从瓶中移除亲代果蝇，以防止新孵化的子代过度拥挤，并用于建立新的繁殖小瓶。
3. 继续在18 °C下培养，直至子代果蝇羽化。选择具有正确CaspaseTracker基因型的非-CyO（非卷翅）子代，这些子代同时携带CaspaseTracker和G-TRACE转基因元件³⁵。
4. 同时，平行培育对照用的非转基因亲本w118果蝇以及半胱天冬酶不敏感型（DQVA）果蝇，以验证CaspaseTracker的RFP和GFP荧光特异性。....

结果

CaspaseTracker 能够在正常健康细胞中检测半胱天冬酶（caspase）活性，其原理依赖于两个关键组分（图1a）。第一个组分是一种由146个氨基酸组成的可被caspase切割的多肽，该多肽参照caspase生物传感器Apoliner构建而成（图1b）²⁸。该多肽来源于DIAP1（Drosophila 凋亡抑制因子），其中包含一个天然存在的caspase切割位点，在细胞凋亡过程中通常由caspase DrICE进行切割^42,43。DrICE在哺乳动物中的同源物为caspase-3，能够切割大多数已知的细胞底物^4,32。与caspase的典型特征一致，DIAP1及其衍生多肽在caspase识别序列17-DQVD-20中的特定天冬氨酸（Asp20）之后被切割；将必需的Asp20残基突变为丙氨酸（Ala）（即DQVA）可完全阻断切割反应^42,43。类似于Apoliner²⁸，该.......

讨论

本文阐述了CaspaseTracker的构建及其内部工作机制，该工具可用于检测健康组织中广泛存在的基础性caspase活性。体内检测非凋亡性caspase活性的关键步骤包括：1）构建携带生物传感器转基因的果蝇；2）通过适当的对照验证caspase特异性报告基因功能；3）练习解剖技术，以观察成年Drosophila的全部内部器官系统；4）区分生物传感器信号与自发荧光干扰信号。

为了防止生物传感器产生任何抑制半胱天冬酶（caspase）的活性，对作为caspase特异性传感器的天然可被caspase切割的多肽进行了改造。此外，还进行了其他修饰以避免Gal4转录因子的快速降解，并插入了表位标签。我们还描述了果蝇整体器官的解剖、免疫染色、样品封片以及利用共聚焦显微镜检测果蝇组织中非凋亡性caspase活性的方法。

尽管 CaspaseTracker 非常适合检测在低水平半胱天冬酶活性下存活的细胞，但它并不能实时报告酶活性，因为该生物传感器需要数小时才能被激活。然而，我们尚未确定其检测所需的最短时间，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
耗材与试剂
Vectashield	Vector Products	H-1000	封片介质
镊子	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont 镊子，生物级，不锈钢
悬滴玻片	Fisher Scientific	12-565B	玻璃载片
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA 染料
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	肌动蛋白染料
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	发育研究杂交瘤库（DSHB）	抗体注册编号： AB_528218	用于染色黑腹果蝇（Drosophila）泛神经元 ELAV 蛋白
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	用于染色活化的 caspase-3 片段
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	Life Technologies	P36934	用于保护荧光染料
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36961	用于保护荧光染料
SylGard 182 硅胶弹性体套件	Dow Corning	产品编号：0001023934	用于制作解剖板
仪器
LSM780 共聚焦显微镜	Carl Zeiss	N/A	成像
Carl Zeiss 体视显微镜 Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila 解剖
AmScope 光纤双蛇形管显微镜照明器，150 W	AmScope	WBM99316	光源